9.0K Views
•
11:27 min
•
September 18th, 2019
DOI :
September 18th, 2019
•0:04
Title
1:22
Flow Cell Preparation
3:01
Single-Molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) Experiments
6:25
Sm-FRET Data Analysis
7:10
Two-Color Alternating Excitation (ALEX) FRET Experiment and Analysis
8:24
Results: Representative Real-Time HJ Resolution Investigation
10:13
Conclusion
Transcript
यह प्रोटोकॉल हमें एकल अणु स्तर और अन्य एंजाइमेटिक प्रणालियों पर फ्लैप एंडोक्यूलीज 1 द्वारा बातचीत की गतिशीलता और होलिडे जंक्शन के संकल्प की निगरानी करने में सक्षम बनाता है। खैर, कुछ आणविक आबादी में औसत होगा या अंतर्निहित व्यक्तिगत यंत्रवादी कदम सुरक्षित है और वहां है । एकल अणु विधियां व्यक्तिगत अणुओं के वास्तविक समय के व्यवहार की निगरानी करके ये विवरण प्रदान करती हैं।
एकल अणु विधियां उच्च विशिष्टता के साथ पिको और नैनोमॉलर रेंज में बायोमॉलिकुलर इंटरैक्शन का कुशलतापूर्वक पता लगा सकती हैं। जो निदान, जीनोम अनुक्रमण, और संवेदन में कई व्यावहारिक समाधानों के लिए काम है। ऑप्टिकल और मजबूर एकल अणु विधियों को मापने व्यापक रूप से भौतिकी, रसायन विज्ञान, और जीव विज्ञान में लागू कर रहे है और महान टिप्पणियों है कि अंय तरीकों से दुर्गम है प्रदान करने के लिए साबित कर रहे हैं ।
पहली बार उपयोगकर्ताओं को मेरी सलाह इस प्रोटोकॉल में निर्धारित विस्तृत कदमों का बारीकी से पालन करना है। इस प्रोटोकॉल की हाथों पर प्रक्रिया के दृश्य चित्र तकनीक के सफल कार्यान्वयन के लिए नेतृत्व करेंगे। एकल चैनल प्रवाह सेल तैयार करने के लिए, एक ५० के मध्य भाग में दो १.२२ मिलीमीटर व्यास छेद ड्रिलिंग द्वारा शुरू 20 मिलीमीटर क्वार्ट्ज स्लाइड केंद्रों के साथ ३७ मिलीमीटर के अलावा और स्लाइड के किनारे से ६.५ मिलीमीटर ।
एक इलेक्ट्रॉनिक कटर का उपयोग करने के लिए एक डबल चिपकने वाला चादर के 20 मिलीमीटर टुकड़ा द्वारा एक ५० में २.२५ मिलीमीटर चैनल द्वारा एक ४१ कटौती और सुरक्षात्मक कवर के प्लास्टिक की ओर छील । टुकड़े के किनारों को क्वार्ट्ज स्लाइड के किनारों के साथ संरेखित करें और किसी भी फंसे हुए हवा के बुलबुले को धीरे-धीरे हटाने के लिए पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें। चिपकने वाले टुकड़े के कागज की ओर छील और एक कवर पर्ची के कार्यात्मक सतह पर टुकड़ा माउंट ।
इसके बाद, पॉलीथीन ट्यूबिंग के एक टुकड़े को 1.22 मिलीमीटर के आंतरिक व्यास के साथ इनलेट के लिए 11 सेंटीमीटर लंबाई और आउटलेट के लिए 25 सेंटीमीटर ट्यूबिंग का एक टुकड़ा काटें। फिर प्रवाह सेल के लिए इनलेट और आउटलेट ट्यूबों के रूप में पहले ड्रिल किए गए छेद में ट्यूब डालें। और इनलेट और आउटलेट ट्यूबों में क्वार्ट्ज कवर स्लिप इंटरफेस के किनारों को सील करने के लिए पांच मिनट एपॉक्सी गोंद का उपयोग करें।
जब कोशिका सूख गई है, तो प्रोफेशन के अंत में किसी भी अतिरिक्त एविडिन को धोने के लिए अकेले बफर से भरी दूसरी सिरिंज का उपयोग करके सेल में पीबीएस में 0.03 मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर एकाग्रता एविडिन को फ्लश करने के लिए 1 मिलीमीटर सिरिंज का उपयोग करें। एक एकल रंग FRET प्रयोग करने के लिए, पहले एक 100 गुना कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद लागू करें और पृष्ठभूमि के संकेत को अनुकूलित करने और संतृप्ति को रोकने के लिए एक उपयुक्त लाभ के लिए फोटोइलेक्ट्रॉन की चिप गुणा पर सेट करें। ध्यान से नमूना धारक पर प्रवाह सेल जगह है, और पाठ्यक्रम समायोजन का उपयोग करने के लिए धीरे से उद्देश्य बढ़ाने के लिए जब तक तेल कवर पर्ची छू ।
532 नैनोमीटर लेजर चालू करें और उद्देश्य के ठीक समायोजन मोड पर स्विच करें। मॉनिटर पर छवि का निरीक्षण करने और कवर स्लिप की कार्यात्मक सतह को ध्यान में लाने और मॉनिटर पर देखे जाने तक उद्देश्य की ऊंचाई को समायोजित करने के लिए कैमरा पोर्ट पर उत्सर्जन को निर्देशित करें। जांच करें कि कवर स्लिप की कार्यात्मक सतह से पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंटली लेबल एचजे में बहने से पहले कुछ स्थानों से अधिक नहीं है। जब सिस्टम 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में ऑक्सीजन मैला ढोने की प्रणाली के साथ इमेजिंग बफर के 120 माइक्रोलीटर में ब्याज के पतला सब्सट्रेट के 0.2 से 0.5 माइक्रोलीटर पर तैयार हो जाता है और धीमी कोशिका के आउटलेट को सिरिंज पंप से जोड़ता है।
इनलेट ट्यूब को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डालें और ट्यूब से समाधान निकालने के लिए प्रति मिनट 30 से 50 माइक्रोलीटर पर सिरिंज पंप शुरू करें। सजातीय रूप से वितरित, अच्छी तरह से दूरी वाले सब्सट्रेट के 100 से 300 कणों के साथ सेल के अच्छे कवरेज की पुष्टि करने के लिए हरे लेजर के साथ सतह को संक्षेप में छवि दें। यदि प्रवाह कोशिका की सतह पर्याप्त रूप से कवर किया जाता है, तो किसी भी अनबाउंड एचजे को धोने के लिए प्रति मिनट 30 से 50 माइक्रोलीटर पर इमेजिंग बफर के एक और 120 माइक्रोलीटर फ्लश करें और प्रवाह कोशिका को 5 मिनट तक बैठने की अनुमति दें ताकि ऑक्सीजन स्कैविंग सिस्टम को घुलित ऑक्सीजन को कम करने की अनुमति दी जा सके।
एक्सपोजर समय लगभग 60 मिलीसेकंड सेट करें। डाटा ट्रांसफर की स्पीड के आधार पर सॉफ्टवेयर द्वारा साइकिल का समय अपने आप सेट हो जाएगा। लगभग 400 करने के लिए चक्र या फ्रेम की वांछित संख्या निर्दिष्ट करें।
दाता और स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोरेस से उत्सर्जन एक छवि स्प्लिटर डिवाइस द्वारा रंग चैनलों में विभाजित होते हैं। सतह पर एक उपयुक्त क्षेत्र का चयन करें, छवि को ध्यान केंद्रित करने और रिकॉर्ड करने और 16 बिट झगड़ा प्रारूप में फिल्म को बचाने के उद्देश्य की ऊंचाई को समायोजित करें। फिर किसी नए क्षेत्र में चले जाएं।
इमेजिंग बफर के 120 माइक्रोलीटर के साथ सेल फ्लश एक 30 माइक्रोलीटर प्रति मिनट प्रवाह दर, एक समय में एक एकाग्रता पर GEN1 की संकेत सांद्रता के साथ पूरक। एचजे क्लीवेज प्रयोग के संकल्प में, प्रवाह दर को प्रति मिनट 110 माइक्रोलीटर में समायोजित करें और एंजाइम के प्रवेश द्वार से 5 से 10 सेकंड पहले रिकॉर्डिंग को प्रवाह कोशिका में शुरू करें। फ्लो सेल में एंजाइम के प्रवेश द्वार से 5 से 10 सेकंड पहले शुरू करने के लिए इमेजिंग घटनाओं की संख्या को अधिकतम करेगा।
जब सभी सांद्रता का परीक्षण किया गया है, छवि बंटवारे डिवाइस में एक दूसरे के लिए दाता और स्वीकार्य कणों नक्शा करने के लिए एक निश्चित फ्लोरोसेंट मनका स्लाइड का उपयोग करें । एक परिवर्तन मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर पैकेज स्थापित करने के बाद, रिकॉर्ड किए गए मनका स्लाइड मूवी खोलें और दाता और स्वीकारकर्ता चैनलों में व्यक्तिगत मोतियों की स्थिति का चयन करें। जब मैट्रिक्स फिक्स्ड मनका स्लाइड क्लिक लोड TFORM से उत्पन्न किया गया है और परिवर्तन मैट्रिक्स फ़ाइल का चयन करें।
चैनल फ़िल्टर ड्रॉप डाउन मेनू में, दाता और स्वीकारकर्ता दोनों के साथ लेबल किए गए कणों के लिए चयन करने के लिए डी एंड ए विकल्प पर क्लिक करें। फिर, प्रत्येक अणु के लिए समय निशान उत्पन्न करने के लिए मैनुअल में निर्देश के रूप में प्लॉटटाइम्रेससीडब्ल्यू दर्ज करें। एलेक्स FRET प्रयोग करने के लिए, हरे और लाल लेजर के साथ प्रत्यक्ष उत्तेजन द्वारा दाता और स्वीकारकर्ता उत्सर्जन के लगातार फ्रेम से बनी एक फिल्म रिकॉर्ड करें।
