Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת עבדאללה המלך של מדע וטכנולוגיה באמצעות מימון ליבה ופרס מחקר תחרותי (CRG3) ל-S. M. H.

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

במחקר זה, טכניקות smFRET שונים יושמו כדי לקבוע את הקינטיקה של הרזולוציה ג'ונסון על ידי GEN130. דומה הגישות smfret שימשו כדי לעקוב אחר לקפל דנ א התאמות דרישה והמחשוף על ידי שכפול ה-dna תיקון endonuclease 142,43,44. כאן, נדונים צעדים קריטיים בפרוטוקול זה. תגובת הסילניזציה צריכה להיות חופשית. מכל סימן של לחות הפתרון הפטאני צריך להיות מיושם במהירות על זכוכית silanized פעם יתד מומס כדי למנוע הידרוליזה. בתא הזרימה רב-הערוצים, יש להסיר את כל האוויר הנלכד בסדין הדביק כדי למנוע דליפה בין ערוצים שכנים. הפתרון PCA צריך להיות טרי מוכן מאז הוא מחמצן לאורך זמן. תוספת של 10 N NaOH צריך להיות dropwise, עם vortexing בין. הרקע הפלואורסצנטית ב coverslip צריך להיות מינימלי לפני הזרמת את התווית fluorescently מסומן. יש לבצע את ההדמיה בתא הזרימה בכיוון אחד כדי למנוע הדמיה של אזורים מולבן. בניסויים אלכס, את הכוח של הלייזר האדום צריך להיות מופחת כדי למנוע הלבנת מהירה של המאשר. בניסויים בזמן הקפיצה, זמן המחזור צריך להיות קצר יותר מהאירוע המהיר ביותר.
smFRET היא טכניקה רגיש שיכול לספק תובנות בזמן אמת יקר בתגובות ביוקולריות. עם זאת, לשיטה זו יש מספר אתגרים טכניים, ביניהם השגת שינוי מדיד ב-"סריג" במהלך התגובה הביוכימית. זה הכרחי כדי לקבל תכונות מופרדים היטב היסטגרמות ומדינות להבדיל בזמן עקבות. במקרים רבים, smFRET דורש עיצוב קפדני של מצעים, הבחירה של זוגות fluorophore ומיקומם, הגברה של שינויי שינויים במצע ה-DNA בגלל שינויים מבניים קטנים במצע45. גישה נוספת לביצוע השיטה היא להשתמש בחלבונים46. חלון התצפית בסריג מוגבל על ידי יציבות הקבלה כגון Cy5 או אלקסה Fluor 647 אשר נוטה להלבין במהירות רבה יותר מאשר התורם (Cy3 במקרה זה). לכן, מחייב חיפוש מתמשך של fluorophores יציבה כדי להאריך את משך הניסוי והמאמצים לפתח מערכות ניקוי חמצן כדי להאריך את האות הזריחה ולמקסם את היחס אות לרעש47,48 .
בין הטיפים לפתרון בעיות ב-smFRET הוא איזון מספר פרמטרים המעורבים הדמיה כגון כוח הלייזר, זמן חשיפה, זמן מחזור, ומספר מחזורים כדי למקסם את פליטת הזריחה, להאריך את משך הניסוי, ולהשיג רווחי דגימה מתאימים עבור דינמיקת האנזים. זמני התבוננות ארוכים יותר ואפקטים מינימליים של הלבנה הם חיוניים להשגת נאמנות גבוהה לשכון הפצות הזמן המייצגים את דינמיקת האנזים. אלכס מייצרת היסטגרמות טובות יותר מאז שיטה זו נתונה לתרומות נמוכות יותר מחלקיקים פוטומוקיים בהשוואה ללפרט בצבע אחד. עם זאת, הרזולוציה הטמפורלית ב-ALEX נמוכה יותר מאשר בתוך מפרט הצבע היחיד.
