Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
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この研究は、中核的な資金と競争研究賞(CRG3)を通じて、科学技術のキング・アブドゥラ大学によってS.M.H.に支援されました。

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

本研究では、GEN130によるHJ分解能の運動性を決定するために、異なるsmFRET技術を実施した。同様のsmFRETアプローチは、DNA複製および修復フラップエンドヌクレアーゼ142、43、44によるダブルフラップDNA立体構造要件および切断に従うために使用された。ここでは、このプロトコルの重要な手順について説明します。サイレン化反応は、湿度の任意の痕跡から自由でなければなりません。PEGを溶解すると、加水分解を避けるために、ペグレーション溶液をシラン化ガラスに迅速に適用する必要があります。マルチチャネルフローセルでは、隣接するチャネル間の漏れを避けるために、粘着シートに閉じ込められた空気を除去する必要があります。PCA溶液は、時間の経過とともに酸化するので、新鮮に調製する必要があります。10 N NaOH の添加は、その間に渦を伴って、ドロップワイズする必要があります。カバースリップ中の蛍光背景は、蛍光標識HJを流す前に最小限にする必要があります。フローセル内のイメージングは、漂白領域のイメージングを避けるために一方向に行われるべきである。ALEX実験では、アクセプターの急速な漂白を避けるために、赤色レーザーのパワーを低減する必要があります。タイムラプス実験では、サイクルタイムは最速のイベントよりも短くする必要があります。
smFRETは、生体分子反応に貴重なリアルタイムの洞察を提供できる敏感な技術です。しかし、この方法にはいくつかの技術的な課題があり、その中で生化学反応中のFRETの測定可能な変化を達成しています。これは、ヒストグラムとタイム トレースで区別可能な状態で十分に分離されたフィーチャを取得するために必要です。多くの場合、smFRETは基板の慎重な設計、蛍敵対とその位置の選択、および基板45の構造変化が小さいためDNA基板におけるFRET変化の増幅を必要とする。FRETを実行するためのもう一つのアプローチは、標識タンパク質46を使用することです。FRETの観察ウィンドウは、ドナーよりも急速に漂白する傾向があるCy5またはAlexa Fluor 647などのアクセプタの安定性によって制限されます(この場合はCy3)。したがって、FRETは、実験期間を延長し、蛍光信号を延長し、信号対雑音比を最大化するための酸素清掃システムの開発に取り組むために、安定した蛍光素を継続的に検索する必要があります47,48.
smFRETのトラブルシューティングのヒントの中には、レーザーパワー、露光時間、サイクル時間、サイクル回数などのイメージングに関連するいくつかのパラメータのバランスをとって、蛍光放出を最大化し、実験期間を延長し、達成することです。酵素ダイナミクスのための適切なサンプリング間隔。酵素ダイナミクスを表す高忠実度の在り時間分布を得るためには、観察時間が長く、光漂白による影響を最小限に抑える必要があります。ALEXは、この方法は、単色FRETと比較して光漂白粒子からの低い寄与を受けるので、より良いヒストグラムを生成します。ただし、ALEX の時間分解能は、単色 FRET の場合よりも低くなります。
最後に、個々の分子の立体構造変化をリアルタイムで検出することに重点を置き、高分解能構造技術(X線結晶学、核磁気共鳴、電子顕微鏡検査)のギャップを埋め合わせ、これは、測定可能なプロパティのアンサンブル平均を生み出す静的条件とバルクメソッドの下で原子分解構造の詳細を提供します。多くの面で、smFRETは、リアルタイムで生物学的システムを研究するための強力な技術であることが証明されています。

蛍光検出に基づく単分子法は、高いシグナル対ノイズ比1を提供する。FRETは、1〜10nmの範囲で距離を測定できる分光技術であり、ナノメートル範囲2、3の距離を測定するための分子定規としてこの技術をレンダリングします。受け入れ器の吸収スペクトルは、より短い波長端におけるドナーの発光スペクトルと部分的なスペクトルが重なっている。FRETは、ドナーと受入者ペア間の放射線のないエネルギー伝達によって媒介されるが、エネルギー伝達の効率は、インセプタ4の距離および向きに依存する。
背景を最小限に抑え、蛍光シグナル5,6の検出効率を向上させるためにいくつかのアプローチが実装されている。1つのアプローチは、ピンホールが回折限界7以下のサイズに励起スポットを制限する共焦点顕微鏡です。もう1つのアプローチは、光が臨界角度8の上に軸を外に向ける広視野照明技術である全内部反射蛍光(TIRF)である。その後、光はガラスと水溶液の間の界面に完全に内部的に反射され、ガラス表面に取り付けられた蛍光色素のみを照らし、残りの部分の蛍光色素からの背景を防ぐエバネッセント波を生成します。解決策。
共焦点顕微鏡検査では、分子は自由に拡散または表面固定化することができる。達成された時間分解能は、マイクロ秒から数ミリ秒9までです。単一分子の共焦点検出は、単一光子雪崩ダイオード(SPAD)および対象領域10のポイントバイポイントスキャンによって行われる。TIRFでは、表面に固定された数百の分子の時系列が位置感受性2次元電荷結合検出器(CCD)によって記録される。CCDは、蛍光信号を蛍光信号を増強蛍光スクリーンおよびマイクロチャネルプレートまたは光電子(EMCCD)のオンチップ増殖によって増幅します。時間分解能は、CCD の読み出し速度と量子効率に依存し、通常は数十ミリ秒6の順序で行われます。
HJはDNA修復および組み換え11、12、13、14の中枢中間体である。HJには、互いに交差することなく連続ストランド間を接続する2本の連続鎖と2本の交差ストランドがあります。HJはX積層コンフォーマとして溶液中に存在し、連続鎖が交差し、交差ストランドが他のコンフォーマ15で連続的になることによって連続的な逆性化を受ける。HJの異性愛好はコア配列およびイオン環境に依存し、FRET16、17、18、19によって広範囲に研究されている。
GEN120は、溶液21中の単量体タンパク質であり、HJを切り離すために二量体化を必要とし、したがって再結合鎖22、23の適切な分離を可能にする。HJのスタッキングコンフォーマの好みは、HJ解決24による分解能の向きを設定することによって遺伝的組み換えの結果に影響を与える。GEN1がどのようにHJを結合するかを理解し、2つの切開部を調整し、その完全な解像度がすべて集中的な研究の下にあることを保証する21、22、23、25、26 ,27,28,29,30.
本研究では、前述の31として、目的ベースのTIRFセットアップを使用する。2色交流励起(ALEX)は、GEN1と標識されたHJとの相互作用に基づく立体構造変化を決定するために適用される。ALEXは、ドナー受入者距離依存である2つのレシオメトリックパラメータFRET効率Eと、ドナー受症体検血32を測定するストイチオメトリーパラメータSに基づいて2Dヒストグラムを生成する。ALEXは、ドナーのみ、受け入れ者のみ、混合亜集団を含む蛍光色素のストイチオメトリーに基づいて蛍光種の選別を可能にする。ALEXは、FRETの使用を全範囲に拡張することができ、蛍光素明るさとオリゴマー化の違いを検出できるだけでなく、高分子リガンド相互作用33を監視することができます。
GEN1複合体の寿命内で一貫してHJの解決に成功していることがわかった。時間依存的な立体構造の変化は、個々の分子の時間トレースに由来し、ヒストグラムは基礎となる集団の分布を表します。タイムラプスシングルカラーFRETを使用して、GEN1ダイマーの高速オンレートとスローオフレートが実証され、最初の切開製品で組み立てられたGEN1ダイマーの親和性が向上します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

バルク法は分子のアンサンブル挙動を測定し、基礎となるステップの個々の反応速度が母集団全体で平均化される。単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)は、個々の分子によって起こる立体構造変化をリアルタイムで記録します。したがって、smFRETは結合および触媒の間に酵素または基板の構造変化を測定する上で強力である。本研究では、サイトソール同義語組換え酵素である4ウェイホリデイ接合部(HJ)とギャップエンドヌクレアーゼI(GEN1)の相互作用を単分子イメージングするためのプロトコルを提示する。また、GEN1によるHJの分解能をリアルタイムで踏襲する単色および2色交互励起(ALEX)smFRET実験プロトコルも提示される。GEN1二量化の運動学は、HJの解決に重要な役割を果たすることが示唆され、これまで解明されていないHJで決定される。ここで説明する技術は、多くの酵素DNA系の貴重な機械的洞察を得るために広く適用することができる。

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Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

ここで提示されるのは、HJ分解能を研究するために単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達を行うためのプロトコルである。解離定数を決定するために、2 色交互励起が使用されます。シングルカラータイムラプスsmFRETは、リアルタイム切断アッセイに適用され、HJ分解能の前にドウェル時間分布を得ます。

GEN1によるホリデイ接合分解能のリアルタイム調査のための単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達法

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

このプロトコルにより、単一分子レベルおよび他の酵素系におけるフラップエンドヌクレアーゼ1による相互作用ダイナミクスとホリデイ接合の分解能を監視することができます。まあ、いくつかは分子集団全体を平均するか、基礎となる個々の機械化ステップを確保し、あります。単一分子法は、個々の分子のリアルタイム挙動をモニタリングすることにより、これらの詳細を提供する。単一分子法は、ピコおよびナノモル範囲における生体分子相互作用を高い特異性で効率的に検出することができる。これは、診断、ゲノムシーケンシング、センシングにおける多くの実用的なソリューションに便利です。光学的および強制測定の単一分子法は物理学、化学、生物学に広く適用され、他の方法ではアクセスできない高貴な観察を提供することが証明されている。初めてのユーザーへの私のアドバイスは、このプロトコルでレイアウトされた詳細な手順に密接に従う必要があります。このプロトコルの実践的な手順を視覚的に示すと、この手法の実装が成功します。単一の流路の流れセルを準備するには、中心が37ミリメートル離れていて、スライドの端から6.5ミリメートルの50×20ミリメートルの石英スライドの中央部に2つの1.22ミリメートルの直径の穴を掘削することから始めます。電子カッターを使用して、41を2.25ミリメートルのチャネルを2倍粘着シートの50ミリメートルに切り、保護カバーのプラスチック側を剥がします。ピースの端を石英スライドの端に合わせ、ポリテトラフルオロエチレンピンセットを使用して、閉じ込められた気泡を静かに取り除きます。粘着片の紙側を剥がし、カバースリップの機能面に取り付けます。次に、内径1.22ミリメートルのポリエチレンチューブを入口の11センチメートルの長さに、チューブの1つを25センチメートルに切ります。次に、フローセルの入口と出口チューブとして、以前に掘削された穴にチューブを挿入します。そして、入口および出口管の石英カバースリップインターフェイスの端を密封するために5分のエポキシ接着剤を使用する。細胞が乾燥したら、1ミリメートルシリンジを使用して、PBS中の0.03ミリグラムのフィルター0.03ミリグラムを細胞に洗浄し、バッファーだけで満たされた第2シリンジを使用して、増殖の終わりに余分なアビジンを洗い流します。単色FRET実験を行う場合は、まず1滴の浸漬油を全100倍の内部反射蛍光目標に適用し、光電子のオンチップ乗算を適切なゲインに設定して、バックグラウンドへの信号を最適化し、飽和を防ぎます。慎重にフローセルをサンプルホルダーに置き、コース調整を使用して、オイルがカバースリップに触れるまで徐々に目標を上げます。532ナノメートルのレーザーをオンにし、目的の微調整モードに切り替えます。カメラポートに放出を向けてモニター上の画像を観察し、カバースリップの機能面が焦点に合わせ、モニターで観察できるまで、目的の高さを調整します。カバースリップの機能面からの背景が蛍光標識されたHJで流れる前に、いくつかのスポットを超えていないことを確認してください。システムが0.5ミリリットルのチューブに酸素清掃システムとイメージングバッファの120マイクロリットルに関心のある希釈された基質の0.2〜0.5マイクロリットルで準備が整うと、スポイトポンプに遅い電池の出口を接続します。入口チューブを1.5ミリリットルチューブに挿入し、1分あたり30〜50マイクロリットルでシリンジポンプを開始し、チューブから溶液を引き出します。緑色のレーザーで表面を短時間画像化し、均質に分散した十分な間隔の基板の100~300個の粒子でセルの良好な被覆を確認します。フローセル表面が十分に覆われている場合は、1分間に30〜50マイクロリットルのイメージングバッファの別の120マイクロリットルを洗い流し、非結合のHJを洗い流し、フローセルを5分間座らせ、酸素スカベリングシステムが溶存酸素を枯渇させます。露出時間を約 60 ミリ秒に設定します。サイクル時間は、データ転送の速度に基づいてソフトウェアによって自動的に設定されます。必要なサイクル数またはフレーム数を約 400 に指定します。ドナーおよびアクセプター蛍光色素からの放出は、画像スプリッタデバイスによってカラーチャネルに分割される。表面上の適切な領域を選択し、画像に焦点を合わせて記録し、16ビットのTIFF形式で映画を保存するために目的の高さを調整します。次に、新しいエリアに移動します。1分間の流量30マイクロリットル、一度に1つの濃度でGEN1の示された濃度を補うイメージングバッファの120マイクロリットルでセルを洗い流します。HJ切断実験の解像度では、流量を毎分110マイクロリットルに調整し、酵素がフローセルに入る5~10秒前に記録を開始します。酵素がフローセルに入射する前に5~10秒開始すると、イベント数が最大になります。すべての濃度をテストしたら、固定蛍光ビーズスライドを使用して、画像分割装置内のドナー粒子とアクセプター粒子を互いにマッピングします。変換マトリックスを生成するために適切なソフトウェアパッケージをインストールした後、記録されたビーズスライドムービーを開き、ドナーとアクセクサチャネル内の個々のビーズの位置を選択します。固定ビード スライドからマトリックスが生成されたら、[TFORM を読み込む] をクリックし、変換マトリックス ファイルを選択します。チャネル フィルタのドロップダウン メニューで、[D&A]オプションをクリックして、ドナーとアクセプタの両方でラベル付けされたパーティクルを選択します。次に、マニュアルで指示に従って plotTimetraceCW と入力し、各分子の時間トレースを生成します。ALEX FRET実験を行うために、緑色と赤のレーザーで直接励起して、ドナーとアクセプターの放出の連続したフレームで構成される映画を記録します。取得したALEXムービーを開き、ドナー励起、ドナー励起によるアクセクサ放出、および直接励起チャネルによるアクセクサ放出によるドナー放出のそれぞれについて、約300に適切な検出閾値を設定します。適切なチャネルフィルタを適用して、ドナーとアクセクサの両方であったパーティクルを選択し、3 つのチャネルのそれぞれで 200 ~ 300 個のパーティクルをリンクします。plotHistALEX MATLAB コードを使用して、ヒストグラムの関数に異なるピークに適合する ALEX ヒストグラムを生成し、適切なグラフ作成と解析プログラムを使用して、各母集団の曲線下の面積の割合を決定します。次に、plotTimetraceALEX MATLABコードを使用して、FRETおよび直接励起によるアクセプター放射における直接励起によるドナー放出を示す各分子の時間トレースを生成する。隣接ラベルX-0のこの代表的な交振FRETヒストグラムは、より豊富で少ない異性体の交換に対応する2つのピークを示す。異性体のドウェル時間ヒストグラムから得られる異性化率は、以前に報告されたものと一致する。ALEXによって獲得された異なるGEN1濃度で隣接するラベルX-0接合の単一分子FRETヒストグラムは、低FRETピークからあまり豊富でない異性体の寄与を差し引いた後、結合したHJ集団に対応する遊離高FRET異性体に対応する1つのピークおよび1つのピークを明らかにする。飽和GEN1濃度では、X-0のFRETヒストグラムは、モデルによって予測されるように、HJのいずれかの異性体に結合するGEN1に対応する単一の低FRETピークのみを有する。Gen1モノマーとHJへの結合に続くダイマー形成は、溶液中の二量体状に存在する原核生物レゾールバセと比較して真核生物HJレゾワドGEN1のユニークな特徴である。GEN1モノマーがHJに結合して歪曲するというさらなる証拠は、低GEN1濃度でのマグネシウムの存在下で安定な低FRET状態の無切断粒子の微量のかなりの数の観察である。中間体の出現なしに起こる解決されたX-0の痕跡の安定した低FRET状態の後のドナーおよびアクセクサの同時出発は、GEN1 HJ複合体の寿命内で完全な解決が起こることを示す。機能化ガラス表面からの背景は、いくつかのスポットを超えてはならないと、均一に分布粒子は、良好な結果を得るために不可欠であることに注意してください。シリアル化画像を準備する間は、常に個人用保護具とヒュームフードを使用してください。レーザーを使用する場合は、波長に固有の保護メガネを着用してください。クライオap、核磁気共鳴などの他の方法は、原子レベルの構造詳細を提供することができる。この情報は、単一分子FRET実験の設計と解釈に不可欠です。単一分子FRETは、DNA複製の分野で新たな見解を開き、ヘリカーゼおよびヌクレアーゼの作用メカニズムを深く理解する。

Research

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Genetics

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