अधिग्रहीत एलेक्स फिल्मों को खोलें और दाता उत्तेजन के कारण प्रत्येक दाता उत्सर्जन के लिए लगभग 300 पर उपयुक्त पहचान सीमा निर्धारित करें, दाता उत्तेजन के कारण स्वीकारकर्ता उत्सर्जन, और प्रत्यक्ष उत्तेजन चैनलों के कारण स्वीकार्य उत्सर्जन करें। उन कणों के लिए चयन करने के लिए उपयुक्त चैनल फ़िल्टर लागू करें जो दाता और स्वीकार्य दोनों रहे हैं और तीन चैनलों में से प्रत्येक में 200 से 300 कणों को लिंक करें। हिस्टोग्राम के कार्यों में विभिन्न चोटियों को फिट करने वाले एलेक्स हिस्टोग्राम को उत्पन्न करने के लिए plotHistALEX MATLAB कोड का उपयोग करें और प्रत्येक आबादी के लिए वक्र के तहत क्षेत्र के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए एक उपयुक्त रेखांकन और विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करें।
फिर प्लॉटटाइम्रेसेलेक्स मैटलैब कोड का उपयोग करें प्रत्येक अणु के लिए एक समय ट्रेस उत्पन्न करने के लिए जो कि FRET और प्रत्यक्ष उत्तेजन के कारण स्वीकार्य उत्सर्जन में प्रत्यक्ष उत्तेजन द्वारा दाता उत्सर्जन दिखाता है। यह प्रतिनिधि आसन्न लेबल एक्स-0 के उमंग FRET हिस्टोग्राम बारी दो चोटियों कि अधिक प्रचुर मात्रा में और कम प्रचुर मात्रा में आइसोमर्स के आदान-परिवर्तण के अनुरूप से पता चलता है । आइसोमर्स के निवास समय हिस्टोग्राम से प्राप्त आइसोमराइजेशन दरें पहले रिपोर्ट किए गए लोगों के अनुरूप हैं।
एलेक्स द्वारा अधिग्रहीत विभिन्न GEN1 सांद्रता पर आसन्न लेबल एक्स-0 जंक्शन के एकल अणु FRET हिस्टोग्राम, कम FRET चोटी से कम प्रचुर मात्रा में आइसोमर के योगदान को घटाने के बाद मुक्त उच्च FRET आइसोमर और एक चोटी के अनुरूप एक चोटी का पता चलता है। एक संतृप्त GEN1 एकाग्रता में, एक्स-0 के FRET हिस्टोग्राम में केवल एक ही कम FRET चोटी है जो जीई1 के अनुरूप है जो मॉडल द्वारा भविष्यवाणी की गई है। एमईआर 1 मोनोमर को एमईजे के लिए बाध्यकारी और इसके बाद डिमर गठन प्रोकैरियोटिक समाधान की तुलना में यूकेरियोटिक एचजे समाधान GEN1 की एक अनूठी विशेषता है जो समाधान में डाइमेरिक रूप में मौजूद है।
इसके अलावा सबूत है कि GEN1 मोनोमर बांधता है और एचजे विकृत कम GEN1 सांद्रता पर मैग्नीशियम की उपस्थिति में एक स्थिर कम FRET राज्य के साथ अशुद्ध कणों के निशान की एक महत्वपूर्ण संख्या का अवलोकन है । एक मध्यवर्ती के उद्भव के बिना होता है कि हल एक्स-0 के निशान में एक स्थिर कम FRET राज्य के बाद दाता और स्वीकार्य के एक साथ प्रस्थान इंगित करता है कि एक पूरा संकल्प GEN1 HJ परिसर के जीवनकाल के भीतर होता है । ध्यान दें कि कार्यात्मक कांच की सतह से पृष्ठभूमि कुछ स्थानों से अधिक नहीं होनी चाहिए और अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए समान रूप से वितरित कण आवश्यक हैं।
सीरियलाइजेशन पिक्चर तैयार करते समय हमेशा व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और धूम हुड का उपयोग करें। लेजर के साथ काम करते समय तरंगदैर्ध्य के लिए विशिष्ट सुरक्षात्मक चश्मा पहनना सुनिश्चित करें। क्रायो एपी, परमाणु चुंबकीय अनुनय जैसे अन्य तरीके परमाणु स्तर के संरचनात्मक विवरण प्रदान कर सकते हैं।
यह जानकारी एकल अणु FRET प्रयोगों के डिजाइन और व्याख्या के लिए अभिन्न हैं। एकल अणु FRET डीएनए प्रतिकृति के क्षेत्र में नए विचार खोलते हैं जिसके परिणामस्वरूप कार्यों के तंत्र की गहरी समझ होती है हेलीकेस और नाभिक।
यहाँ प्रस्तुत HJ संकल्प का अध्ययन करने के लिए एकल अणु एफrster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल है. दो रंग बारी उत्तेजना वियोजन स्थिरांकों का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एकल रंग समय चूक smFRET तो वास्तविक समय दरार assays में लागू किया जाता है रहने के समय वितरण HJ संकल्प से पहले प्राप्त करने के लिए.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved