Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da King Abdullah University of Science and Technology attraverso il finanziamento di base e il Premio di ricerca competitiva (CRG3) a S. M. H.

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

In questo studio sono state implementate diverse tecniche smFRET per determinare la cinetica della risoluzione HJ da GEN130. Approcci smFRET simili sono stati utilizzati per seguire il fabbisogno conformealmente del DNA a doppio lembo e la scissione mediante la replicazione del DNA e la riparazione del lembo endonuclease 142,43,44. In questo caso vengono illustrati i passaggi critici di questo protocollo. La reazione di insilanizzazione dovrebbe essere libera da qualsiasi traccia di umidità. La soluzione di pegilazione deve essere applicata rapidamente al vetro silanizzato una volta che il PEG viene sciolto per evitare l'idrolisi. Nella cella di flusso multicanale, qualsiasi aria intrappolata nel foglio adesivo deve essere rimossa per evitare perdite tra i canali vicini. La soluzione PCA deve essere appena preparata in quanto si ossida nel tempo. L'aggiunta di 10 N NaOH dovrebbe essere dropwise, con vortice in mezzo. Lo sfondo a fluorescenza nel coperchio deve essere minimo prima di fluorescenza etichettato HJ. L'imaging nella cella di flusso deve essere eseguito in una direzione per evitare l'imaging di aree sbiancate. Negli esperimenti ALEX, la potenza del laser rosso dovrebbe essere ridotta per evitare uno sbiancamento rapido dell'accettatore. Negli esperimenti time-lapse, il tempo di ciclo deve essere più breve dell'evento più veloce.
smFRET è una tecnica sensibile che può fornire preziose intuizioni in tempo reale nelle reazioni biomolecolari. Tuttavia, questo metodo ha diverse sfide tecniche, tra le quali sta ottenendo un cambiamento misurabile in FRET durante la reazione biochimica. Ciò è necessario per ottenere caratteristiche ben separate negli istogrammi e negli stati distinguibili nelle tracce temporali. In molti casi, smFRET richiede un'attenta progettazione dei substrati, selezione delle coppie di fluorofori e delle loro posizioni, e amplificazione dei cambiamenti FRET nel substrato di DNA a causa dei piccoli cambiamenti strutturali nel substrato45. Un altro approccio per l'esecuzione di FRET è quello di utilizzare proteine etichettate46. La finestra di osservazione in FRET è limitata dalla stabilità dell'accettatore come Cy5 o Alexa Fluor 647 che tende a sbiancarsi più rapidamente del donatore (Cy3 in questo caso). Pertanto, FRET richiede una continua ricerca di fluorofori stabili per estendere la durata dell'esperimento e gli sforzi per sviluppare sistemi di scavenging di ossigeno per prolungare il segnale di fluorescenza e massimizzare il rapporto segnale-rumore47,48 .
Tra i suggerimenti per la risoluzione dei problemi in smFRET c'è il bilanciamento dei diversi parametri coinvolti nell'imaging come la potenza laser, il tempo di esposizione, il tempo di ciclo e il numero di cicli per massimizzare l'emissione di fluorescenza, prolungare la durata dell'esperimento e raggiungere adeguati intervalli di campionamento per la dinamica enzimatica. Tempi di osservazione più lunghi e effetti minimi derivanti dal fotosbiancamento sono essenziali per ottenere distribuzioni di tempo di perazione ad alta fedeltà che rappresentano la dinamica degli enzimi. ALEX genera istogrammi migliori poiché questo metodo è sottoposto a minori contributi da particelle fotosbiancate rispetto al FRET monocolore. Tuttavia, la risoluzione temporale in ALEX è inferiore a quella in FRET monocolore.
Infine, l'enfasi di smFRET sulla rilevazione di cambiamenti conformi/strutturali nelle singole molecole in tempo reale colma il divario tra le tecniche strutturali ad alta risoluzione (cioè la cristallografia a raggi X, la risonanza magnetica nucleare, la microscopia elettronica), che fornisce dettagli strutturali a risoluzione atomica in condizioni statiche e metodi di massa che producono la media dell'insieme di una proprietà misurabile. In molti aspetti, smFRET si è dimostrata una potente tecnica per studiare i sistemi biologici in tempo reale.

I metodi a singola molecola basati sul rilevamento della fluorescenza forniscono elevati rapporti segnale-rumore1. FRET è una tecnica spettroscopica in grado di misurare le distanze nell'intervallo di 1-10 nm, rendendo questa tecnica come righello molecolare per misurare le distanze nell'intervallo nanometrico2,3. Lo spettro di assorbimento dell'accettatore presenta una sovrapposizione spettrale parziale con lo spettro di emissione del donatore all'estremità della lunghezza d'onda più corta. FRET è mediato dal trasferimento di energia senza radiazioni tra una coppia di donatori e accettanti, mentre l'efficienza del trasferimento di energia dipende dalla distanza e dall'orientamento dell'accettatore4 .
Sono stati implementati diversi approcci per ridurre al minimo lo sfondo e migliorare l'efficienza di rilevamento del segnale di fluorescenza5,6. Un approccio è la microscopia confocale, in cui un foro stenopeico limita il punto di eccitazione a una dimensione inferiore al limite di diffrazione7. Un altro approccio è la fluorescenza totale di riflessione interna (TIRF), che è una tecnica di illuminazione a campo largo in cui la luce è diretta fuori asse sopra un angolo critico8. La luce viene quindi totalmente riflessa internamente all'interfaccia tra il vetro e la soluzione acquosa, generando un'onda evanescente che illumina solo i fluorofori attaccati alla superficie del vetro e impedisce lo sfondo dai fluorofori nel resto la soluzione.
Nella microscopia confocale, le molecole possono essere liberamente diffuso o immobilizzate superficiali. La risoluzione temporale raggiunta può essere entro microsecondi a diversi millisecondi9. Il rilevamento confocale per una singola molecola viene eseguito mediante diodo da valanga a singolo fotone (SPAD) e la scansione punto per punto della regione di interesse10. In TIRF, una serie temporale di poche centinaia di molecole immobilizzate sulla superficie è registrata da un rilevatore bidimensionale a carica bidimensionale (CCD) sensibile alla posizione. Il CCD amplifica il segnale di fluorescenza mediante schermo di fosforo intensificato e piastra a microcanale o moltiplicazione su chip di fotoelettroni (EMCCD). La risoluzione temporale dipende dalla velocità di lettura e dall'efficienza quantistica del CCD e di solito dall'ordine di poche decine di millisecondi6.
HJ è un intermedio centrale nella riparazione e ricombinazione del DNA11,12,13,14. HJ ha due fili continui e due di incrocio che si collegano tra i fili continui senza intersecarsi l'uno con l'altro. HJ esiste in soluzione come conformatori X-stacked, che subiscono la continua isomerizzazione da parte dei fili continui che diventano incrociando e i fili di attraversamento diventando continuo nell'altro conformer15. Isomer preferenza del HJ dipende dalla sequenza di base e ambiente ionico ed è stato ampiamente studiato da FRET16,17,18,19.
GEN120 è una proteina monomerica nella soluzione21 e richiede la dimerizzazione per fendere l'HJ, consentendo così una corretta separazione dei fili ricombinati22,23. La preferenza di accatastamento conformer dell'HJ influenza l'esito della ricombinazione genetica impostando l'orientamento della risoluzione da parte dei risolvi HJ24. Capire come GEN1 lega l'HJ, coordina le due incisioni e assicura che la sua risoluzione completa sia stata tutte oggetto di studio intensivo21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
In questo studio, viene utilizzato un allestimento TIRF basato su obiettivo come descritto in precedenza31. L'eccitazione alternata a due colori (ALEX) viene applicata per determinare i cambiamenti conformazionali al momento dell'interazione di GEN1 con fluoroforo etichettato HJ. ALEX produce istogrammi 2D basati su due parametri ratiometrici di efficienza FRET E, che è donatore-accettatore a seconda della distanza, e il parametro stoichiometria S, che misura la stoichiometria donatore-acceleratore32. ALEX consente lo smistamento di specie fluorescenti in base alle stoichiometrie dei fluorofori, tra cui sola donazione, solo accetto e sottopopolazioni miste. ALEX può estendere l'uso di FRET all'intera gamma e può rilevare le differenze nella luminosità e nell'oligomerizzazione del fluoroforo, nonché monitorare le interazioni macromolecola-ligando33.
Si è scoperto che GEN1 riesce costantemente a risolvere l'HJ entro la durata del complesso GEN1-HJ. I cambiamenti conformazionali dipendenti dal tempo derivano dalle tracce temporali delle singole molecole, mentre gli istogrammi rappresentano la distribuzione delle popolazioni sottostanti. Utilizzando FRET monocolore time-lapse, sono dimostrati rapidi on-rate e tempi di off-rate lenti per il dimero GEN1, che aumentano l'affinità del dimero GEN1 assemblato al primo prodotto di incisione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

I metodi sfusi misurano il comportamento di insieme delle molecole, in cui i tassi di reazione individuali dei passi sottostanti sono mediati in tutta la popolazione. Il trasferimento di energia di risonanza a singola molecola (smFRET) fornisce una registrazione dei cambiamenti conformazionali che avvengono da singole molecole in tempo reale. Pertanto, smFRET è potente nel misurare i cambiamenti strutturali nell'enzima o nel substrato durante il legame e la catalisi. Questo lavoro presenta un protocollo per l'imaging a singola molecola dell'interazione di una giunzione ostilia a quattro vie (HJ) e di endonuclease I (GEN1), un enzima citosolico omologa di ricombinazione. Sono stati presentati anche protocolli sperimentali smFRET a colori e a due colori per seguire la risoluzione dell'HJ di GEN1 in tempo reale. La cinetica della dimerizzazione GEN1 è determinata presso l'HJ, che è stato suggerito per svolgere un ruolo chiave nella risoluzione dell'HJ ed è rimasto sfuggente fino ad ora. Le tecniche qui descritte possono essere ampiamente applicate per ottenere preziose intuizioni meccanicistiche di molti sistemi enzimatico-DNA.

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Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Presentato qui è un protocollo per l'esecuzione di trasferimento di energia di risonanza monomolecola di Fàrster per studiare la risoluzione HJ. L'eccitazione alternata a due colori viene utilizzata per determinare le costanti di dissociazione. Il time lapse a colori singolo smFRET viene quindi applicato nei saggi di scissione in tempo reale per ottenere la distribuzione del tempo di dimora prima della risoluzione HJ.