בסופו של דבר, הדגש של smFRET על גילוי קונפורתיות/שינויים מבניים במולקולות בודדות בגשרים בזמן אמת את הפער בין טכניקות מבניות ברזולוציה גבוהה (כלומר, קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית, מיקרוסקופ אלקטרוני), המספקת פרטים מבניים של רזולוציה אטומית תחת תנאים סטטיים ושיטות צובר המפיקות את ממוצע ההרכב של מאפיין מדיד. בהיבטים רבים, smFRET הוכיחה להיות טכניקה רבת עוצמה עבור לימוד מערכות ביולוגיות בזמן אמת.

שיטות חד-מולקולות המבוססות על זיהוי של קרינה פלואורסצנטית מספקות יחס גבוה של אות לרעש1. לדאוג היא טכניקה ספקטרוסקופית שיכולה למדוד מרחקים בטווח של 1 – 10 ננומטר, עיבוד טכניקה זו כסרגל מולקולרי למדידת מרחקים בטווח ננומטר2,3. לספקטרום הקליטה של הקבלה יש חפיפה ספקטרלית חלקית עם ספקטרום הפליטה של התורם בסוף אורך הגל הקצר יותר. היא מתווכת על ידי העברת אנרגיה פחות הקרינה בין זוג תורם לקבלה, בעוד היעילות של העברת אנרגיה תלויה במרחק וכיוון של הקבלה4.
מספר גישות יושמו כדי למזער את הרקע ולשפר את יעילות הזיהוי של האות הפלואורסצנטית5,6. גישה אחת היא מיקרוסקופיה קונפוקלית, שבה חור מגביל את נקודת העירור לגודל מתחת למגבלת העקיפה7. גישה נוספת היא השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF), שהיא טכניקת תאורה רחבת השדות שבה האור מכוון מחוץ לציר מעל זווית קריטית8. האור הוא אז באופן פנימי לחלוטין משתקף בממשק בין הזכוכית והפתרון מימית, יצירת גל אוונזאני רק מאיר את fluorophores מחובר למשטח זכוכית ומונע רקע fluorophores בשאר הפתרון.
במיקרוסקופיה, המולקולות יכולות להיות מפזרת או מתחת לפני השטח באופן חופשי. הרזולוציה הטמפורלית הושגת יכולה להיות בתוך מיקרו-שניות עד מספר אלפיותהתשע 9. הזיהוי הקונמוקד עבור מולקולה בודדת מבוצע על-ידי דיודת מפולת פוטון יחיד (SPAD) וסריקת נקודה אחר נקודה של אזור הריבית10. ב TIRF, סדרת זמן של כמה מאות מולקולות מקיבוע על פני השטח נרשם על ידי מיקום רגיש דו מימדי טעינה מצמידים גלאי (CCD). CCD מגביר את האות הפלואורסצנטית גם על ידי הגברה המסך זרחן ולוחית microchannel או הכפל על שבב של פוטואלקטרונים (EMCCD). הרזולוציה הטמפורלית תלויה במהירות הבדיקה ואת היעילות הקוונטית של CCD ובדרך כלל על סדר של כמה עשרות אלפיות שניה6.
ג'ונסון הוא ביניים מרכזי בתיקון DNA ו שילוב מחדש11,12,13,14. ג'ונסון יש שני מתמשך ושני מעבר גדילי שמתחברים בין הגדילים מתמשך בלי מצטלבים זה את זה. ג'ונסון קיים בפתרון כמו הקונמוגבונים מוערמים X, אשר עוברים איזופיקציה רציפה על ידי הגדילים מתמשך להיות מעבר וקווצות המעבר להיות רציפה בתוך השני15. העדפת איזומר של ג'ונסון תלויה ברצף הליבה ובסביבה היונית, ולמד בהרחבה על-ידי הפרט16,17,18,19.
GEN120 הוא חלבון monomeric בפתרון21 ודורש dimerization לדבוק את ג'ונסון, ובכך לאפשר הפרדה נאותה של הגדילים משולב מחדש22,23. העדפת הערימה של ההשפעות של ג'ונסון משפיעה על תוצאת השילוב הגנטי על-ידי הגדרת כיוון הרזולוציה של האגרטלים הרסולדים24. הבנת האופן שבו GEN1 מאגד את הג, מרכזת את שני החתכים, ומבטיחה שהרזולוציה המלאה הייתה כולה תחת מחקר אינטנסיבי21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
במחקר זה, הגדרת היעד המבוסס TIRF משמש כמתואר בעבר31. 2-צבע עירור מתחלפים (אלכס) מוחל כדי לקבוע את שינויי הקונפורמציה על האינטראקציה של GEN1 עם fluorophore המסומן ג'ונסון. אלכס מייצרת 2d היסטרגגרמות מבוסס על שני פרמטרים מטימטרי היעילות של E, שהיא התורם לקבלה התלוי במרחק, ואת הפרמטר סטויכיומטריה S, אשר מודד את התורם-לקבלה סטויכיומטריה32. אלכס מאפשר מיון של מינים פלואורסצנטי על בסיס הסטואיצ'ימינסים של fluorophores כולל תורם בלבד, קבלה בלבד, מעורבים אוכלוסיות מעורבות. אלכס יכול להאריך את השימוש לדאוג לטווח מלא והוא יכול לזהות הבדלים בהירות fluorophore ו oligomerization, כמו גם לפקח מקרומולקולה-ligand אינטראקציות33.
הוא נמצא כי GEN1 בעקביות מצליח לפתור את ג'ונסון בתוך החיים של הקומפלקס GEN1-ג'ונסון. שינויים תלויי-הזמן התלויים נובעים מסימני הזמן של מולקולות בודדות, ואילו ההיסטגרמות מייצגות את התפלגות האוכלוסיות המשמשות כבסיס. שימוש בזמן פקיעה בצבע יחיד, במהירות על המחירים ולהאט את התעריפים עבור GEN1 דיימר הם הפגינו, אשר להגדיל את הזיקה של GEN1 דיימר התאספו במוצר החתך הראשון.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

שיטות בצובר למדוד את התנהגות ההרכב של מולקולות, שבו שיעורי תגובה בודדים של השלבים הבסיסיים ממוצעים ברחבי האוכלוסיה. מולקולה בודדת Förster העברת אנרגיה (smFRET) מספק הקלטה של שינויים קונפורמטיים מתרחש על ידי מולקולות בודדות בזמן אמת. לכן, smFRET הוא רב עוצמה במדידת שינויים מבניים באנזים או במצע במהלך הכריכה והזרז. עבודה זו מציגה פרוטוקול עבור הדמיה בודדת מולקולה של האינטראקציה של הולידיי-אין ארבע כיוון (ג'ונסון) והפער endonuclease I (GEN1), ציטוסולומולוגי הומוולוגיים אנזים שילוב מחדש. מוצגים גם הם יחיד צבע ושני צבע עירור מתחלפים (אלכס) smFRET הפרוטוקולים הניסיוניים לעקוב אחר הרזולוציה של ג'ונסון על ידי GEN1 בזמן אמת. הקינטיקה של GEN1 דימרזציה נקבעת על ידי ג'ונסון, אשר הוצע לשחק תפקיד מפתח ברזולוציה של ג'ונסון והוא נשאר חמקמק עד עכשיו. הטכניקות המתוארות כאן יכולות להיות מוחלות באופן נרחב כדי להשיג תובנות מכניסטיות בעלות ערך רב של מערכות האנזים-DNA רבות.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

מוצג כאן הוא פרוטוקול לביצוע מולקולה בודדת Förster העברת אנרגיה ללמוד החלטה ג'ונסון. עירור שני הצבעים משמש לקביעת קבועי הדיסוציאציה. הזמן חד צבע לשגות smfret הוא לאחר מכן בזמן אמת מחשוף בחני להשיג את התפלגות זמן לשכון לפני הרזולוציה ג'ונסון.

מולקולה בודדת Förster שיטות העברת אנרגיה בזמן אמת על החלטה של צומת הולידיי-GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לנטר את דינמיקת האינטראקציה ואת הרזולוציה של צומת הולידיי על ידי דש אנדונוקלאז 1 ברמת המולקולה הבודדת ומערכות אנזימטיות אחרות. ובכן, חלקם יהיו ממוצעים בכל האוכלוסייה המולקולרית או מאבטח את הצעדים המכוניסטיים האישיים הבסיסיים ויש. שיטות מולקולה אחת לספק פרטים אלה על ידי ניטור ההתנהגות בזמן אמת של מולקולות בודדות.שיטות מולקולה אחת יכולות לזהות ביעילות אינטראקציות ביומולקולריות בטווח פיקו וננומולקולרי עם ספציפיות גבוהה. וזה שימושי עבור פתרונות מעשיים רבים באבחון, ריצוף הגנום, חישה. שיטות אופטיות ומדידה מאולצת של מולקולה אחת מיושמות באופן נרחב בפיזיקה, כימיה וביולוגיה ומוכחות כמספקות תצפיות אציליות שאינן נגישות בשיטות אחרות.העצה שלי למשתמשים בפעם הראשונה היא לעקוב מקרוב אחר השלבים המפורטים המפורטים המפורטים בפרוטוקול זה. איורים חזותיים של הליך מעשי של פרוטוקול זה יובילו ליישום מוצלח של הטכניקה. כדי להכין את תא זרימת ערוץ יחיד, להתחיל על ידי קידוח שני חורים בקוטר 1.22 מילימטר בחלק האמצעי של שקופית קוורץ 50 על 20 מילימטר עם המרכזים 37 מילימטרים זה מזה ו 6.5 מילימטרים מקצה השקופית.השתמש חותך אלקטרוני לחתוך ערוץ 41 על ידי 2.25 מילימטר לתוך 50 על 20 מילימטר חתיכת גיליון דבק כפול לקלף את הצד הפלסטיק של כיסוי מגן. ליישר את הקצוות של היצירה עם הקצוות של שקופית קוורץ ולהשתמש זוג פינצטה polytetrafluoroethylene כדי להסיר בעדינות את כל בועות אוויר לכודים. מקלפים את צד הנייר של פיסת דבק ולהרים את היצירה על פני השטח פונקציונלי של להחליק כיסוי.לאחר מכן, חותכים חתיכה אחת של צינורות פוליאתילן בקוטר פנימי של 1.22 מילימטרים לאורך של 11 ס"מ עבור שקע ופיסת צינורות אחת ל 25 ס"מ עבור השקע. ואז להכניס את הצינורות לתוך החורים שנקדחו בעבר כמו הכניסה צינורות שקע עבור תא הזרימה. ולהשתמש בדבק אפוקסי של חמש דקות כדי לאטום את הקצוות של ממשק החלקת כיסוי הקוורץ בצינורות השקע והמפרצון.כאשר התא התייבש, להשתמש במזרק 1 מילימטר כדי לשטוף 0.2 מיקרומטר מסונן 0.03 מיליגרם למיליליטר ריכוז avidin ב PBS לתוך התא באמצעות מזרק שני מלא חיץ לבד לשטוף את כל אווילין עודף בסוף שפע. כדי לבצע ניסוי FRET בצבע יחיד, החל תחילה טיפה אחת של שמן טבילה על מטרה פלואורסצנטית השתקפות פנימית פי 100 ולהגדיר את הכפל על שבב של פוטואלקטרונים לרווח מתאים כדי לייעל את האות לרקע ולמנוע רוויה. מניחים בזהירות את תא הזרימה על מחזיק הדגימה, ולהשתמש התאמת מסלול כדי להעלות בהדרגה את המטרה עד השמן נוגע להחליק את המכסה.הפעל את לייזר 532 ננומטר ולעבור למצב כוונון עדין של המטרה. כוונו את הפליטה ליציאת המצלמה כדי לצפות בתמונה שעל הצג ולהתאים את גובה המטרה עד שהמשטח הפונקציונלי של החלקת הכיסוי יובא לפוקוס ויתבונן בצג. בדוק כי הרקע מפני השטח הפונקציונליים של מחליקי הכיסוי אינו עולה על כמה כתמים לפני זורם ב HJ שכותרתו פלואורסצנטי. כאשר המערכת מוכנה ב 0.2 כדי 0.5 microliters של המצע מדולל של עניין לתוך 120 microliters של חיץ הדמיה עם מערכת ניקוי חמצן לתוך צינור 0.5 מיליליטר ולחבר את השקע של התא האיטי למשאבת מזרק.הכנס את צינור הכניסה לצינור 1.5 מיליליטר ולהתחיל את משאבת המזרק ב 30 עד 50 microliter לדקה כדי למשוך את הפתרון מהצינור. לעתים קרובות תמונה פני השטח בקצרה עם לייזר ירוק כדי לאשר כיסוי טוב של התא עם 100 כדי 300 חלקיקים של מצע מופץ הומוגנית, במים טובים. אם פני השטח של תא הזרימה מכוסים כראוי, יש לשטוף עוד 120 מיקרוליטרים של מאגר הדמיה במהירות של 30 עד 50 מיקרוליטר לדקה כדי לשטוף כל HJ לא מאוגד ולאפשר לתא הזרימה לשבת במשך 5 דקות כדי לאפשר למערכת חיטוט החמצן לרוקן את החמצן המומס.הגדר את זמן החשיפה לכ- 60 אלפיות שניה. זמן המחזור יוגדר באופן אוטומטי על-ידי התוכנה בהתבסס על מהירות העברת הנתונים. ציין את מספר המחזורים או המסגרות הרצוי לכ- 400.הפליטה מהתורם והפליאורופורים המקבלים מפוצלים לערוצי צבע על ידי מכשיר מפצל תמונה. בחר אזור מתאים על פני השטח, התאם את גובה המטרה כדי למקד את התמונה והתקליט ולשמור את הסרט בתבנית tiff של 16 סיביות. ואז לעבור לאזור חדש.לשטוף את התא עם 120 microliters של מאגר הדמיה בתוספת ריכוזים המצוין של GEN1 בקצב זרימה של 30 microliters לדקה, ריכוז אחד בכל פעם. ברזולוציה של ניסוי מחשוף HJ, להתאים את קצב הזרימה ל 110 microliters לדקה ולהתחיל את ההקלטה 5 עד 10 שניות לפני הכניסה של האנזים לתא הזרימה. ההדמיה להתחיל 5 עד 10 שניות לפני הכניסה של האנזים לתא הזרימה יהיה למקסם את מספר האירועים.לאחר שכל הריכוזים נבדקו, השתמשו בשקופית קבועה של חרוז פלואורסצנטי כדי למפות את חלקיקי התורם והמקבל זה לזה במכשיר פיצול התמונה. לאחר התקנת חבילת התוכנה המתאימה כדי ליצור מטריצת טרנספורמציה, פתח את סרט השקופיות המוקלט של חרוזים ובחר את המיקומים של חרוזים בודדים בערוצי התורם והמקבל. כאשר המטריצה נוצרה משקופית חרוז קבוע לחץ על טען TFORM ובחר את קובץ מטריצת ההמרה.בתפריט הנפתח של מסנן הערוצים, לחץ על האפשרות D&A כדי לבחור עבור חלקיקים המסומן הן עם התורם והן עם המקבל. לאחר מכן, הזן plotTimetraceCW כפי שהונחה במדריך כדי ליצור את עקבות הזמן עבור כל מולקולה. כדי לבצע ניסוי ALEX FRET, להקליט סרט המורכב מסגרות רצופות של פליטות תורמים ומקבלים על ידי זרזירות ישירה עם לייזרים ירוקים ואדומים.פתחו את סרטי ALEX הנרכשים והגדירו את סף הגילוי המתאים בכ-300 לכל אחד מ הפליטות של התורם עקב גירוש תורמים, פליטת מקבלים עקב גירוש תורמים וגירוש מקבל בשל ערוצי העירור הישירים. החל את מסנני הערוץ המתאימים כדי לבחור עבור החלקיקים כי היו גם תורם ומקבל ולקשר 200 כדי 300 חלקיקים בכל אחד משלושת הערוצים. השתמש בקוד MATLAB של plotHistALEX כדי ליצור היסטוגרמות ALEX המתאימות לפסגות שונות בפונקציות ההיסטוגרמה ולהשתמש בתוכנית גרפים וניתוח מתאימה כדי לקבוע את אחוז האזור מתחת לעקומה עבור כל אוכלוסייה.לאחר מכן השתמש בקוד MATLAB של plotTimetraceALEX כדי ליצור מעקב זמן עבור כל מולקולה המציגה את פליטת התורם על ידי העירור הישיר בפליטת המקבל עקב FRET והגירוש הישיר. זה נציג לסירוגין העירור FRET היסטוגרמה של תווית סמוכה X-0 מראה שתי פסגות התואמות החלפה של isomers בשפע יותר ופחות בשפע. שיעורי isomerization המתקבלים היסטוגרמות זמן להתעכב של isomers עולה בקנה אחד עם אלה שדווחו בעבר.מולקולה אחת FRET היסטוגרמות של התווית הסמוכה X-0 צומת בריכוזים שונים GEN1 שנרכשו על ידי ALEX, לחשוף שיא אחד המתאים isomer FRET גבוהה חינם שיא אחד המתאים לאוכלוסיית HJ מאוגד לאחר חיסור התרומה של isomer פחות בשפע מן פסגת FRET נמוך. בריכוז GEN1 רווי, היסטוגרמה FRET של X-0 יש רק שיא FRET נמוך אחד המתאים GEN1 מאוגד כל isomer של HJ כפי שחזה המודל. הכריכה של מונומר GEN1 ל- HJ ואחריו היווצרות עמומה יותר היא תכונה ייחודית של ה- HJ האוקריוטי resolvase GEN1 בהשוואה לפתרון פרוקריוטי הקיימים בצורה דימרית בפתרון.עדות נוספת לכך שמונומר GEN1 קושר ומעוות את ה- HJ היא התבוננות במספר משמעותי של עקבות של חלקיקים לא סלולים עם מצב FRET נמוך ויציב בנוכחות מגנזיום בריכוזי GEN1 נמוכים. עזיבתו בו זמנית של התורם והמקבל לאחר מצב FRET נמוך ויציב עקבות של X-0 נפתר המתרחשת ללא הופעתה של ביניים עולה כי החלטה מלאה מתרחשת בתוך החיים של מתחם GEN1 HJ. שים לב כי הרקע מפני השטח זכוכית פונקציונלי לא יעלה על כמה כתמים, כי חלקיקים מופצים באופן שווה חיוניים להשגת תוצאות טובות.תמיד להשתמש בציוד מגן אישי מכסה המנוע אדים בעת הכנת תמונת עריכה בסידרה. הקפד להרכיב משקפי מגן ספציפי אורכי הגל בעת עבודה עם לייזרים. שיטות אחרות כגון cryo ap, תהודה מגנטית גרעינית, יכול לספק פרטים מבניים ברמה האטומית.מידע זה הוא חלק בלתי נפרד מהעיצוב והפרשנות של ניסויי FRET במולקולה אחת. מולקולה אחת FRET לפתוח תצוגות חדשות בתחום של שכפול DNA וכתוצאה מכך הבנה עמוקה יותר של מנגנוני הפעולות helicases ו nucleases.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

שינוי צורה, הגנום עריכת ופנוהקלדת החנקן-תיקון טרופי קנאביציים עץ Parasponia אנדרסונii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

חקירת התפקיד הטרנססאני של משתיק הRUNX1 נית על ידי CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein בתאי לוקמיה מיאלואיד חריפה

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...