9.0K Views
•
11:27 min
•
September 18th, 2019
DOI :
September 18th, 2019
•0:04
Title
1:22
Flow Cell Preparation
3:01
Single-Molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) Experiments
6:25
Sm-FRET Data Analysis
7:10
Two-Color Alternating Excitation (ALEX) FRET Experiment and Analysis
8:24
Results: Representative Real-Time HJ Resolution Investigation
10:13
Conclusion
Transcript
Denne protokollen gjør det mulig for oss å overvåke interaksjonsdynamikken og oppløsningen av Holliday-krysset ved klaff endonuclease 1 på enkeltmolekylnivå og andre enzymatiske systemer. Vel, noen vil i snitt i hele den molekylære befolkningen eller sikrer de underliggende individuelle mekanistiske trinnene, og det er. Enkeltmolekylmetoder gir disse detaljene ved å overvåke sanntidsoppførselen til individuelle molekyler.
Enkeltmolekylmetoder kan effektivt oppdage biomolekylære interaksjoner i pico- og nanomolarområdet med høy spesifisitet. Som er nyttig for mange praktiske løsninger innen diagnostikk, genomsekvensering og sensing. Optiske og tvungen måling av enkeltmolekylmetoder er mye brukt i fysikk, kjemi og biologi og er bevist å gi edle observasjoner som er utilgjengelige ved andre metoder.
Mitt råd til førstegangsbrukere er å følge nøye de detaljerte trinnene som er beskrevet i denne protokollen. Visuelle illustrasjoner av praktiskprosedyren for denne protokollen vil føre til vellykket implementering av teknikken. For å forberede enkanals strømningscelle, begynn med å bore to hull med 1,22 millimeter diameter i den midterste delen av et 50 med 20 millimeter kvartssklie med sentrene 37 millimeter fra hverandre og 6,5 millimeter fra kanten av lysbildet.
Bruk en elektronisk kutter til å kutte en 41 med 2,25 millimeter kanal i en 50 med 20 millimeter stykke av et dobbelt klebemiddel ark og skrelle av plastsiden av beskyttelsesdekselet. Juster kantene på stykket etter kantene på kvartssklien og bruk et par polytetrafluoretylen pinsett for å forsiktig fjerne eventuelle fanget luftbobler. Skrell av papirsiden av klebemiddelstykket og monter stykket på den funksjonaliserte overflaten av en dekselslipp.
Deretter kutter du ett stykke polyetylenrør med en innvendig diameter på 1,22 millimeter til en 11 centimeter lang for innløpet og ett stykke rør til 25 centimeter for uttaket. Sett deretter rørene inn i de tidligere borede hullene som innløps- og utløpsrørene for strømningscellen. Og bruk fem minutters epoksylim for å forsegle kantene på kvartsdekselet slip grensesnitt i innløp og utløpsrør.
Når cellen har tørket, bruk en 1 millimeter sprøyte til å skylle 0,2 mikrometer filtrert 0,03 mg per milliliter konsentrasjon avidin i PBS inn i cellen ved hjelp av en annen sprøyte fylt med buffer alene for å vaske ut overflødig avidin på slutten av overfloden. For å utføre et ENGANGS-farge FRET eksperiment, først bruke en dråpe nedsenking olje på en 100 ganger total intern refleksjon fluorescens mål og sette på chip multiplikasjon av fotoelektroner til en passende gevinst for å optimalisere signalet til bakgrunnen og for å hindre metning. Plasser strømningscellen forsiktig på prøveholderen, og bruk kursjustering for gradvis å heve målet til oljen berører dekselet slip.
Slå på 532 nanometer laser og bytt til fin justering modus av målet. Rett utslippet til kameraporten for å observere bildet på skjermen og justere høyden på målet til den funksjonaliserte overflaten av dekselet slip er brakt i fokus og kan observeres på skjermen. Kontroller at bakgrunnen fra den funksjonaliserte overflaten av dekselet glir ikke overstiger få flekker før den flyter i fluorescerende merket HJ. Når systemet er klart til 0,2 til 0,5 mikroliter av det fortynnede substratet av interesse i 120 mikroliter av bildebuffer med oksygen scavenging system i en 0,5 milliliter rør og koble utløpet av den langsomme cellen til en sprøytepumpe.
Sett inn innløpsrøret i røret på 1,5 milliliter, og start sprøytepumpen med en 30 til 50 mikroliter per minutt for å trekke oppløsningen ut av røret. Avbild ofte overflaten kort med den grønne laseren for å bekrefte en god dekning av cellen med 100 til 300 partikler av homogent fordelt, godt fordelt substrat. Hvis strømningscelleoverflaten er tilstrekkelig dekket, skyll ytterligere 120 mikroliter av bildebuffer ved 30 til 50 mikroliter per minutt for å vaske bort eventuelle ubundet HJ og la strømningscellen sitte i 5 minutter for å la oksygenskravagingssystemet tømme oppløst oksygen.
Sett eksponeringstiden til ca. 60 millisekunder. Syklustiden angis automatisk av programvaren basert på hastigheten på dataoverføring. Angi ønsket antall sykluser eller rammer til ca. 400.
