Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de King Abdullah University of Science and Technology via Core funding en Competitive Research Award (CRG3) aan S. M. H.

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

In deze studie, verschillende smFRET technieken werden geïmplementeerd om te bepalen van de kinetiek van HJ resolutie door GEN130. Vergelijkbare smfret-benaderingen werden gebruikt om de DNA-conformationale eis en decolleté met dubbele flap te volgen door de DNA-replicatie en reparatie flap endonuclease 142,43,44. Hier worden kritieke stappen in dit protocol besproken. De silanisatie reactie moet vrij zijn van elk spoor van vochtigheid. De pegylation-oplossing moet snel worden toegepast op het gesilaniseerde glas zodra de PEG is opgelost om hydrolyse te voorkomen. In de meerkanaals stroomcel moet elke ingesloten lucht in de lijm plaat worden verwijderd om lekkage tussen naburige kanalen te voorkomen. De PCA-oplossing moet vers worden bereid, omdat het na verloop van tijd oxiderende. De toevoeging van 10 N NaOH moet dropwise zijn, met grondig daartussenin. De fluorescentie achtergrond in de dekslip moet minimaal zijn voordat het fluorescendig gelabelde HJ stroomt. De imaging in de stroomcel moet in één richting worden uitgevoerd om te voorkomen dat er gebleekte gebieden worden geblondeerd. Bij ALEX-experimenten moet de kracht van de rode laser worden verlaagd om snel bleken van de acceptor te voorkomen. In de time-lapse-experimenten moet de cyclustijd korter zijn dan de snelste gebeurtenis.
smFRET is een gevoelige techniek die waardevolle real-time inzichten in biomoleculaire reacties kan bieden. Deze methode heeft echter verschillende technische uitdagingen, waaronder het bereiken van meetbare verandering in FRET tijdens de biochemische reactie. Dit is nodig voor het verkrijgen van goed gescheiden functies in de histogrammen en te onderscheiden toestanden in de tijd-traces. In veel gevallen vereist smfret een zorgvuldig ontwerp van de substraten, de selectie van de de paren en hun posities, en de versterking van de fret veranderingen in het DNA substraat vanwege de kleine structurele veranderingen in het substraat45. Een andere benadering voor het uitvoeren van FRET is het gebruik van gelabelde eiwitten46. Het observatie venster in FRET wordt beperkt door de stabiliteit van de acceptor zoals Cy5 of Alexa Fluor 647 die de neiging heeft om sneller te bleken dan de donor (Cy3 in dit geval). Daarom vereist fret een continue zoektocht naar stabiele fluor Foren om de duur van het experiment te verlengen en de inspanningen om zuurstof opruimings systemen te ontwikkelen om het fluorescentie signaal te verlengen en de signaal-ruis verhouding te maximaliseren47,48 .
Een van de tips voor het oplossen van problemen in smFRET is het balanceren van de verschillende parameters die betrokken zijn bij beeldvorming, zoals het Laser vermogen, de belichtingstijd, de cyclusduur en het aantal cycli om de fluorescentie-emissie te maximaliseren, het experiment te verlengen en passende bemonsterings intervallen voor de enzym dynamiek. Langere observatie tijden en minimale effecten van foto bleken zijn essentieel voor het verkrijgen van hooggetrouwheids dwelltijd verdelingen die de enzym dynamiek vertegenwoordigen. ALEX genereert betere histogrammen, omdat deze methode wordt onderworpen aan lagere bijdragen van fotogebleekte deeltjes in vergelijking met single-Color FRET. De tijdelijke resolutie in ALEX is echter lager dan die in single-Color FRET.
Tot slot, de nadruk die smFRET legt op het opsporen van conformationale/structurele veranderingen in individuele moleculen in real-time overbrugt de kloof tussen hoge resolutie structurele technieken (d.w.z. Röntgen kristallografie, nucleaire magnetische resonantie, elektronenmicroscopie), dat voorziet in atomaire resolutie structurele details onder statische omstandigheden en bulk methoden die het ensemble gemiddelde van een meetbare eigenschap opleveren. In veel opzichten heeft smFRET bewezen een krachtige techniek te zijn om in real-time biologische systemen te bestuderen.

Enkelvoudige molecuul methoden op basis van fluorescentiedetectie zorgen voor hoge signaal-ruis verhoudingen1. FRET is een spectroscopische techniek die afstanden in het bereik van 1 – 10 nm kan meten, waardoor deze techniek als moleculaire heerser voor het meten van afstanden in het nanometer bereik2,3wordt weergeven. Het absorptiespectrum van de acceptor heeft een gedeeltelijke spectrale overlap met het emissiespectrum van de donor op het kortere golflengte uiteinde. FRET wordt gemedieerd door de door straling minder energie overdracht tussen een donor-en acceptor-paar, terwijl de efficiëntie van de energie overdracht afhankelijk is van de afstand en de oriëntatie van de acceptor4.
Er zijn verschillende benaderingen geïmplementeerd om de achtergrond te minimaliseren en de detectie-efficiëntie van het fluorescentie signaal5,6te verbeteren. Een benadering is confocale microscopie, waarbij een pinhole de excitatie vlek beperkt tot een grootte onder de diffractie-limiet7. Een andere benadering is de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF), een breedveld verlichtingstechniek waarbij het licht uit de as boven een kritische hoek8wordt geleid. Het licht wordt dan volledig intern weerspiegeld op het raakvlak tussen de glas-en waterige oplossing, waardoor een evanescerende Golf wordt gegenereerd die alleen de op het glasoppervlak bevestigde fluor stralen verlicht en achtergrond van de fluor in de rest van de oplossing.
Bij confocale microscopie kunnen de moleculen vrij worden verspreid of geïmmobiliseerd oppervlak. De bereikte tijdelijke resolutie kan worden binnen microseconden tot enkele milliseconden9. De confocale detectie voor een enkel molecuul wordt uitgevoerd door Single-Photon Avalanche diode (SPAD) en Point-by-Point scanning van de regio van belang10. In TIRF wordt een tijdreeks van enkele honderden moleculen geïmmobiliseerd op het oppervlak opgenomen door een positie gevoelige tweedimensionale lading gekoppelde detector (CCD). De CCD versterkt het fluorescentie signaal door geïntensiveerd fosfor scherm en Microchannel plaat of op-chip vermenigvuldiging van photoelek tronen (EMCCD). De tijdelijke resolutie is afhankelijk van de uitlezen snelheid en de kwantum efficiëntie van de CCD en meestal op volgorde van enkele tientallen milliseconden6.
HJ is een centrale intermediair in DNA reparatie en recombinatie11,12,13,14. HJ heeft twee doorlopende en twee kruisende strengen die verbinding maken tussen de doorlopende strengen zonder elkaar te snijden. HJ bestaat in oplossing als X-gestapelde conformers, die continue isomerisatie ondergaan door de doorlopende strengen die kruisingen worden en de kruisende strengen continu worden in de andere conformer15. Isomeer voorkeur van de HJ is afhankelijk van de kern sequentie en Ionische omgeving en is uitgebreid bestudeerd door fret16,17,18,19.
GEN120 is een monomere proteïne in oplossing21 en vereist door dimerisatie te klieven de HJ, waardoor de juiste scheiding van de gerecombineerde strengen22,23. De stapelen conformer voorkeur van de HJ beïnvloedt de uitkomst van genetische recombinatie door het instellen van de oriëntatie van de resolutie door de HJ resolvazen24. Begrijpen hoe GEN1 bindt de HJ, coördineert de twee incisies, en zorgt ervoor dat de volledige resolutie zijn allemaal onder intensieve studie21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
In deze studie wordt een objectief gebaseerde TIRF-opstelling gebruikt zoals eerder beschreven31. Twee kleuren alternerende excitatie (Alex) wordt toegepast om te bepalen van de conformationele veranderingen op de interactie van GEN1 met de gelabeld HJ. Alex produceert 2D histogrammen op basis van twee ratiometrische parameters fret efficiency E, dat is donor-acceptor distance-afhankelijke, en de stoichiometrie parameter S, die meet de donor-acceptor stoichiometrie32. ALEX maakt het sorteren van fluorescerende soorten mogelijk op basis van de stoichiometrieën van de fluor Foren, inclusief alleen donor-, acceptor-en gemengde subpopulaties. Alex kan het gebruik van fret uitbreiden naar het volledige bereik en kan verschillen in de-helderheid en oligomerisatie detecteren, evenals macromoleculaire-ligand-interacties controleren33.
Het is gevonden dat GEN1 consistent slaagt in het oplossen van de HJ binnen de levensduur van de GEN1-HJ complex. De tijdsafhankelijke conformationele veranderingen zijn afgeleid van de tijd-sporen van individuele moleculen, terwijl de histogrammen de verdeling van de onderliggende populaties vertegenwoordigen. Met behulp van time-lapse single-Color FRET, snelle on-rates en trage tarieven voor de GEN1 dimeer worden gedemonstreerd, die de affiniteit van de geassembleerde GEN1 dimeer bij de eerste incisie product te verhogen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

Bulk methodes meten het ensemble gedrag van moleculen, waarbij de individuele reactiepercentages van de onderliggende stappen gemiddeld zijn in de gehele populatie. Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) biedt een opname van de conformationele veranderingen die door individuele moleculen in real-time plaatsvinden. Daarom is smFRET krachtig in het meten van structurele veranderingen in het enzym of substraat tijdens binding en katalyse. Dit werk presenteert een protocol voor single-molecuul beeldvorming van de interactie van een vierweg Holliday Junction (HJ) en gap endonuclease I (GEN1), een cytosolische homologe recombinatie enzym. Ook gepresenteerd zijn single-Color en twee-Color afwisselend excitatie (ALEX) smFRET experimentele protocollen te volgen van de resolutie van de HJ door GEN1 in real-time. De kinetiek van GEN1 door dimerisatie worden bepaald bij de HJ, die is gesuggereerd om een sleutelrol te spelen in de resolutie van de HJ en is ongrijpbaar gebleven tot nu toe. De hier beschreven technieken kunnen op grote schaal worden toegepast om waardevolle mechanistische inzichten van veel enzym-DNA-systemen te verkrijgen.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Gepresenteerd hier is een protocol voor het uitvoeren van single-molecuul Förster resonantie energie overdracht te bestuderen HJ resolutie. Voor het bepalen van de dissociatieconstanten wordt tweekleurige alternerende excitatie gebruikt. Single-Color timelapse smFRET wordt vervolgens toegepast in real-time decolleté assays om de dwelltijd verdeling vóór HJ resolutie te verkrijgen.

Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Dit protocol stelt ons in staat om de interactiedynamiek en de resolutie van de Holliday-verbinding te monitoren door flap endonuclease 1 op het niveau van één molecuul en andere enzymatische systemen. Nou, sommigen zullen gemiddeld in de hele moleculaire bevolking of beveiligt de onderliggende individuele mechanistische stappen en er is. Single molecule methoden bieden deze details door het toezicht op de real-time gedrag van individuele moleculen.Single molecule methoden kunnen efficiënt detecteren biomoleculaire interacties in de pico en nanomolar bereik met een hoge specificiteit. Dat is handig voor veel praktische oplossingen in diagnostiek, genoomsequencing en sensing. Optische en gedwongen meten single-molecule methoden worden op grote schaal toegepast in de natuurkunde, chemie en biologie en zijn bewezen dat nobele waarnemingen die ontoegankelijk zijn door andere methoden te bieden.Mijn advies aan de eerste keer gebruikers is om nauw te volgen de gedetailleerde stappen die in dit protocol. Visuele illustraties van de hands-on procedure van dit protocol zullen leiden tot een succesvolle implementatie van de techniek. Om de single channel flow cell voor te bereiden, begin met het boren van twee gaten met een diameter van 1,22 millimeter in het middelste deel van een kwartsdia van 50 bij 20 millimeter met de centra 37 millimeter uit elkaar en 6,5 millimeter van de rand van de glijbaan.Gebruik een elektronische frees om een kanaal van 41 bij 2,25 millimeter in een stuk van 50 bij 20 millimeter van een dubbele plakplaat te snijden en de kunststof kant van de beschermhoes af te pellen. Lijn de randen van het stuk uit met de randen van de kwartsschuif en gebruik een paar polytetrafluorethyleen pincet om eventuele gevangen luchtbellen voorzichtig te verwijderen. Pel de