Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
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Diese Arbeit wurde von der King Abdullah University of Science and Technology durch Kernfinanzierung und Competitive Research Award (CRG3) an S. M. H. unterstützt.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

In dieser Studie wurden verschiedene smFRET-Techniken implementiert, um die Kinetik der HJ-Auflösung durch GEN130zu bestimmen. Ähnliche smFRET-Ansätze wurden verwendet, um die Doppelklappen-DNA-Konformationsanforderung und Spaltung durch die DNA-Replikation und Reparaturklappe Endonuklease 142,43,44zu folgen. Hier werden wichtige Schritte in diesem Protokoll erläutert. Die Silanisierungsreaktion sollte frei von Feuchtigkeitseinspuren sein. Die Pegylierungslösung sollte schnell auf das silanisierte Glas aufgetragen werden, sobald PEG gelöst ist, um eine Hydrolyse zu vermeiden. In der Mehrkanal-Durchflusszelle sollte jede eingeschlossene Luft in der Klebefolie entfernt werden, um Leckagen zwischen benachbarten Kanälen zu vermeiden. Die PCA-Lösung sollte frisch zubereitet werden, da sie im Laufe der Zeit oxidiert. Die Zugabe von 10 N NaOH sollte tropfenweise sein, mit Wirbel zwischendurch. Der Fluoreszenzhintergrund im Deckblatt sollte minimal sein, bevor der fluoreszierend beschriftete HJ geflossen ist. Die Bildgebung in der Durchflusszelle sollte in eine Richtung durchgeführt werden, um bildgebende gebleichte Bereiche zu vermeiden. In ALEX-Experimenten sollte die Leistung des roten Lasers reduziert werden, um ein schnelles Bleichen des Akzeptors zu vermeiden. In den Zeitrafferexperimenten muss die Zykluszeit kürzer sein als das schnellste Ereignis.
smFRET ist eine empfindliche Technik, die wertvolle Echtzeit-Einblicke in biomolekulare Reaktionen liefern kann. Diese Methode hat jedoch mehrere technische Herausforderungen, darunter die Erzielung einer messbaren Veränderung des FRET während der biochemischen Reaktion. Dies ist notwendig, um gut getrennte Merkmale in den Histogrammen und unterscheidbare Zustände in den Zeitspuren zu erhalten. In vielen Fällen erfordert smFRET eine sorgfältige Auslegung der Substrate, die Auswahl der Fluorophorpaare und ihrer Positionen sowie die Verstärkung von FRET-Änderungen im DNA-Substrat aufgrund der geringen strukturellen Veränderungen im Substrat45. Ein weiterer Ansatz für die Durchführung von FRET ist die Verwendung von markierten Proteinen46. Das Beobachtungsfenster in FRET wird durch die Stabilität des Akzeptors wie Cy5 oder Alexa Fluor 647 begrenzt, die tendenziell schneller bleicht als der Spender (in diesem Fall Cy3). Daher erfordert FRET eine kontinuierliche Suche nach stabilen Fluorophoren, um die Versuchsdauer zu verlängern und Anstrengungen zur Entwicklung von Sauerstoff-Aufräumsystemen zu unternehmen, um das Fluoreszenzsignal zu verlängern und das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren47,48 .
Zu den Tipps für die Fehlerbehebung in smFRET gehört das Ausbalancieren der verschiedenen Parameter, die an der Bildgebung beteiligt sind, wie z. B. Laserleistung, Belichtungszeit, Zykluszeit und Anzahl der Zyklen, um die Fluoreszenzemission zu maximieren, die Versuchsdauer zu verlängern und geeignete Abtastintervalle für die Enzymdynamik. Längere Beobachtungszeiten und minimale Effekte durch Photobleichungen sind unerlässlich, um eine hohe Treue zu erhalten, um Zeitverteilungen zu erhalten, die die Enzymdynamik darstellen. ALEX erzeugt bessere Histogramme, da diese Methode niedrigeren Beiträgen von photobleached Partikeln im Vergleich zu einfarbigen FRET ausgesetzt ist. Die zeitliche Auflösung in ALEX ist jedoch niedriger als die im einfarbigen FRET.
Schließlich überbrückt smFRETs Schwerpunkt auf dem Nachweis von konformen/strukturellen Veränderungen einzelner Moleküle in Echtzeit die Lücke zwischen hochauflösenden Strukturtechniken (z. B. Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz, Elektronenmikroskopie), die atomare Auflösung strukturelle Details unter statischen Bedingungen und Bulk-Methoden, die das Ensemble Durchschnitt einer messbaren Eigenschaft ergeben. In vielerlei Hinsicht hat sich smFRET als eine leistungsfähige Technik zur Erforschung biologischer Systeme in Echtzeit erwiesen.

Einzelmolekül-Methoden auf Basis der Fluoreszenzdetektion bieten hohe Signal-Rausch-Verhältnisse1. FRET ist eine spektroskopische Technik, die Entfernungen im Bereich von 1–10 nm messen kann, wodurch diese Technik als molekulares Lineal zur Messung von Entfernungen im Nanometerbereich2,3dargestellt wird. Das Absorptionsspektrum des Akzeptors hat eine partielle spektrale Überlappung mit dem Emissionsspektrum des Spenders am kürzeren Wellenlängenende. FRET wird durch den strahlungsfreien Energietransfer zwischen Spender und Akzeptorpaar vermittelt, während die Effizienz der Energieübertragung von der Entfernung und Ausrichtung des Akzeptorsabhängt 4.
Mehrere Ansätze wurden implementiert, um den Hintergrund zu minimieren und die Detektionseffizienz des Fluoreszenzsignals5,6zu verbessern. Ein Ansatz ist die konfokale Mikroskopie, bei der ein Loch den Anregungspunkt auf eine Größe unterhalb der Beugungsgrenze7beschränkt. Ein weiterer Ansatz ist die totale interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF), eine Weitfeldbeleuchtungstechnik, bei der das Licht außerhalb der Achse über einen kritischen Winkel8gerichtet wird. Das Licht wird dann an der Schnittstelle zwischen Glas und wässriger Lösung vollständig nach innen reflektiert, wodurch eine evaneszente Welle entsteht, die nur die an der Glasoberfläche befestigten Fluorophore beleuchtet und den Hintergrund der Fluorophore im Rest der die Lösung.
In der konfokalen Mikroskopie können die Moleküle entweder frei diffundiert oder oberflächenimmobilisiert werden. Die erreichte zeitliche Auflösung kann innerhalb von Mikrosekunden bis zu mehreren Millisekunden9liegen. Der konfokale Nachweis für ein einzelnes Molekül erfolgt durch Einphotonenlawinendiode (SPAD) und Punkt-für-Punkt-Scannen des Interessenbereichs10. In TIRF wird eine Zeitreihe von einigen hundert Molekülen, die auf der Oberfläche immobilisiert sind, von einem positionsempfindlichen zweidimensionalen Ladungs-gekoppelten Detektor (CCD) aufgezeichnet. Das CCD verstärkt das Fluoreszenzsignal entweder durch verstärkte Phosphorsieb und Mikrokanalplatte oder on-chip-Multiplikation von Photoelektronen (EMCCD). Die zeitliche Auflösung ist abhängig von der Auslesegeschwindigkeit und Quanteneffizienz des CCD und in der Regel in der Größenordnung von wenigen Dutzend Millisekunden6.
HJ ist ein zentrales Zwischenprodukt in der DNA-Reparatur und -Rekombination11,12,13,14. HJ hat zwei durchgehende und zwei kreuzende Stränge, die sich zwischen den durchgehenden Strängen verbinden, ohne sich gegenseitig zu überschneiden. HJ existiert in Lösung als X-gestapelte Konformere, die durch die kontinuierlichen Stränge, die sich kreuzen und die Kreuzungsstränge in den anderen Konformerenkontinuierlich werden, kontinuierlichwerden 15 . Die Isomerpräferenz des HJ ist abhängig von der Kernsequenz und der ionischen Umgebung und wurde von FRET16,17,18,19ausgiebig untersucht.
GEN120 ist ein monomeres Protein in Lösung21 und erfordert eine Dimerisierung, um die HJ zu spalten, wodurch eine ordnungsgemäße Trennung der rekombinierten Stränge22,23ermöglicht wird. Die Stapelkonformerpräferenz des HJ beeinflusst das Ergebnis der genetischen Rekombination, indem die Ausrichtung der Auflösung durch die HJ-Resolvasen24gesetzt wird. Verstehen, wie GEN1 die HJ bindet, koordiniert die beiden Einschnitte und stellt sicher, dass seine volle Auflösung alle unter intensiver Studie21,22,23,25,26 wurden ,27,28,29,30.
In dieser Studie wird eine objektive TIRF-Einrichtung verwendet, wie zuvorbeschrieben 31. Zweifarbige Wechselanregung (ALEX) wird angewendet, um die konformen Veränderungen bei der Wechselwirkung von GEN1 mit Fluorophor mit der Bezeichnung HJ zu bestimmen. ALEX produziert 2D-Histogramme auf der Grundlage von zwei ratiometrischen Parametern FRET-Effizienz E, die spender-akzeptierweise distanzabhängig ist, und dem Stoichiometrieparameter S, der den Spender-Akzeptor-Stoichiometrie32misst. ALEX ermöglicht die Sortierung fluoreszierender Arten auf der Grundlage der Stoichiometrien der Fluorophore, einschließlich nur für Spender, nur für Akzeptoren und gemischte Subpopulationen. ALEX kann den Einsatz von FRET auf den gesamten Bereich ausdehnen und Unterschiede in der Fluorophorhelligkeit und Oligomerisierung erkennen sowie Makromolekül-Liganden-Wechselwirkungen überwachen33.
Es wird festgestellt, dass es GEN1 konsequent gelingt, die HJ innerhalb der Lebensdauer des GEN1-HJ-Komplexes zu lösen. Die zeitabhängigen Konformationsänderungen werden aus den Zeitspuren einzelner Moleküle abgeleitet, während die Histogramme die Verteilung der zugrunde liegenden Populationen darstellen. Mit dem zeitraffigen einfarbigen FRET werden schnelle Einschaltraten und langsame Off-Raten für den GEN1-Dimer demonstriert, die die Affinität des montierten GEN1-Dimers beim ersten Schnittprodukt erhöhen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

Massenmethoden messen das Ensembleverhalten von Molekülen, bei denen die individuellen Reaktionsraten der zugrunde liegenden Schritte in der gesamten Bevölkerung gemittelt werden. Die einmolekulare Förster-Resonanzenergieübertragung (smFRET) ermöglicht die Aufzeichnung der konformen Veränderungen, die von einzelnen Molekülen in Echtzeit stattfinden. Daher ist smFRET bei der Messung struktureller Veränderungen im Enzym oder Substrat während der Bindung und Katalyse leistungsfähig. Diese Arbeit stellt ein Protokoll zur Einzelmolekül-Bildgebung der Wechselwirkung einer Vier-Wege-Holliday-Kreuzung (HJ) und Spaltendonuklease I (GEN1), eines zytosolischen homologen Rekombinationsenzyms, vor. Ebenfalls vorgestellt werden einfarbige und zweifarbige abwechselnde Anregung (ALEX) smFRET Experimentelle Protokolle, um die Auflösung des HJ durch GEN1 in Echtzeit zu folgen. Die Kinetik der GEN1-Dimerisierung wird am HJ bestimmt, das eine Schlüsselrolle bei der Auflösung des HJ spielen soll und bis heute schwer fassbar ist. Die hier beschriebenen Techniken können weit verbreitet sein, um wertvolle mechanistische Erkenntnisse vieler Enzym-DNA-Systeme zu erhalten.

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Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung der einmolekularen Förster-Resonanzenergieübertragung zur Untersuchung der HJ-Auflösung vorgestellt. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wird eine zweifarbige Wechselanregung verwendet. Einfarbigezeitraffe smFRET wird dann in Echtzeit-Spaltungstests angewendet, um die Verweilzeitverteilung vor hj-Auflösung zu erhalten.

Ein-Molekül Förster Resonanz Energietransfermethoden für Die Echtzeit-Untersuchung der Holliday Junction Resolution von GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die Interaktionsdynamik und die Auflösung der Holliday-Kreuzung durch Klappenendonuklease 1 auf der Ebene des einzelnen Moleküls und anderen enzymatischen Systemen zu überwachen. Nun, einige werden mittelmittelisierenin in der gesamten molekularen Population oder sichert die zugrunde liegenden einzelnen mechanistischen Schritte und es gibt. Einzelne Molekülmethoden liefern diese Details, indem sie das Echtzeitverhalten einzelner Moleküle überwachen.Einzelmolekülmethoden können biomolekulare Wechselwirkungen im Pico- und Nanomolar-Bereich mit hoher Spezifität effizient detektieren. Was für viele praktische Lösungen in der Diagnostik, Genomsequenzierung und Sensorik praktisch ist. Optische und erzwungene Mess-Einzelmolekül-Methoden sind in Physik, Chemie und Biologie weit verbreitet und liefern nachweislich edle Beobachtungen, die durch andere Methoden unzugänglich sind.Mein Rat an Erstanwender ist, die detaillierten Schritte in diesem Protokoll genau zu befolgen. Visuelle Darstellungen des praktischen Verfahrens dieses Protokolls führen zu einer erfolgreichen Implementierung der Technik. Zur Vorbereitung der einkanaligen Durchflusszelle bohren Sie zunächst zwei Löcher mit einem Durchmesser von 1,22 Millimetern im mittleren Teil eines 50 mal 20 Millimeter großen Quarzschlittens mit den Mitten 37 Millimeter auseinander und 6,5 Millimeter vom Rand des Schlittens entfernt.Verwenden Sie einen elektronischen Fräser, um einen 41 mal 2,25 Millimeter großen Kanal in ein 50 mal 20 Millimeter großes Stück einer doppelten Klebefolie zu schneiden und die Kunststoffseite der Schutzhülle abzuschälen. Richten Sie die Ränder des Stückes an den Rändern des Quarzschlittens aus und verwenden Sie eine Pinzette aus Polytetrafluorethylen, um alle eingeschlossenen Luftblasen sanft zu entfernen. Ziehen Sie die Papierseite des Klebestücks ab und montieren Sie das Stück auf die funktionalisierte Oberfläche eines Deckelschlupfes.Als nächstes schneiden Sie ein Stück Polyethylenschläuche mit einem Innendurchmesser von 1,22 Millimetern auf eine Länge von 11 Zentimetern für den Einlass und ein Stück Schläuche auf 25 Zentimeter für den Auslass. Dann legen Sie die Rohre in die zuvor gebohrten Löcher als Ein- und Auslassrohre für die Durchflusszelle ein. Und verwenden Sie fünfminütigen Epoxidkleber, um die Kanten der Quarzabdeckungs-Beleg-Schnittstelle in den Ein- und Auslassrohren zu versiegeln.Wenn die Zelle getrocknet ist, verwenden Sie eine 1-Millimeter-Spritze, um 0,2 Mikrometer gefiltert 0,03 Milligramm pro Milliliter Konzentration Avidin in PBS in die Zelle mit einer zweiten Spritze gefüllt mit Puffer allein zu spülen, um überschüssiges Avidin am Ende der Profusion auszuwaschen. Um ein einfarbiges FRET-Experiment durchzuführen, wenden Sie zunächst einen Tropfen Tauchöl auf ein 100-faches gesamtes internes Reflexionsfluoreszenzziel auf und stellen sie die Aufschip-Multiplikation von Photoelektronen auf eine geeignete Verstärkung, um das Signal zum Hintergrund zu optimieren und Sättigung zu verhindern. Legen Sie die Durchflusszelle vorsichtig auf den Probenhalter, und verwenden Sie die Kurseinstellung, um das Ziel schrittweise anzuheben, bis das Öl den Deckelschlupf berührt.Schalten Sie den 532-Nanometer-Laser ein und wechseln Sie in den Feineinstellungsmodus des Objektivs. Richten Sie die Emission an den Kameraanschluss, um das Bild auf dem Monitor zu beobachten und die Höhe des Objektivs anzupassen, bis die funktionalisierte Oberfläche des Abdeckschlupfes in den Fokus gerückt wird und auf dem Monitor beobachtet werden kann. Stellen Sie fest, dass der Hintergrund der funktionalisierten Oberfläche der Abdeckungsrutschen einige Stellen nicht überschreitet, bevor Sie in die fluoreszierend markierte HJ fließen. Wenn das System bei 0,2 bis 0,5 Mikroliter des verdünnten Substrats von Interesse in 120 Mikroliter Bildgebungspuffer mit Sauerstoff-Aufräumsystem in einem 0,5-Milliliter-Rohr bereit ist und den Ausgang der langsamen Zelle mit einer Spritzenpumpe verbinden.Legen Sie das Einlassrohr in das 1,5-Milliliter-Rohr ein und starten Sie die Spritzenpumpe mit 30 bis 50 Mikroliter pro Minute, um die Lösung aus dem Rohr zu ziehen. Stellen Sie die Oberfläche häufig kurz mit dem grünen Laser ab, um eine gute Abdeckung der Zelle mit 100 bis 300 Partikeln homogen verteilten, gut verteilten Substrats zu bestätigen. Wenn die Durchflusszelloberfläche ausreichend abgedeckt ist, spülen Sie weitere 120 Mikroliter Bildgebungspuffer bei 30 bis 50 Mikroliter pro Minute, um ungebundene HJ wegzuwaschen und die Durchflusszelle 5 Minuten lang sitzen zu lassen, damit das Sauerstoff-Aufräumsystem den gelösten Sauerstoff erschöpft.Stellen Sie die Belichtungszeit auf ca. 60 Millisekunden ein. Die Zykluszeit wird von der Software automatisch basierend auf der Geschwindigkeit der Datenübertragung eingestellt. Geben Sie die gewünschte Anzahl von Zyklen oder Rahmen auf etwa 400 an.Die Emission von Spender- und Akzeptor-Fluorophoren wird durch ein Bildteilergerät in Farbkanäle aufgeteilt. Wählen Sie einen geeigneten Bereich auf der Oberfläche aus, passen Sie die Höhe des Ziels an, um das Bild zu fokussieren und aufzunehmen, und speichern Sie den Film im 16-Bit-Tiff-Format. Dann bewegen Sie sich in einen neuen Bereich.Spülen Sie die Zelle mit 120 Mikroliterbildpuffer, ergänzt mit den angegebenen Gen1-Konzentrationen bei einem Durchfluss von 30 Mikrolitern pro Minute, jeweils eine Konzentration. Passen Sie in der Auflösung des HJ-Spaltungsexperiments die Durchflussrate auf 110 Mikroliter pro Minute an und starten Sie die Aufzeichnung 5 bis 10 Sekunden vor dem Eintritt des Enzyms in die Durchflusszelle. Die Bildgebung, die 5 bis 10 Sekunden vor dem Eindringen des Enzyms in die Durchflusszelle beginnt, maximiert die Anzahl der Ereignisse.Wenn alle Konzentrationen getestet wurden, verwenden Sie eine feste fluoreszierende Perlenfolie, um die Spender- und Akzeptorpartikel einander in der Bildspaltvorrichtung zuzuordnen. Nach der Installation des entsprechenden Softwarepakets zur Generierung einer Transformationsmatrix öffnen Sie den aufgezeichneten Perlendiafilm und wählen Sie die Positionen der einzelnen Perlen in den Spender- und Akzeptorkanälen aus. Wenn die Matrix aus dem festen Perlenschieberegler generiert wurde, klicken Sie auf TFORM laden und wählen Sie die Transformationsmatrixdatei aus.Klicken Sie im Dropdown-Menü Kanalfilter auf die Option "D&A", um Partikel auszuwählen, die sowohl mit dem Spender als auch mit dem Akzeptor beschriftet sind. Geben Sie dann plotTimetraceCW ein, wie im Handbuch angewiesen, um die Zeitspuren für jedes Molekül zu generieren. Um ein ALEX FRET-Experiment durchzuführen, nehmen Sie einen Film auf, der aus aufeinanderfolgenden Frames von Spender- und Akzeptoremissionen durch direkte Anregungen mit den grünen und roten Lasern besteht.Öffnen Sie die erworbenen ALEX-Filme und legen Sie die geeignete Nachweisschwelle auf ca. 300 für jede Spenderemission aufgrund von Spenderanregung, Akzeptoremission aufgrund von Spendererregung und Akzeptanzemission aufgrund der direkten Erregungskanäle fest. Wenden Sie die entsprechenden Kanalfilter an, um für die Partikel auszuwählen, die sowohl Spender als auch Akzeptor waren, und verbinden Sie 200 bis 300 Partikel in jedem der drei Kanäle. Verwenden Sie den plotHistALEX MATLAB-Code, um ALEX-Histogramme zu generieren, die verschiedene Spitzen in den Funktionen des Histogramms anpassen, und verwenden Sie ein geeignetes Graphik- und Analyseprogramm, um den Prozentsatz der Fläche unter der Kurve für jede Grundgesamtheit zu bestimmen.Verwenden Sie dann den PlotTimetraceALEX MATLAB-Code, um eine Zeitspur für jedes Molekül zu erzeugen, das die Spenderemission durch die direkte Anregung in den Akzeptoremissionen durch das FRET und die direkte Anregung zeigt. Dieses repräsentative abwechselnde Anregungs-FRET-Histogramm des benachbarten Etiketts X-0 zeigt zwei Spitzen, die dem Wechsel der reichlicheren und weniger reichlich vorhandenen Isomere entsprechen. Die Isomerisierungsraten, die aus den Dwell-Zeit-Histogrammen der Isomere gewonnen wurden, stimmen mit den zuvor berichteten überein.Einzelne FRET-Histogramme der benachbarten Bezeichnung X-0-Kreuzung in verschiedenen GEN1-Konzentrationen, die von ALEX erworben wurden, zeigen einen Peak, der dem freien hohen FRET-Isomer entspricht, und einen Peak, der der gebundenen HJ-Population entspricht, nachdem der Beitrag des weniger reichlich vorhandenen Isomers vom niedrigen FRET-Peak subtrahiert wurde. Bei einer sättigenden GEN1-Konzentration hat das FRET-Histogramm von X-0 nur einen einzigen niedrigen FRET-Peak, der GEN1 entspricht, der entweder an Isomer des HJ gebunden ist, wie vom Modell vorhergesagt. Die Bindung von GEN1-Monomer an das HJ gefolgt von Dimer-Formation ist ein einzigartiges Merkmal der eukaryotischen HJ-Resolvase GEN1 im Vergleich zu prokaryotischen Resolvasen, die in dimerer Form in Lösung existieren.Ein weiterer Beweis dafür, dass GEN1-Monomer das HJ bindet und verzerrt, ist die Beobachtung einer signifikanten Anzahl von Spuren von uncleaved Partikeln mit einem stabilen niedrigen FRET-Zustand in Gegenwart von Magnesium bei niedrigen GEN1-Konzentrationen. Die gleichzeitige Abreise des Spenders und des Akzeptors nach einem stabilen niedrigen FRET-Zustand in Spuren von gelöstem X-0, die ohne das Entstehen eines Zwischenprodukts auftritt, weist darauf hin, dass eine vollständige Auflösung innerhalb der Lebensdauer des GEN1 HJ-Komplexes auftritt. Beachten Sie, dass der Hintergrund von der funktionalisierten Glasoberfläche einige Flecken nicht überschreiten sollte und dass gleichmäßig verteilte Partikel für gute Ergebnisse unerlässlich sind.Verwenden Sie immer persönliche Schutzausrüstung und eine Dunstabzugshaube bei der Vorbereitung des Serialisierungsbildes. Achten Sie darauf, bei der Arbeit mit Lasern eine Schutzbrille zu tragen, die spezifisch für die Wellenlängen ist. Andere Methoden wie Kryo ap, Kernspinresonanz, können strukturelle Details auf atomarer Ebene liefern.Diese Informationen sind integraler Bestandteil für die Konzeption und Interpretation der einzelnen MOLEKÜL-FRET-Experimente. Einzelmolekül FRET eröffnet neue Ansichten auf dem Gebiet der DNA-Replikation, was zu einem tieferen Verständnis der Mechanismen von Aktionen Helicases und Nukleasen führt.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Forschung

Genetik

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifizieren von Mutationen durch hochauflösendes Schmelzen in einer TILLING-Bevölkerung von Reis

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, GenomEditing und Phenotypisierung der Stickstoff-fixierenden tropischen Cannabaceae Baum Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...