Utslippet fra donor og acceptor fluorophores er delt inn i fargekanaler av en bildesplitterenhet. Velg et passende område på overflaten, juster høyden på målet for å fokusere bildet og ta opp og lagre filmen i 16-biters tiff-format. Deretter flytter du til et nytt område.
Skyll cellen med 120 mikroliter bildebuffer supplert med de angitte konsentrasjonene av GEN1 med en strømningshastighet på 30 mikroliter per minutt, én konsentrasjon om gangen. I oppløsningen av HJ cleavage eksperimentet, justere strømningshastigheten til 110 mikroliter per minutt og starte opptaket 5 til 10 sekunder før inngangen til enzymet inn i strømningscellen. bildet for å starte 5 til 10 sekunder før inngangen til enzymet inn i strømningscellen vil maksimere antall hendelser.
Når alle konsentrasjonene er testet, bruk et fast fluorescerende perlelysbilde for å kartlegge donor- og acceptorpartiklene til hverandre i bildesplittingsenheten. Etter å ha installert riktig programvarepakke for å generere en transformasjonsmatrise, åpner du den innspilte perlelysbildefilmen og velger posisjonene til de enkelte perlene i donor- og acceptorkanalene. Når matrisen er generert fra det faste perlelysbildet, klikker du Last inn TFORM og velger transformasjonsmatrisefilen.
I rullegardinmenyen for kanalfilter klikker du på D&A-alternativet for å velge for partikler merket med både donor og acceptor. Deretter skriver du inn plotTimetraceCW som instruert i håndboken for å generere tidsspor for hvert molekyl. For å utføre et ALEX FRET-eksperiment, ta opp en film bestående av påfølgende rammer av donor og akseptorutslipp ved direkte eksitater med de grønne og røde laserne.
Åpne de oppkjøpte ALEX-filmene og sett den passende deteksjonsterskelen på ca. 300 for hvert av donorutslippene på grunn av donoresitering, akseptorutslipp på grunn av donoresitering og akseptorutslipp på grunn av de direkte eksitasjonskanalene. Påfør de riktige kanalfiltrene for å velge for partiklene som har vært både donor og acceptor og koble 200 til 300 partikler i hver av de tre kanalene. Bruk plotHistALEX MATLAB-koden til å generere ALEX histogrammer som passer til forskjellige topper i histogrammets funksjoner og bruk et passende graf- og analyseprogram for å bestemme prosentandelen av området under kurven for hver befolkning.
Bruk deretter plotTimetraceALEX MATLAB-koden til å generere et tidsspor for hvert molekyl som viser donorutslippet ved direkte eksitasjon i acceptorutslippene på grunn av FRET og direkte eksitasjon. Denne representative vekslende eksitasjon FRET histogrammet av tilstøtende etikett X-0 viser to topper som tilsvarer utveksling av de mer rikelig og mindre rikelig isomers. Isomerization priser hentet fra Dwell tid histogrammer av isomers er i samsvar med de rapportert tidligere.
Enkeltmolekyl FRET histogrammer av den tilstøtende etiketten X-0 krysset ved forskjellige GEN1 konsentrasjoner ervervet av ALEX, avslører en topp som tilsvarer den frie høye FRET isomer og en topp som tilsvarer den bundne HJ befolkningen etter å trekke bidraget fra mindre rikelig isomer fra den lave FRET toppen. Ved en mettende GEN1-konsentrasjon har FRET histogrammet av X-0 bare en enkelt lav FRET-topp som tilsvarer GEN1 bundet til enten isomer av HJ som spådd av modellen. Bindingen av GEN1 monomer til HJ etterfulgt av dimer formasjon er et unikt trekk ved eukaryotiske HJ resolvase GEN1 sammenlignet med prokaryotiske løseaser som finnes i dimerisk form i løsning.
Ytterligere bevis på at GEN1 monomer binder og forvrenger HJ er observasjon av et betydelig antall spor av urene partikler med en stabil lav FRET-tilstand i nærvær av magnesium ved lave GEN1-konsentrasjoner. Samtidig avgang av donor og acceptor etter en stabil lav FRET tilstand i spor av løst X-0 som oppstår uten fremveksten av en mellomliggende indikerer at en fullstendig oppløsning oppstår i løpet av levetiden til GEN1 HJ kompleks. Legg merke til at bakgrunnen fra den funksjonaliserte glassoverflaten ikke bør overstige noen få flekker, og at jevnt fordelte partikler er avgjørende for å oppnå gode resultater.
Bruk alltid personlig verneutstyr og en røykhette mens du forbereder serialiseringsbildet. Pass på å bruke vernebriller som er spesifikke for bølgelengdene når du arbeider med lasere. Andre metoder som cryo ap, kjernemagnetisk resonans, kan gi atomnivå strukturelle detaljer.
Denne informasjonen er integrert for design og tolkning av enkeltmolekylet FRET eksperimenter. Enkeltmolekyl FRET åpner nye synspunkter innen DNA-replikering som resulterer i dypere forståelse av mekanismene for handlinger helikikaser og kjerner.
Presentert her er en protokoll for å utføre enkelt-molekyl Förster resonans energi overføring til å studere HJ oppløsning. To fargers vekslende eksitasjon brukes til å bestemme dissosiasjon konstanter. Single-Color tid forfalle smFRET blir deretter brukt i sanntid kløft analyser for å få bo tids fordelingen før HJ oppløsning.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved