Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
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이 작품은 핵심 자금 및 경쟁 연구 상을 통해 과학 기술의 왕 압둘라 대학에 의해 지원되었다 (CRG3) S. M. H.

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

본 연구에서는 GEN130에의한 HJ 분해능의 역학을 결정하기 위해 다양한 smFRET 기술이 구현되었다. 유사한 smFRET 접근법은 DNA 복제 및 수리 플랩 엔도너플레제 142,43,44에의한 이중 플랩 DNA 형태 요건 및 절단을 따르기 위해 사용되었다. 여기서는 이 프로토콜의 중요한 단계에 대해 설명합니다. 실란화 반응은 습도의 흔적이 없어야합니다. PEG가 용해되면 가분해를 피하기 위해 실란화 유리에 페질화 용액을 신속하게 적용해야합니다. 다중 채널 유동 셀에서 접착 시트에 갇힌 공기를 제거하여 인접 채널 간의 누설을 방지해야 합니다. PCA 용액은 시간이 지남에 따라 산화되기 때문에 신선하게 준비되어야합니다. 10 N NaOH를 추가하는 것은 그 사이에 소용돌이가 있는 드롭와이즈여야 합니다. 커버 슬립의 형광 배경은 형광으로 표시된 HJ를 흐르기 전에 최소화되어야 합니다. 유동 세포에 있는 화상 진찰은 화상 진찰 표백한 지역을 피하기 위하여 한 방향으로 수행되어야 합니다. ALEX 실험에서, 수용자의 급속한 표백을 피하기 위해 적색 레이저의 힘을 감소시켜야 한다. 시간 경과 실험에서 주기 시간은 가장 빠른 이벤트보다 짧아야 합니다.
smFRET는 생체 분자 반응에 귀중한 실시간 통찰력을 제공 할 수있는 민감한 기술입니다. 그러나, 이 방법은 생화확적인 반응 도중 FRET에 있는 측정 가능한 변경을 달성하는 중 몇몇 기술적인 도전이 있습니다. 이것은 히스토그램과 시간 추적에서 구별 가능한 상태에서 잘 분리 된 기능을 얻는 데 필요합니다. 많은 경우에, smFRET는기판(45)의작은 구조적 변화로 인해 기판의 신중한 설계, 형광부 쌍 및 이들의 위치의 선택, DNA 기판에서의 FRET 변화의 증폭을 필요로 한다. FRET를 수행하기 위한 또 다른 접근법은 표지된 단백질46을사용하는 것입니다. FRET에서의 관찰 창은 기증자(Cy3)보다 더 빠르게 표백하는 경향이 있는 Cy5 또는 Alexa Fluor 647과 같은 수용자의 안정성에 의해 제한된다. 따라서, FRET는 형광 신호를 연장하고 신호 대 잡음 비47,48을 최대화하기 위해 산소 제거 시스템을 개발하기 위한 실험 지속 기간 및 개발 노력을 연장하기 위해 안정적인 형광체에 대한 지속적인 검색을 필요로 한다. .
smFRET에서 문제 해결을 위한 팁 중에는 레이저 파워, 노출 시간, 사이클 시간 및 사이클 수와 같은 이미징과 관련된 여러 매개 변수의 균형을 맞추어 형광 방출을 최대화하고 실험 기간을 연장하며 달성합니다. 효소 역학에 대한 적절한 샘플링 간격을 정합니다. 효소 역학을 나타내는 고충실도 의 거침상 분포를 얻기 위해서는 관찰 시간이 길어지고 광표백으로 인한 최소한의 효과가 필수적입니다. ALEX는 이 방법이 단일 색상 FRET에 비해 광표백 입자의 기여도가 낮기 때문에 더 나은 히스토그램을 생성합니다. 그러나 ALEX의 시간 해상도는 단일 색상 FRET의 해상도보다 낮습니다.
마지막으로, 개별 분자의 형태/구조적 변화를 실시간으로 감지하는 데 중점을 두는 smFRET는 고해상도 구조 기술(즉, X선 결정학, 핵 자기 공명, 전자 현미경 검사법) 사이의 격차를 해소합니다. 측정 가능한 속성의 앙상블 평균을 산출하는 정적 조건 및 벌크 방법하에서 원자 분해능 구조 세부 사항을 제공합니다. 많은 양상에서, smFRET는 실시간으로 생물학 시스템을 공부하기위한 강력한 기술로 입증되었습니다.

형광 검출에 기초한 단일 분자 방법은 높은 신호 대 잡음 비율1을제공합니다. FRET는 1-10 nm 범위의 거리를 측정할 수 있는 분광 기술로, 이 기술을 나노미터 범위2,3에서거리를 측정하기 위한 분자 눈금자로 렌더링합니다. 수용자의 흡수 스펙트럼은 더 짧은 파장 단부에서 공자의 방출 스펙트럼과 부분적인 스펙트럼 중첩을 가한다. FRET는 공여자와 수락자 쌍 사이의 방사선이 없는 에너지 전달에 의해 매개되는 반면, 에너지 전달의 효율은 수용자4의거리 및 방향에 의존한다.
배경을 최소화하고 형광 신호5,6의검출 효율을 향상시키기 위해 여러 가지 접근법이 구현되었습니다. 한 가지 접근법은 공초점 현미경 검사법으로, 핀홀이 여기 지점을 회절 한계7이하의 크기로 제한합니다. 또 다른 접근법은 총 내부 반사 형광(TIRF)이며, 이는 빛이 임계 각8위의 오프축을 향하는 광시야 조명 기술이다. 빛은 유리와 수성 용액 사이의 인터페이스에 완전히 내부적으로 반사되어 유리 표면에 부착 된 형광단만 을 비추고 나머지 부분에서 형광로호르의 배경을 방지하는 전도파를 생성합니다. 솔루션.
공초점 현미경 검사법에서, 분자는 자유롭게 확산되거나 표면 고정될 수 있습니다. 달성된 시간적 해상도는 마이크로초에서 몇 밀리초9이내일 수 있습니다. 단일 분자에 대한 공초점 검출은 관심 영역의 단일 광자 눈사태 다이오드(SPAD) 및 점별 스캐닝에 의해 수행된다10. TIRF에서 표면에 고정된 수백 개의 분자의 타임시리즈는 위치 민감도 2차원 전하 결합 검출기(CCD)에 의해 기록됩니다. CCD는 강화된 형광체 스크린 및 마이크로채널 플레이트 또는 광전자(EMCCD)의 온칩 증식에 의해 형광 신호를 증폭시됩니다. 시간적 해상도는 CCD의 판독 속도 및 양자 효율에 따라 달라지며 일반적으로 수십 밀리초6의순서로 달라집니다.
HJ는 DNA 수리 및 재결합11,12,13,14의중앙 중간체이다. HJ는 서로 교차하지 않고 연속 가닥 간에 연결되는 두 개의 연속 및 2개의 교차 가닥을 가지고 있습니다. HJ는 X-스택 응체로서 용액에 존재하며, 이는 연속 가닥이 교차되고 교차 가닥이 다른컨포머(15)에서연속되는 것에 의해 연속적인 이소성화를 겪는다. HJ의 이소머 선호도는 코어 서열 및 이온 환경에 의존하며 FRET16,17,18,19에의해 광범위하게 연구되었다.
GEN120은 용액21에서 단모성 단백질이며 HJ를 갈라기 위해 이량화가 필요하므로 재결합 된 가닥22,23의적절한 분리를 허용합니다. HJ의 스태킹 컨포머 선호도는 HJ resolvases24에의한 해상도의 방향을 설정하여 유전 재결합의 결과에 영향을 미칩니다. GEN1이 HJ를 결합하고, 두 절개를 조정하고, 전체 해상도가 모두 집중적 인 연구21,22,23,25,26을 받고 있는지 이해 ,27,28,29,30.
이 연구에서는, 앞서31에설명된 바와 같이 객관적인 기반 TIRF 설정이 사용된다. 2색 교대로 여기(ALEX)를 적용하여 Gen1과 HJ라벨이 부착된 형광포와의 상호작용시 형태 변화를 결정합니다. ALEX는 2개의 비율 메트릭 파라미터 FRET 효율 E, 이는 공여체-수용자 거리 의존성, 및 공여체-수용기 stoichiometry32를측정하는 stoichiometry 파라미터 S를 기반으로 2D 히스토그램을 생성한다. ALEX는 기증자 전용, 수용자 전용 및 혼합 하위 집단을 포함하여 형광단의 stoichiometries에 근거를 둔 형광 종의 분류를 가능하게 합니다. ALEX는 전체 범위로 FRET의 사용을 확장할 수 있으며 형광부 밝기 및 올리고머화의 차이를 감지할 수 있을 뿐만 아니라 거대분자-리간드상호작용(33)을모니터링할 수 있다.
GEN1은 GEN1-HJ 복합체의 수명 내에서 HJ를 해결하는 데 지속적으로 성공한 것으로 나타났습니다. 히스토그램은 근본적인 인구의 분포를 나타내는 동안 시간 의존하는 형태 변화는 개별 분자의 시간 추적에서 파생됩니다. 타임랩스 단색 FRET를 사용하여 GEN1 디머에 대한 빠른 온레이트와 느린 오프레이트가 입증되어 첫 절개 제품에서 조립된 GEN1 디머의 친화도를 증가시킴을 유발합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

벌크 방법은 분자의 앙상블 거동을 측정하며, 이 때 기본 단계의 개별 반응 률은 인구 전체에 걸쳐 평균화됩니다. 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달 (smFRET)은 실시간으로 개별 분자에 의해 일어나는 형태 변화의 기록을 제공합니다. 따라서, smFRET는 결합 및 촉매 동안 효소 또는 기판의 구조적 변화를 측정하는데 강력하다. 이 작품은 세포질 상동 재조합 효소인 4방향 홀리데이 접합부(HJ) 및 갭 엔도누클로스 I(GEN1)의 상호작용의 단일 분자 이미징을 위한 프로토콜을 제시한다. 또한 GEN1에 의한 HJ의 분해를 실시간으로 따르기 위한 단색 및 2색 교류(ALEX) smFRET 실험 프로토콜이 제시된다. GEN1 이량화의 역학은 HJ의 해결에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 건의된 HJ에서 결정되고 지금까지 애매하게 남아 있습니다. 여기에 기술된 기술은 많은 효소 DNA 시스템의 귀중한 기계론적 통찰력을 얻기 위하여 넓게 적용될 수 있습니다.

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Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

여기서 제시된 것은 HJ 분해능을 연구하기 위해 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달을 수행하기 위한 프로토콜이다. 2색 교대 여기는 해리 상수를 결정하는 데 사용됩니다. 단색 시간 경과 smFRET는 HJ 분해 전에 거주 시간 분포를 얻기 위해 실시간 절단 분석에 적용된다.

GEN1에 의한 홀리데이 정션 분해능의 실시간 조사를 위한 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 방법

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

이 프로토콜을 사용하면 단일 분자 수준 및 기타 효소 시스템에서 플랩 엔도넥션 1에 의해 상호 작용 역학 및 홀리데이 접합의 해상도를 모니터링할 수 있습니다. 음, 일부는 분자 인구 전반에 걸쳐 평균 또는 기본 개별 기계화 단계를 확보하고있다. 단일 분자 방법은 개별 분자의 실시간 거동을 모니터링하여 이러한 세부 사항을 제공합니다.단일 분자 방법은 높은 특이성을 가진 피코 및 나노 몰라 범위에서 생체 분자 상호 작용을 효율적으로 검출할 수 있습니다. 이는 진단, 게놈 시퀀싱 및 감지에 있어 많은 실용적인 솔루션에 유용합니다. 광학 및 강제 측정 단일 분자 방법은 물리학, 화학 및 생물학에 널리 적용되며 다른 방법으로는 접근 할 수없는 고귀한 관찰을 제공하는 것으로 입증되었습니다.처음 사용자에게 내 조언은 밀접하게이 프로토콜에 배치 된 세부 단계를 따르는 것입니다. 이 프로토콜의 실습 절차의 시각적 그림은 기술의 성공적인 구현으로 이어질 것입니다. 단일 채널 흐름 셀을 준비하려면 50 x 20mm 쿼츠 슬라이드의 중간 부분에 있는 2개의 1.22mm 직경 구멍과 중앙 37밀리미터, 슬라이드 가장자리에서 6.5밀리미터를 드릴링하는 것으로 시작합니다.전자 커터를 사용하여 41 x 2.25 밀리미터 채널을 이중 접착 시트의 50 x 20 mm 조각으로 자르고 보호 커버의 플라스틱 면을 벗겨냅니다. 곡의 가장자리를 석영 슬라이드의 가장자리와 정렬하고 폴리테트라플루오로틸렌 핀셋을 사용하여 갇힌 기포를 부드럽게 제거합니다. 접착제 조각의 종이 측면을 벗겨 커버 슬립의 기능화 표면에 조각을 장착합니다.다음으로, 입구의 경우 1.22밀리미터길이로 1.22밀리미터의 폴리에틸렌 튜빙 1장, 콘센트용 튜브 1장. 그런 다음 튜브를 유동 셀의 입구 및 출구 튜브로 이전에 뚫은 구멍에 삽입합니다. 그리고 5 분 에폭시 접착제를 사용하여 입구 및 출구 튜브에서 석영 커버 슬립 인터페이스의 가장자리를 밀봉하십시오.세포가 건조되면, 1 밀리미터 주사기를 사용하여 PBS에서 밀리리터 농도 avidin 당 0.03 밀리그램을 플러시하여 완충액으로 채워진 두 번째 주사기를 사용하여 주입의 끝에 있는 모든 과잉 아비딘을 씻어냅니다. 단일 컬러 FRET 실험을 수행하기 위해 먼저 1방울의 침지 오일을 총 내부 반사 형광 목표에 적용하고 광전자의 칩 곱셈을 적절한 이득으로 설정하여 배경에 신호를 최적화하고 채도를 방지합니다. 유동 셀을 샘플 홀더에 조심스럽게 배치하고 코스 조정을 사용하여 오일이 덮개 미끄러짐에 닿을 때까지 점차 목표를 높입니다.532 나노미터 레이저를 켜고 목표의 미세 조정 모드로 전환합니다. 카메라 포트에 방출을 지시하여 모니터의 이미지를 관찰하고 커버 슬립의 기능화 된 표면이 초점으로 가져와 모니터에서 관찰 될 때까지 목표의 높이를 조정합니다. 형광 라벨HJ에서 흐르기 전에 커버 슬립의 기능화 된 표면에서 배경이 몇 지점을 초과하지 않는지 확인합니다. 시스템이 0.2 에서 0.5 마이크로 리터의 희석 된 기판의 마이크로 리터를 산소 청소 시스템을 가진 이미징 버퍼 120 마이크로 리터로 0.5 밀리리터 튜브로 준비되고 느린 셀의 출구를 주사기 펌프에 연결합니다.입구 튜브를 1.5 밀리리터 튜브에 삽입하고 분당 30~50마이크로리터에서 주사기 펌프를 시작하여 튜브에서 용액을 인출합니다. 자주 녹색 레이저와 함께 표면을 잠시 이미지하여 균질적으로 분포된 잘 간격이 있는 기판의 100~300개의 입자로 셀의 좋은 커버리지를 확인합니다. 유동 세포 표면이 적절하게 덮여있는 경우, 분당 30 ~ 50 마이크로 리터의 이미징 버퍼를 추가로 플러시하여 결합되지 않은 HJ를 씻어 내고 유동 셀이 5 분 동안 앉아 산소 캐빙 시스템이 용존 산소를 고갈 할 수 있도록하십시오.노출 시간을 약 60밀리초로 설정합니다. 주기 시간은 데이터 전송 속도에 따라 소프트웨어에 의해 자동으로 설정됩니다. 원하는 사이클 또는 프레임 수를 약 400개로 지정합니다.기증자 및 수용자 형광에서 방출은 이미지 스플리터 장치에 의해 컬러 채널로 분할됩니다. 표면에 적합한 영역을 선택하고 목표 높이를 조정하여 이미지에 초점을 맞추고 영화를 16비트 티프 형식으로 저장합니다. 그런 다음 새 영역으로 이동합니다.분당 30 마이크로리터, 한 번에 하나의 농도로 GEN1의 표시 농도로 보충된 120마이크로리터의 이미징 버퍼로 세포를 플러시한다. HJ 분열 실험의 해상도에서, 분당 110 마이크로리터로 유량을 조정하고 유동 세포로 효소의 입구 5 ~10 초 전에 기록을 시작합니다. 유량 세포로 효소의 입구 5 ~10 초 전에 시작하는 화상 진찰은 사건의 수를 최대화합니다.모든 농도가 테스트된 경우 고정 형광 비드 슬라이드를 사용하여 이미지 분할 장치에서 기증자 및 수락기 입자를 서로 매핑합니다. 변환 매트릭스를 생성하기 위해 적절한 소프트웨어 패키지를 설치한 후 기록된 비드 슬라이드 동영상을 열고 기부자 및 수락자 채널에서 개별 구슬의 위치를 선택합니다. 고정 비드 슬라이드에서 매트릭스가 생성되면 TFORM로드를 클릭하고 변환 행렬 파일을 선택합니다.채널 필터 드롭다운 메뉴에서 D&A 옵션을 클릭하여 기증자와 수락자 로 표시된 파티클을 선택합니다. 그런 다음 설명서에서 지시한 대로 플롯TimetraceCW를 입력하여 각 분자에 대한 시간 추적을 생성합니다. ALEX FRET 실험을 수행하려면 녹색 및 빨간색 레이저로 직접 여기를 사용하여 기증자와 수용자 배출의 연속 프레임으로 구성된 영화를 녹화합니다.취득한 ALEX 영화를 열고 기증자 여기로 인한 기증자 배출, 기증자 여기로 인한 수락자 방출 및 직접 흥분 채널로 인한 수락자 방출로 인해 각 기증자 배출에 대해 약 300에 적합한 검출 임계값을 설정합니다. 적절한 채널 필터를 적용하여 기증자와 수락자였던 파티클을 선택하고 세 채널 각각에 각각 200~300개의 파티클을 연결합니다. 플롯히스트ALEX MATLAB 코드를 사용하여 히스토그램 의 함수에서 다른 피크를 피팅하는 ALEX 히스토그램을 생성하고 적절한 그래프 및 분석 프로그램을 사용하여 각 모집단의 곡선 아래 영역의 백분율을 결정합니다.그런 다음 플롯TimetraceALEX MATLAB 코드를 사용하여 FRET 및 직접 여기로 인한 수용자 배출에서 직접 여기에 의해 기증자 배출을 보여주는 각 분자에 대한 시간 추적을 생성합니다. 인접한 라벨 X-0의 대표적인 접대 FRET 히스토그램은 더 풍부하고 덜 풍부한 이소종의 상호 교환에 해당하는 두 개의 피크를 보여줍니다. 이소머의 Dwell 시간 히스토그램에서 얻은 이소성 화 비율은 이전에 보고된 것과 일치합니다.ALEX가 획득한 다른 GEN1 농도에서 인접한 라벨 X-0 접합의 단일 분자 FRET 히스토그램은 낮은 FRET 피크로부터 덜 풍부한 이좀러의 기여를 빼낸 후 HJ 집단에 대응하는 자유 고FRET 이소머 및 1개의 피크에 대응하는 하나의 피크를 나타낸다. 포화 GEN1 농도에서 X-0의 FRET 히스토그램은 모델에서 예측한 대로 HJ의 isomer에 결합된 GEN1에 해당하는 단일 낮은 FRET 피크만 을 갖는다. Gen1 단조체의 결합은 HJ에 대한 단조량체형성이 그 다음에 이량의 핵형성에 따른 고유의 특징이며, 용액의 희미한 형태로 존재하는 원핵류에 비해 진핵HJ 렐솔바제 GEN1의 독특한 특징이다.GEN1 단조량이 HJ를 결합하고 왜곡한다는 추가 증거는 낮은 GEN1 농도에서 마그네슘이 존재하는 안정적인 낮은 FRET 상태를 가진 삼촌 입자의 상당수의 흔적을 관찰하는 것이다. 중간체의 출현 없이 발생하는 해결된 X-0의 흔적에서 안정적인 낮은 FRET 상태 후 기증자 및 수용자의 동시 이탈은 GEN1 HJ 복합체의 수명 내에서 완전한 해상도가 발생한다는 것을 나타낸다. 기능화된 유리 표면의 배경은 몇 개의 반점을 초과해서는 안 되며 균등하게 분포된 입자는 좋은 결과를 얻기 위해 필수적입니다.직렬화 사진을 준비하는 동안 항상 개인 보호 장비와 연기 후드를 사용합니다. 레이저로 작업할 때 파장에 특색있는 보호 안경을 착용하십시오. 저저온압, 핵자기공명과 같은 다른 방법은 원자수준의 구조적 세부사항을 제공할 수 있다.이 정보는 단일 분자 FRET 실험의 설계 및 해석에 필수적입니다. 단일 분자 FRET는 DNA 복제 분야에서 새로운 견해를 열어 헬리케이스 및 뉴클레아제 의 메커니즘을 더 깊이 이해합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

연구

유전학

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

쌀의 경작 인구에서 고분해능 용융에 의한 돌연변이 식별

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

질소 고정 열대 카나바세아 나무 파라스포니아 앤더슨이 변형, 게놈 편집 및 현상형 화

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...