Metodi di trasferimento di energia di risonanza a singola molecola per l'analisi in tempo reale della risoluzione dello svincolo di Holliday da gen1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Questo protocollo ci permette di monitorare la dinamica di interazione e la risoluzione della giunzione di Holliday con endonucleasi flap 1 a livello di singola molecola e altri sistemi enzimatici. Beh, alcuni avranno una media in tutta la popolazione molecolare o metteranno in sicurezza i singoli passi meccanicistici sottostanti e c'è. I metodi a singola molecola forniscono questi dettagli monitorando il comportamento in tempo reale delle singole molecole.I metodi a singola molecola possono rilevare in modo efficiente le interazioni biomolecolari nell'intervallo pico e nanomolare con alta specificità. Il che è utile per molte soluzioni pratiche nella diagnostica, nel sequenziamento del genoma e nel rilevamento. I metodi ottici e forzati di misurazione a singola molecola sono ampiamente applicati in Fisica, Chimica e Biologia e hanno dimostrato di fornire osservazioni nobili che sono inaccessibili con altri metodi.Il mio consiglio agli utenti per la prima volta è di seguire da vicino i passaggi dettagliati stabiliti in questo protocollo. Le illustrazioni visive della procedura pratica di questo protocollo porteranno a un'implementazione riuscita della tecnica. Per preparare la cella di flusso a canale singolo, iniziare forando due fori di 1,22 millimetri di diametro nella parte centrale di uno scivolo di quarzo di 50 per 20 millimetri con i centri distanti 37 millimetri e a 6,5 millimetri dal bordo dello scivolo.Utilizzare una fresa elettronica per tagliare un canale di 41 per 2,25 millimetri in un pezzo da 50 per 20 millimetri di un doppio foglio adesivo e staccare il lato plastico del coperchio protettivo. Allineare i bordi del pezzo con i bordi dello scivolo di quarzo e utilizzare un paio di pinzette in politetrafluoroetilene per rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria intrappolate. Staccare il lato carta del pezzo adesivo e montare il pezzo sulla superficie funzionalizzata di uno scivolo di copertura.Successivamente, tagliare un pezzo di tubi in polietilene con un diametro interno di 1,22 millimetri a una lunghezza di 11 centimetri per l'ingresso e un pezzo di tubo a 25 centimetri per l'uscita. Quindi inserire i tubi nei fori precedentemente praticati come tubi di ingresso e di uscita per la cella di flusso. E utilizzare colla epossidica di cinque minuti per sigillare i bordi dell'interfaccia di scorrimento della copertura al quarzo nei tubi di ingresso e di uscita.Quando la cellula si è asciugata, utilizzare una siringa da 1 millimetro per sciacquare 0,2 micrometri filtrati di 0,03 milligrammi per avidina di concentrazione millilitro in PBS nella cella utilizzando una seconda siringa riempita di tampone da sola per lavare eventuali avidin in eccesso alla fine della profusione. Per eseguire un esperimento FRET monocolore, applicare prima una goccia di olio ad immersione su un obiettivo di fluorescenza di riflessione interna totale 100 volte superiore e impostare la moltiplicazione su chip dei fotoeletroni su un guadagno adatto per ottimizzare il segnale sullo sfondo e prevenire la saturazione. Posizionare con cura la cella di flusso sul supporto del campione e utilizzare la regolazione del corso per aumentare gradualmente l'obiettivo fino a quando l'olio non tocca lo scivolamento del coperchio.Accendere il laser da 532 nanometri e passare alla modalità di regolazione fine dell'obiettivo. Dirigere l'emissione sulla porta della telecamera per osservare l'immagine sul monitor e regolare l'altezza dell'obiettivo fino a quando la superficie funzionalizzata dello slittamento del coperchio non viene messa a fuoco e può essere osservata sul monitor. Verificare che lo sfondo della superficie funzionalizzata del coperchio scivoli non superi pochi punti prima di fluire nell'HJ con etichetta fluorescente. Quando il sistema è pronto a 0,2-0,5 microlitri del substrato diluito di interesse in 120 microlitri di tampone di imaging con sistema di scavenging dell'ossigeno in un tubo da 0,5 millilitri e collegare l'uscita della cella lenta a una pompa per siringhe.Inserire il tubo di ingresso nel tubo da 1,5 millilitri e avviare la pompa della siringa a 30-50 microlitri al minuto per ritirare la soluzione dal tubo. Immagini spesso brevemente la superficie con il laser verde per confermare una buona copertura della cellula con da 100 a 300 particelle di substrato omogeneamente distribuito e ben distanziato. Se la superficie della cella di flusso è adeguatamente coperta, sciacquare altri 120 microlitri di tampone di imaging a 30-50 microlitri al minuto per lavare via qualsiasi HJ non legato e lasciare riposare la cella di flusso per 5 minuti per consentire al sistema di scavazione dell'ossigeno di esaurire l'ossigeno disciolto.Impostare il tempo di esposizione su circa 60 millisecondi. Il tempo di ciclo verrà impostato automaticamente dal software in base alla velocità di trasferimento dei dati. Specificate il numero desiderato di cicli o fotogrammi a circa 400.L'emissione del donatore e dei fluorofori accettori viene suddivisa in canali di colore da un dispositivo di splitter dell'immagine. Selezionate un'area adatta sulla superficie, regolate l'altezza dell'obiettivo per mettere a fuoco l'immagine e registrare e salvate il filmato in formato tiff a 16 bit. Quindi spostati in una nuova area.Sciacquare la cella con 120 microlitri di tampone di imaging integrati con le concentrazioni indicate di GEN1 a una portata di 30 microlitri al minuto, una concentrazione alla volta. Nella risoluzione dell'esperimento di scissione HJ, regolare la portata a 110 microlitri al minuto e iniziare la registrazione da 5 a 10 secondi prima dell'ingresso dell'enzima nella cella di flusso. l'imaging per iniziare da 5 a 10 secondi prima dell'ingresso dell'enzima nella cella di flusso massimizzerà il numero di eventi.Una volta che tutte le concentrazioni sono state testate, utilizzare una diapositiva di perline fluorescenti fissa per mappare le particelle del donatore e dell'accettore l'una all'altra nel dispositivo di divisione dell'immagine. Dopo aver installato il pacchetto software appropriato per generare una matrice di trasformazione, aprire il filmato di scorrimento del tallone registrato e selezionare le posizioni delle singole perline nei canali donatore e accettore. Una volta generata la matrice dalla diapositiva di perline fisse, fare clic su Carica TFORM e selezionare il file della matrice di trasformazione.Nel menu a discesa filtro canale fare clic sull'opzione D&A per selezionare le particelle etichettate sia con il donatore che con l'accettore. Quindi, immettere plotTimetraceCW come indicato nel manuale per generare le tracce di tempo per ogni molecola. Per eseguire un esperimento ALEX FRET, registrare un film composto da fotogrammi consecutivi di emissioni di donatori e accettori tramite eccitazioni dirette con i laser verdi e rossi.Aprire i filmati ALEX acquisiti e impostare la soglia di rilevamento adeguata a circa 300 per ciascuna delle emissioni del donatore a causa dell'eccitazione del donatore, dell'emissione di accettori dovuta all'eccitazione del donatore e dell'emissione di accettori a causa dei canali di eccitazione diretta. Applicare i filtri di canale appropriati per selezionare le particelle che sono state sia donatrici che accettori e collegare da 200 a 300 particelle in ciascuno dei tre canali. Utilizzate il codice PLOTHistALEX MATLAB per generare istogrammi ALEX che si adattano a picchi diversi nelle funzioni dell'istogramma e utilizzate un programma di grafiatura e analisi adatto per determinare la percentuale dell'area sotto la curva per ogni popolazione.Quindi utilizzare il codice plotTimetraceALEX MATLAB per generare una traccia di tempo per ogni molecola che mostri l'emissione del donatore dall'eccitazione diretta nelle emissioni accettori dovute al FRET e all'eccitazione diretta. Questo istogramma FRET ad eccitazione rappresentativa dell'etichetta adiacente X-0 mostra due picchi che corrispondono all'interscambio degli isomeri più abbondanti e meno abbondanti. I tassi di isomerizzazione ottenuti dagli istogrammi del tempo di Dwell degli isomeri sono coerenti con quelli riportati in precedenza.Gli istogrammi FRET a singola molecola della giunzione X-0 dell'etichetta adiacente a diverse concentrazioni gen1 acquisite da ALEX, rivelano un picco corrispondente all'isomero FRET alto libero e un picco corrispondente alla popolazione HJ legata dopo aver sottratto il contributo dell'isomero meno abbondante dal basso picco FRET. Ad una concentrazione di GEN1 saturante, l'istogramma FRET di X-0 ha solo un singolo picco FRET basso corrispondente a GEN1 legato a entrambi gli isomero dell'HJ come previsto dal modello. L'associazione del monomero GEN1 all'HJ seguita dalla formazione di dimeri è una caratteristica unica del resolvae HJ eucariotico GEN1 rispetto alle resolve procariotiche che esistono in forma dimerica in soluzione.Un'ulteriore prova che il monomero GEN1 lega e distorce l'HJ è l'osservazione di un numero significativo di tracce di particelle zioaved con uno stato FRET basso stabile in presenza di magnesio a basse concentrazioni di GEN1. La partenza simultanea del donatore e dell'accettore dopo uno stato FRET basso stabile in tracce di X-0 risolto che si verifica senza l'emergere di un intermedio indica che una risoluzione completa si verifica entro la durata del complesso GEN1 HJ. Si noti che lo sfondo dalla superficie del vetro funzionalizzato non deve superare alcuni punti e che particelle distribuite uniformemente sono essenziali per ottenere buoni risultati.Utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale e una cappa aspirante durante la preparazione dell'immagine di serializzazione. Assicurati di indossare occhiali protettivi specifici per le lunghezze d'onda quando lavori con i laser. Altri metodi come crio ap, risonanza magnetica nucleare, possono fornire dettagli strutturali a livello atomico.Queste informazioni sono parte integrante per la progettazione e l'interpretazione degli esperimenti FRET a singola molecola. La fret a singola molecola apre nuove opinioni nel campo della replicazione del DNA con conseguente comprensione più profonda dei meccanismi delle azioni elicasi e nucleasi.

Research

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Genetics

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The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificare le mutazioni con lo scioglimento ad alta risoluzione in una popolazione di riso TILLING

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Trasformazione, editing del genoma e fenotipizzazione dell'azoto-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Indagine sul ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 di CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein acuta

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Sistema di espressione plasmide controllato da Transcriopzionalmente per l'analisi della stabilità delle trascrizioni dell'mRNA nelle cellule epiteliali primarie

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...