Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
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Ce travail a été soutenu par l'Université des sciences et de la technologie king Abdullah par le biais d'un financement de base et d'un prix de recherche concurrentiel (CRG3) à S. M. H.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Dans cette étude, différentes techniques smFRET ont été mises en œuvre pour déterminer la cinétique de la résolution HJ par GEN130. Des approches smFRET similaires ont été utilisées pour suivre l'exigence conformationnelle de l'ADN à double volet et le clivage par la réplication de l'ADN et la réparation des volets endonuclease 142,43,44. Ici, les étapes critiques de ce protocole sont discutées. La réaction de silanisation doit être exempte de toute trace d'humidité. La solution de pegylation doit être appliquée rapidement sur le verre silanisé une fois que LE PEG est dissous pour éviter l'hydrolyse. Dans la cellule d'écoulement multicanal, tout air emprisonné dans la feuille adhésive doit être enlevé pour éviter les fuites entre les canaux voisins. La solution PCA doit être fraîchement préparée car elle s'oxyde au fil du temps. L'ajout de 10 N NaOH doit être dropwise, avec vortexing entre les deux. L'arrière-plan de fluorescence dans le coverslip devrait être minimal avant de couler le HJ fluorescent. L'imagerie dans la cellule d'écoulement doit être effectuée dans une direction pour éviter l'imagerie des zones blanchies. Dans les expériences ALEX, la puissance du laser rouge devrait être réduite pour éviter le blanchiment rapide de l'accepteur. Dans les expériences en time-lapse, le temps de cycle doit être plus court que l'événement le plus rapide.
smFRET est une technique sensible qui peut fournir des informations précieuses en temps réel dans les réactions biomoléculaires. Cependant, cette méthode a plusieurs défis techniques, parmi lesquels est d'atteindre un changement mesurable dans FRET au cours de la réaction biochimique. Ceci est nécessaire pour obtenir des caractéristiques bien séparées dans les histogrammes et les états distinguables dans les traces temporelles. Dans de nombreux cas, smFRET nécessite une conception soigneuse des substrats, la sélection des paires de fluorophore et leurs positions, et l'amplification des changements fret dans le substrat d'ADN en raison des petits changements structurels dans le substrat45. Une autre approche pour effectuer FRET est d'utiliser des protéines étiquetées46. La fenêtre d'observation dans FRET est limitée par la stabilité de l'accepteur comme Cy5 ou Alexa Fluor 647 qui tend à blanchir plus rapidement que le donneur (Cy3 dans ce cas). Par conséquent, FRET nécessite une recherche continue de fluorophores stables pour prolonger la durée de l'expérience et les efforts visant à développer des systèmes de récupération d'oxygène pour prolonger le signal de fluorescence et maximiser le rapport signal-bruit47,48 .
Parmi les conseils pour le dépannage dans smFRET est d'équilibrer les plusieurs paramètres impliqués dans l'imagerie tels que la puissance laser, temps d'exposition, temps de cycle, et le nombre de cycles pour maximiser l'émission de fluorescence, prolonger la durée de l'expérience, et atteindre intervalles d'échantillonnage appropriés pour la dynamique enzymatique. Des temps d'observation plus longs et des effets minimes du photoblanchiment sont essentiels pour obtenir des distributions de temps de séjour de haute fidélité qui représentent la dynamique enzymatique. ALEX génère de meilleurs histogrammes puisque cette méthode est soumise à des contributions plus faibles à partir de particules photoblanchies par rapport à fret monocolore. Cependant, la résolution temporelle dans ALEX est inférieure à celle de fret unicolore.
Enfin, l'accent mis par smFRET sur la détection des changements conformationnels/structurels dans les molécules individuelles en temps réel comble l'écart entre les techniques structurelles à haute résolution (c.-à-d. la cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire, la microscopie électronique), qui fournit des détails structurels de résolution atomique dans des conditions statiques et des méthodes en vrac qui donnent la moyenne d'ensemble d'une propriété mesurable. À bien des égards, smFRET s'est avéré être une technique puissante pour étudier les systèmes biologiques en temps réel.

Les méthodes monomolécules basées sur la détection de la fluorescence fournissent des rapports signal-bruit élevés1. FRET est une technique spectroscopique qui peut mesurer des distances dans la gamme de 1 à 10 nm, rendant cette technique comme une règle moléculaire pour mesurer les distances dans la gamme nanométrique2,3. Le spectre d'absorption de l'accepteur a un chevauchement spectral partiel avec le spectre d'émission du donneur à l'extrémité de longueur d'onde plus courte. FRET est médiatisé par le transfert d'énergie sans rayonnement entre un donneur et une paire d'accepteurs, alors que l'efficacité du transfert d'énergie dépend de la distance et de l'orientation de l'accepteur4.
Plusieurs approches ont été mises en œuvre pour minimiser l'arrière-plan et améliorer l'efficacité de détection du signal de fluorescence5,6. Une approche est la microscopie confocale, dans laquelle un sténopé limite la tache d'excitation à une taille inférieure à la limite de diffraction7. Une autre approche est la fluorescence interne totale de réflexion (TIRF), qui est une technique d'éclairage de large champ dans laquelle la lumière est dirigée hors-axe au-dessus d'un angle critique8. La lumière est alors totalement réfléchie à l'interface entre le verre et la solution aqueuse, générant une onde évanescente qui n'éclaire que les fluorophores attachés à la surface de verre et empêche l'arrière-plan des fluorophores dans le reste de la solution.
Dans la microscopie confocale, les molécules peuvent être soit librement diffuses, soit immobiliser sémunisation en surface. La résolution temporelle atteinte peut être en quelques microsecondes à plusieurs millisecondes9. La détection confocale d'une seule molécule est effectuée par diode avalanche monophoton (SPAD) et balayage point par point de la région d'intérêt10. Dans TIRF, une série chronologique de quelques centaines de molécules immobilisées à la surface est enregistrée par un détecteur couplé de charge bidimensionnel sensible à la position (CCD). Le CCD amplifie le signal de fluorescence soit par un écran de phosphore intensifié et une plaque microcanal, soit par une multiplication des photoélectrons (EMCCD). La résolution temporelle dépend de la vitesse de lecture et de l'efficacité quantique du CCD et généralement de l'ordre de quelques dizaines de millisecondes6.
HJ est un intermédiaire central dans la réparation et la recombinaison d'ADN11,12,13,14. HJ a deux brins continus et deux brins de croisement qui se connectent entre les brins continus sans se croiser. HJ existe en solution comme les conformateurs X-empilés, qui subissent l'iogérisation continue par les brins continus devenant la traversée et les brins de croisement devenant continus dans l'autre conformateur15. Isomer préférence du HJ dépend de la séquence de base et de l'environnement ionique et a été largement étudié par FRET16,17,18,19.
GEN120 est une protéine monomérique dans la solution21 et nécessite une dimerisation pour couper le HJ, permettant ainsi une séparation appropriée des brins recombinés22,23. La préférence d'empilement de conformiste du HJ influence le résultat de la recombinaison génétique en fixant l'orientation de la résolution par les résolutionsHJ 24. Comprendre comment GEN1 lie le HJ, coordonne les deux incisions, et s'assure que sa pleine résolution ont tous fait l'objet d'une étude intensive21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
Dans cette étude, une mise en place tirf basée sur l'objectif est utilisée comme décrit précédemment31. L'excitation alternée de deux couleurs (ALEX) est appliquée pour déterminer les changements conformationnels sur l'interaction de GEN1 avec le fluorophore étiqueté HJ. ALEX produit des histogrammes 2D basés sur deux paramètres ratiométriques FRET efficacité E, qui est dépendant de la distance donneur-accepteur, et le paramètre stoichiométrie S, qui mesure la stoichiométrie donneur-accepteur32. ALEX permet le tri des espèces fluorescentes en fonction des stoichiométries des fluorophores, y compris les sous-populations mixtes, les donneurs seulement, les accepteurs et les sous-populations mixtes. ALEX peut étendre l'utilisation de FRET à la gamme complète et peut détecter des différences dans la luminosité et l'oligomerisation de fluorophore aussi bien que surveiller des interactions macromolécule-ligand33.
Il est constaté que GEN1 réussit constamment à résoudre le HJ dans la durée de vie du complexe GEN1-HJ. Les changements conformationnels dépendants du temps sont dérivés des traces temporelles des molécules individuelles, tandis que les histogrammes représentent la distribution des populations sous-jacentes. L'utilisation du FRET monocolore en time-lapse, des taux d'arrêt rapides et des débits lents pour le dimère GEN1 sont démontrés, ce qui augmente l'affinité du dimère GEN1 assemblé au premier produit d'incision.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

Les méthodes en vrac mesurent le comportement d'ensemble des molécules, dans lequel les taux de réaction individuels des étapes sous-jacentes sont moyens dans toute la population. Le transfert d'énergie de résonance de la seule molécule (smFRET) fournit un enregistrement des changements conformationnels qui se produisent par des molécules individuelles en temps réel. Par conséquent, smFRET est puissant dans la mesure des changements structurels dans l'enzyme ou le substrat pendant la liaison et la catalyse. Ce travail présente un protocole pour l'imagerie monomolécule de l'interaction d'une jonction holliday à quatre voies (HJ) et de l'endonuclease I d'écart (GEN1), une enzyme de recombinaison homologolique cytosolique. Sont également présentés des protocoles expérimentaux d'excitation alternée unicolore et bicolore (ALEX) smFRET pour suivre la résolution du HJ par GEN1 en temps réel. La cinétique de la dimerisation GEN1 est déterminée au HJ, qui a été suggéré de jouer un rôle clé dans la résolution du HJ et est resté insaisissable jusqu'à présent. Les techniques décrites ici peuvent être largement appliquées pour obtenir des idées mécanistes précieuses de nombreux systèmes d'ADN-enzyme.

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Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Présenté ici est un protocole pour effectuer un transfert d'énergie de résonance de résonance de F'rster à l'étude de la résolution de HJ. L'excitation alternée bicolore est utilisée pour déterminer les constantes de dissociation. Un seul temps de temps smFRET est ensuite appliqué dans les essais de clivage en temps réel pour obtenir la distribution de temps d'arrêt avant la résolution HJ.

Méthodes de transfert d'énergie par résonance à molécule unique pour l'étude en temps réel de la résolution de jonction Holliday par GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Ce protocole nous permet de surveiller la dynamique d’interaction et la résolution de la jonction Holliday par rabat endonuclease 1 au niveau d’une molécule unique et d’autres systèmes enzymatiques. Eh bien, certains seront en moyenne dans toute la population moléculaire ou sécurise les étapes mécanistes individuelles sous-jacentes et il ya. Les méthodes à molécule unique fournissent ces détails en surveillant le comportement en temps réel des molécules individuelles.Les méthodes à molécule unique peuvent détecter efficacement les interactions biomoléculaires dans la gamme pico et nanomolaire avec une grande spécificité. Ce qui est pratique pour de nombreuses solutions pratiques dans le diagnostic, le séquençage du génome et la détection. Les méthodes optiques et forcées de mesure à molécule unique sont largement appliquées en physique, chimie et biologie et sont prouvées pour fournir des observations nobles qui sont inaccessibles par d’autres méthodes.Mon conseil aux utilisateurs pour la première fois est de suivre de près les étapes détaillées énoncées dans ce protocole. Les illustrations visuelles de la procédure pratique de ce protocole mèneront à la mise en œuvre réussie de la technique. Pour préparer la cellule d’écoulement d’un seul canal, commencez par percer deux trous de 1,22 millimètre de diamètre dans la partie centrale d’une glissière de quartz de 50 x 20 millimètres avec les centres à 37 millimètres l’un de l’autre et à 6,5 millimètres du bord de la glissière.Utilisez un coupeur électronique pour couper un canal de 41 par 2,25 millimètres dans un morceau de 50 x 20 millimètres d’une double feuille d’adhésif et décoller le côté plastique du couvercle protecteur. Alignez les bords de la pièce avec les bords de la glissière de quartz et utilisez une paire de pinces à épiler en polytétrafluoroéthylène pour enlever délicatement les bulles d’air emprisonnées. Peler le côté papier de la pièce adhésive et monter la pièce sur la surface fonctionnalisée d’un glissement de couvercle.Ensuite, coupez un morceau de tube de polyéthylène d’un diamètre interne de 1,22 millimètre à une longueur de 11 centimètres pour l’entrée et un morceau de tube à 25 centimètres pour la sortie. Insérez ensuite les tubes dans les trous précédemment percés comme tubes d’entrée et de sortie pour la cellule d’écoulement. Et utilisez de la colle époxy de cinq minutes pour sceller les bords de l’interface de glissement de couvercle de quartz dans les tubes d’entrée et de sortie.Lorsque la cellule a séché, utilisez une seringue de 1 millimètre pour rincer 0,2 micromètre filtré 0,03 milligramme par avidine de concentration millilitre dans PBS dans la cellule à l’aide d’une deuxième seringue remplie de tampon seul pour laver tout excès d’avidine à la fin de la profusion. Pour effectuer une expérience FRET monocolore, appliquez d’abord une goutte d’huile d’immersion sur un objectif de fluorescence de réflexion interne 100 fois le total et réglez la multiplication sur puce des photoélectrons à un gain approprié pour optimiser le signal à l’arrière-plan et pour éviter la saturation. Placez soigneusement la cellule d’écoulement sur le support de l’échantillon et utilisez le réglage du cours pour augmenter graduellement l’objectif jusqu’à ce que l’huile touche le glissement de couvercle.Allumez le laser de 532 nanomètres et passez au mode d’ajustement fin de l’objectif. Dirigez l’émission vers le port de la caméra pour observer l’image sur le moniteur et ajuster la hauteur de l’objectif jusqu’à ce que la surface fonctionnalisée du glissement de couverture soit mise au point et puisse être observée sur le moniteur. Vérifiez que l’arrière-plan de la surface fonctionnalisée des glissements de couverture ne dépasse pas quelques taches avant de couler dans le HJ étiqueté fluorescent. Lorsque le système est prêt à 0,2 à 0,5 microlitres du substrat dilué d’intérêt dans 120 microlitres de tampon d’imagerie avec système de décature de l’oxygène dans un tube de 0,5 millilitre et connecter la sortie de la cellule lente à une pompe à seringues.Insérez le tube d’entrée dans le tube de 1,5 millilitre et démarrez la pompe à seringues à une minute de 30 à 50 microlitres pour retirer la solution du tube. Imagez fréquemment brièvement la surface avec le laser vert pour confirmer une bonne couverture de la cellule avec 100 à 300 particules de substrat homogènement distribué et bien espacé. Si la surface de la cellule d’écoulement est adéquatement couverte, rincer 120 autres microlitres de tampon d’imagerie à 30 à 50 microlitres par minute pour laver tout HJ non lié et permettre à la cellule d’écoulement de s’asseoir pendant 5 minutes pour permettre au système de scavaging d’oxygène d’épuiser l’oxygène dissous.Réglez le temps d’exposition à environ 60 millisecondes. Le temps de cycle sera automatiquement défini par le logiciel en fonction de la vitesse de transfert de données. Spécifiez le nombre désiré de cycles ou d’images à environ 400.L’émission du donneur et des fluorophores accepteurs sont divisées en canaux de couleur par un dispositif de splitter d’image. Sélectionnez une zone appropriée sur la surface, ajustez la hauteur de l’objectif pour concentrer l’image et enregistrer et enregistrer le film en format tiff 16 bits. Ensuite, déplacez-vous vers une nouvelle zone.Rincer la cellule avec 120 microlitres de tampon d’imagerie complétés par les concentrations indiquées de GEN1 à un débit de 30 microlitres par minute, une concentration à la fois. Dans la résolution de l’expérience de clivage HJ, ajuster le débit à 110 microlitres par minute et commencer l’enregistrement 5 à 10 secondes avant l’entrée de l’enzyme dans la cellule d’écoulement. l’imagerie pour commencer 5 à 10 secondes avant l’entrée de l’enzyme dans la cellule d’écoulement maximisera le nombre d’événements.Lorsque toutes les concentrations ont été testées, utilisez une perle fluorescente fixe pour cartographier les particules du donneur et de l’accepteur les unes aux autres dans le dispositif de fractionnement de l’image. Après avoir installé le logiciel approprié pour générer une matrice de transformation, ouvrez le film de diapositives de perles enregistré et sélectionnez les positions des perles individuelles dans les canaux donneur et accepteur. Lorsque la matrice a été générée à partir de la diapositive de perle fixe cliquez sur Charger TFORM et sélectionnez le fichier de matrice de transformation.Dans le menu de drop down du filtre de canal, cliquez sur l’option D&A pour sélectionner les particules étiquetées avec le donneur et l’accepteur. Ensuite, entrez plotTimetraceCW comme indiqué dans le manuel pour générer les traces de temps pour chaque molécule. Pour réaliser une expérience ALEX FRET, enregistrez un film composé d’images consécutives d’émissions de donneurs et d’accepteurs par des excitations directes avec les lasers verts et rouges.Ouvrez les films ALEX acquis et fixez le seuil de détection approprié à environ 300 pour chacune des émissions des donneurs en raison de l’excitation du donneur, de l’émission de l’accepteur due à l’excitation des donneurs et de l’émission d’accepteur en raison des canaux d’excitation directe. Appliquez les filtres de canal appropriés pour sélectionner les particules qui ont été à la fois donneur et accepteur et reliez 200 à 300 particules dans chacun des trois canaux. Utilisez le code MATLAB plotHistALEX pour générer des histogrammes ALEX correspondant à différents pics dans les fonctions de l’histogramme et utilisez un programme de graphique et d’analyse approprié pour déterminer le pourcentage de la zone sous la courbe pour chaque population.Utilisez ensuite le code MATLAB plotTimetraceALEX pour générer une trace de temps pour chaque molécule montrant l’émission du donneur par l’excitation directe dans les émissions de l’accepteur due au FRET et à l’excitation directe. Cet histogramme fret d’excitation alternant représentatif de l’étiquette adjacente X-0 montre deux pics qui correspondent à l’échange des isomères plus abondants et moins abondants. Les taux d’isomérisation obtenus à partir des histogrammes de temps de habit des isomères sont compatibles avec ceux rapportés précédemment.Les histogrammes fret à molécule unique de la jonction adjacente de l’étiquette X-0 à différentes concentrations GEN1 acquises par ALEX, révèlent un pic correspondant à l’isomer fret élevé libre et un pic correspondant à la population liée de HJ après avoir soustrait la contribution de l’isomer moins abondant du pic fret faible. À une concentration GEN1 saturante, l’histogramme fret de X-0 n’a qu’un seul pic fret faible correspondant à GEN1 lié à l’un ou l’autre isomer du HJ comme prévu par le modèle. La liaison du monomère GEN1 au HJ suivie de la formation de dimère est une caractéristique unique de la resolvase eucaryotique HJ GEN1 par rapport aux resolvases procaryotes qui existent sous forme dimérique en solution.D’autres preuves que gen1 monomère lie et déforme le HJ est l’observation d’un nombre important de traces de particules uncleaved avec un état stable faible FRET en présence de magnésium à de faibles concentrations GEN1. Le départ simultané du donneur et de l’accepteur après un état stable de fret faible dans les traces de X-0 résolu qui se produit sans l’émergence d’un intermédiaire indique qu’une résolution complète se produit dans la durée de vie du complexe GEN1 HJ. Notez que l’arrière-plan de la surface de verre fonctionnalisée ne doit pas dépasser quelques taches et que des particules réparties uniformément sont essentielles pour obtenir de bons résultats.Utilisez toujours de l’équipement de protection individuelle et une hotte de fumée tout en préparant l’image de sérialisation. Assurez-vous de porter des lunettes de protection spécifiques aux longueurs d’onde lorsque vous travaillez avec des lasers. D’autres méthodes telles que cryo ap, résonance magnétique nucléaire, peuvent fournir des détails structurels au niveau atomique.Ces informations font partie intégrante de la conception et de l’interprétation des expériences FRET à molécule unique. Fret molécule unique ouvrir de nouvelles vues dans le domaine de la réplication de l’ADN résultant en une meilleure compréhension des mécanismes des actions helicases et nucléases.

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Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse en temps réel du facteur de Transcription Binding, Transcription, traduction et chiffre d’affaires pour afficher des événements mondiaux au cours de l’Activation cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifier les mutations par fusion à haute résolution dans une population de riz de TILLING

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenoty the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii (en plus de la transformation, de l'édition du génome et du phénotypage de l'arbre tropical de Cannabaceae parasponia andersonii)

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer par CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...