papierzijde van het lijmstuk af en monteer het stuk op het gefunctionaliseerde oppervlak van een afdeksel.Snijd vervolgens een stuk polyethyleenbuizen met een inwendige diameter van 1,22 millimeter tot een lengte van 11 centimeter voor de inlaat en een stuk buizen tot 25 centimeter voor de uitlaat. Steek vervolgens de buizen in de eerder geboorde gaten als de inlaat- en uitlaatbuizen voor de stroomcel. En gebruik vijf minuten epoxylijm om de randen van de kwartsdekslipinterface in de inlaat- en uitlaatbuizen te verzegelen.Wanneer de cel is gedroogd, gebruik dan een 1 millimeter spuit te spoelen 0,2 micrometer gefilterd 0,03 milligram per milliliter concentratie avidin in PBS in de cel met behulp van een tweede spuit gevuld met buffer alleen uit te wassen eventuele overtollige avidin aan het einde van de overvloed. Om een fret-experiment met één kleur uit te voeren, breng u eerst één druppel onderdompelingsolie aan op een 100 keer totale interne reflectiefluorescentiedoelstelling en stelt u de vermenigvuldiging van foto-elektronezen op een geschikte versterking in om het signaal naar de achtergrond te optimaliseren en verzadiging te voorkomen. Plaats de stroomcel voorzichtig op de monsterhouder en gebruik koersaanpassing om het doel geleidelijk te verhogen totdat de olie de afdeksel raakt.Schakel de laser van 532 nanometer in en schakel over op de fijne afstelmodus van de doelstelling. Richt de emissie naar de camerapoort om het beeld op de monitor te observeren en pas de hoogte van de doelstelling aan totdat het gefunctionaliseerde oppervlak van de afdeksel in beeld wordt gebracht en kan worden waargenomen op de monitor. Controleer of de achtergrond van het gefunctionaliseerde oppervlak van de afdekslips niet meer dan enkele plekken overschrijdt voordat u in het fluorescerende gelabelde HJ stroomt. Wanneer het systeem klaar is op 0,2 tot 0,5 microliter van het verdunde substraat van belang in 120 microliters van imaging buffer met zuurstof scavenging systeem in een 0,5 milliliter buis en sluit de uitlaat van de langzame cel op een spuitpomp.Steek de inlaatbuis in de buis van 1,5 milliliter en start de spuitpomp met een 30 tot 50 microliter per minuut om de oplossing uit de buis te halen. Vaak beeld het oppervlak kort met de groene laser om een goede dekking van de cel te bevestigen met 100 tot 300 deeltjes van homogeen verdeeld, goed gesprede substraat. Als het oppervlak van de stroomcel voldoende is afgedekt, spoel dan nog eens 120 microliter beeldbuffers met 30 tot 50 microliters per minuut om ongebonden HJ weg te spoelen en laat de stroomcel 5 minuten zitten zodat het zuurstofverschuifsysteem de opgeloste zuurstof kan uitputten.Stel de belichtingstijd in op ongeveer 60 milliseconden. De cyclustijd wordt automatisch ingesteld door de software op basis van de snelheid van gegevensoverdracht. Geef het gewenste aantal cycli of frames op tot ongeveer 400.De emissie van de donor en acceptorfluorofoforen worden opgesplitst in kleurkanalen door een beeldsplitterapparaat. Selecteer een geschikt gebied op het oppervlak, pas de hoogte van het doel aan om de afbeelding scherp te stellen en op te nemen en sla de film op in het tiff-formaat van 16 bits. Ga dan naar een nieuw gebied.Spoel de cel met 120 microliter imaging buffer aangevuld met de aangegeven concentraties gen1 op een 30 microliter per minuut stroomsnelheid, een concentratie per keer. In de resolutie van het HJ-decolleté-experiment past u de stroomsnelheid aan op 110 microliter per minuut en start u de opname 5 tot 10 seconden voor de ingang van het enzym in de stroomcel. de beeldvorming om te beginnen 5 tot 10 seconden voor de ingang van het enzym in de stroomcel zal het aantal gebeurtenissen te maximaliseren.Wanneer alle concentraties zijn getest, gebruik dan een vaste fluorescerende kraal dia om de donor en acceptor deeltjes in kaart te brengen aan elkaar in de afbeelding-splitsen apparaat. Na het installeren van het juiste softwarepakket om een transformatiematrix te genereren, opent u de opgenomen kraaldiafilm en selecteert u de posities van de afzonderlijke kralen in de donor- en acceptorkanalen. Wanneer de matrix is gegenereerd uit de vaste pareldia klikt u op TFORM laden en selecteert u het transformatiematrixbestand.Klik in het vervolgkeuzemenu kanaalfilter op de optie D&A om te selecteren op deeltjes met een label met zowel de donor als de acceptor. Voer vervolgens plotTimetraceCW in zoals geïnstrueerd in de handleiding om de tijdsporen voor elk molecuul te genereren. Om een ALEX FRET-experiment uit te voeren, neemt u een film op die bestaat uit opeenvolgende frames van donor- en acceptor-emissies door directe excitaties met de groene en rode lasers.Open de verworven ALEX-films en stel de geschikte detectiedrempel in op ongeveer 300 voor elk van de donoremissie als gevolg van donorexcitatie, acceptatie of emissie als gevolg van donorexcitatie en acceptor-emissie als gevolg van de directe excitatiekanalen. Pas de juiste kanaalfilters toe om te selecteren voor de deeltjes die zowel donor als acceptor zijn geweest en koppel 200 tot 300 deeltjes in elk van de drie kanalen. Gebruik de plotHistALEX MATLAB-code om ALEX histogrammen te genereren die verschillende pieken in de functies van het histogram passen en gebruik een geschikt grafiek- en analyseprogramma om het percentage van het gebied onder de curve voor elke populatie te bepalen.Gebruik vervolgens de plotTimetraceALEX MATLAB-code om een tijdstracering te genereren voor elk molecuul dat de donoremissie laat zien door de directe excitatie in de acceptor-emissies als gevolg van de FRET en de directe opwinding. Deze representatieve afwisselende excitatie FRET histogram van aangrenzend label X-0 toont twee pieken die overeenkomen met het uitwisselen van de meer overvloedige en minder overvloedige isomeren. De isomerisatie tarieven verkregen uit de Dwell tijd histogrammen van de isomeren is in overeenstemming met die eerder gemeld.Single molecule FRET histogrammen van het aangrenzende label X-0 knooppunt op verschillende GEN1 concentraties verworven door ALEX, onthullen een piek die overeenkomt met de vrije hoge FRET isomer en een piek die overeenkomt met de gebonden HJ-populatie na aftrek van de bijdrage van de minder overvloedige isomer van de lage FRET piek. Bij een verzadigende GEN1-concentratie heeft het FRET-histogram van X-0 slechts één enkele lage FRET-piek die overeenkomt met GEN1, gebonden aan een van beide isomer van de HJ, zoals voorspeld door het model. De binding van GEN1 monomeer aan de HJ gevolgd door dimervorming is een uniek kenmerk van de eukaryotische HJ resolvase GEN1 in vergelijking met prokaryotische resolvasen die in dimeric vorm in oplossing bestaan.Verder bewijs dat GEN1 monomeer bindt en vervormt de HJ is de observatie van een aanzienlijk aantal sporen van oomverwekte deeltjes met een stabiele lage FRET-toestand in aanwezigheid van magnesium bij lage GEN1-concentraties. Het gelijktijdige vertrek van de donor en acceptor na een stabiele lage FRET-toestand in sporen van opgeloste X-0 die optreedt zonder het ontstaan van een tussenpersoon geeft aan dat een volledige oplossing optreedt binnen de levensduur van het GEN1 HJ-complex. Merk op dat de achtergrond van het gefunctionaliseerde glasoppervlak niet meer dan een paar plekken mag zijn en dat gelijkmatig verdeelde deeltjes essentieel zijn voor het verkrijgen van goede resultaten.Gebruik altijd persoonlijke beschermingsmiddelen en een rookkap tijdens het voorbereiden van de serialisatiefoto. Zorg ervoor dat u een beschermende bril te dragen die specifiek is voor de golflengten bij het werken met lasers. Andere methoden zoals cryo ap, nucleaire magnetische resonantie, kan atomair niveau structurele details.Deze informatie is integraal onderdeel van het ontwerp en de interpretatie van de enkelmolecuul FRET experimenten. Single molecule FRET opent nieuwe opvattingen op het gebied van DNA-replicatie wat resulteert in een dieper begrip van de mechanismen van acties helicases en nucleases.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...