Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
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Este trabalho foi apoiado pela Universidade de ciência e tecnologia do Rei Abdullah através do financiamento principal e do prêmio de pesquisa competitiva (CRG3) para S. M. H.

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Neste estudo, diferentes técnicas de smFRET foram implementadas para determinar a cinética da resolução HJ por GEN130. As aproximações similares de smfret foram usadas para seguir a exigência conformacional do ADN da dobro-aleta e clivagem pela réplica do ADN e pela aleta do reparo endonuclease 142,43,44. Aqui, as etapas críticas neste protocolo são discutidas. A reação de silanização deve estar livre de qualquer vestígio de humidade. A solução de pegylation deve ser aplicada ràpida ao vidro SILANIZADOS uma vez que o PEG é dissolvido para evitar a hidrólise. Na célula de fluxo multicanal, qualquer ar aprisionado na folha adesiva deve ser removido para evitar fugas entre os canais vizinhos. A solução de PCA deve ser preparada recentemente, uma vez que oxida ao longo do tempo. A adição de 10 N NaOH deve ser Dropwise, com vortexing no meio. O fundo da fluorescência no lamela deve ser mínimo antes de fluir o HJ cDNAs etiquetado. A imagem latente na pilha de fluxo deve ser executada em um sentido para evitar áreas descoradas imagem latente. Em experimentos de ALEX, o poder do laser vermelho deve ser reduzido para evitar o clareamento rápido do aceitador. Nos experimentos de lapso de tempo, o tempo de ciclo tem que ser mais curto do que o evento mais rápido.
smFRET é uma técnica sensível que pode fornecer insights valiosos em tempo real em reações biomoleculares. No entanto, este método tem vários desafios técnicos, entre os quais está conseguindo uma mudança mensurável no FRET durante a reação bioquímica. Isto é necessário para obter características bem separadas nos histogramas e nos Estados distinguíveis nos tempos-traços. Em muitos casos, o smFRET requer um design cuidadoso dos substratos, a seleção dos pares de fluoróforo e suas posições, e a amplificação das alterações do FRET no substrato do DNA por causa das pequenas alterações estruturais no substrato45. Outra abordagem para a realização de FRET é usar proteínas rotuladas46. A janela de observação em FRET é limitada pela estabilidade do aceitador como Cy5 ou Alexa fluor 647 que tende a lixívia mais rapidamente do que o doador (Cy3 neste caso). Portanto, o fret requer uma busca contínua por fluoróforos estáveis para estender a duração do experimento e os esforços para desenvolver sistemas de eliminação de oxigênio para prolongar o sinal de fluorescência e maximizar a relação sinal-ruído47,48 .
Entre as pontas para pesquisar defeitos em smFRET está equilibrando os diversos parâmetros envolvidos na imagem latente tal como a potência do laser, o tempo de exposição, o tempo de ciclo, e o número de ciclos para maximizar a emissão da fluorescência, prolongar a duração do experimento, e conseguir intervalos de amostragem adequados para a dinâmica enzimática. Tempos de observação mais longos e efeitos mínimos do fotobranqueamento são essenciais para obter distribuições de tempo de permanência de alta fidelidade que representam a dinâmica enzimática. ALEX gera melhores histogramas, uma vez que este método é submetido a menores contribuições de partículas fotobranqueadas em comparação com o FRET de cor única. No entanto, a resolução temporal em ALEX é menor do que no FRET de cor única.
Finalmente, a ênfase da smFRET na detecção de mudanças conformacionais/estruturais em moléculas individuais em tempo real faz a ponte entre as técnicas estruturais de alta resolução (i.e., cristalografia por raios X, ressonância magnética nuclear, microscopia eletrônica), que fornece detalhes estruturais de resolução atômica em condições estáticas e métodos em massa que produzem a média do Ensemble de uma propriedade mensurável. Em muitos aspectos, a smFRET provou ser uma técnica poderosa para estudar sistemas biológicos em tempo real.

Os métodos da único-molécula baseados na deteção da fluorescência fornecem relações sinal-à-ruído elevadas1. A traste é uma técnica espectroscópica que pode medir distâncias na faixa de 1 – 10 nm, tornando esta técnica como uma régua molecular para medir distâncias na faixa de nanômetro2,3. O espectro de absorção do aceitador tem uma sobreposição espectral parcial com o espectro de emissão do doador na extremidade mais curta do comprimento de onda. O FRET é mediado pela transferência de energia sem radiação entre um doador e um par aceitador, enquanto a eficiência da transferência de energia depende da distância e da orientação do aceitador4.
Várias abordagens foram implementadas para minimizar o background e melhorar a eficiência de detecção do sinal de fluorescência5,6. Uma abordagem é a microscopia confocal, na qual um furo de pino restringe o ponto de excitação a um tamanho abaixo do limite de difração7. Uma outra aproximação é fluorescência interna total da reflexão (TIRF), que é uma técnica da iluminação do largo-campo em que a luz é dirigida fora-linha central acima de um ângulo crítico8. A luz é então totalmente refletida internamente na interface entre o vidro e a solução aquosa, gerando uma onda evanescente que só ilumina os fluoróforos ligados à superfície de vidro e previne o fundo dos fluoróforos no resto do a solução.
Na microscopia confocal, as moléculas podem ser livremente difundidas ou superfície imobilizada. A resolução temporal alcançada pode estar dentro de microssegundos para vários milissegundos9. A detecção confocal para uma única molécula é realizada por díodo de avalanche de fóton único (SPAD) e varredura ponto-a-ponto da região de interesse10. Em TIRF, uma série temporal de algumas centenas de moléculas imobilizadas na superfície é gravada por um detector acoplado de carga bidimensional sensível à posição (CCD). O CCD amplifica o sinal de fluorescência, quer pela intensificação da tela de fósforo e placa de microcanal ou na multiplicação de chips de fotoelétrons (EMCCD). A resolução temporal depende da velocidade de leitura e da eficiência quântica do CCD e, geralmente, da ordem de algumas dezenas de milissegundos6.
HJ é um intermediário central no reparo e no recombinação do ADN11,12,13,14. HJ tem dois contínuos e duas vertentes do cruzamento que conectam entre as costas contínuas sem cruzar-se. HJ existe na solução como Conformers X-empilhados, que se submetem a isomerização contínuo pelas costas contínuas que tornam-se cruzar e as costas do cruzamento que tornam-se contínuas nos outros conformer15. A preferência do isômero do hj depende da sequência central e do ambiente iônico e tem sido extensivamente estudada pela traste16,17,18,19.
GEN120 é uma proteína monomérica na solução21 e requer dimerização para Cleave o HJ, permitindo assim a separação adequada das vertentes recombinadas22,23. A preferência do conformer de empilhamento do hj influencia o resultado do recombinação genético ajustando a orientação da definição pelos resolvasos hj24. Entendendo como Gen1 vincula o HJ, coordena as duas incisões, e garante a sua resolução completa foram todos estudo intensivo21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
Neste estudo, um conjunto de TIRF baseado em objetivos é usado como descrito anteriormente31. A excitação alterna da dois-cor (Alex) é aplicada para determinar as mudanças conformacionais em cima da interação de Gen1 com o fluoróforo etiquetado hj. A ALEX produz histogramas 2D com base em dois parâmetros ratiométricos de eficiência FRET e, que é dependente da distância do doador, e o parâmetro de estequiometria S, que mede a estequiometria do doador-aceitador32. ALEX permite a triagem de espécies fluorescentes com base nas estequiometrias dos fluoróforos, incluindo apenas doadores, apenas aceitador, e subpopulações mistas. ALEX pode estender o uso de FRET para a gama completa e pode detectar diferenças no brilho de fluoróforo e oligomerização, bem como monitorar interações macromolécula-ligante33.
Encontra-se que GEN1 consistentemente sucede em resolver o HJ dentro da vida do complexo de GEN1-HJ. As mudanças conformacionais dependentes do tempo são derivadas dos traços temporais das moléculas individuais, enquanto os histogramas representam a distribuição das populações subjacentes. Usando o tempo-lapso único-cor fret, rápido on-Rates e retardar fora-taxas para o dímero Gen1 são demonstrados, que aumentam a afinidade do dímero montado Gen1 no primeiro produto da incisão.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

Os métodos maiorias medem o comportamento do Ensemble das moléculas, em que as taxas individuais da reação das etapas subjacentes são médias durante todo a população. A transferência de energia da ressonância da único-molécula Förster (smfret) fornece uma gravação das mudanças conformacional que acontecem por moléculas individuais no tempo real. Conseqüentemente, smFRET é poderoso em medir mudanças estruturais na enzima ou no substrato durante a ligação e a catálise. Este trabalho apresenta um protocolo para a imagem latente da único-molécula da interação de uma junção de quatro vias de Holliday (HJ) e de endonuclease I da abertura (GEN1), uma enzima homólogo citosólico do recombinação. Também são apresentados são de cor única e dois-cor alternada excitação (ALEX) smFRET protocolos experimentais para seguir a resolução do HJ por GEN1 em tempo real. A cinética da dimerização de GEN1 é determinada no HJ, que tem sido sugerido para desempenhar um papel fundamental na resolução do HJ e permaneceu elusiva até agora. As técnicas descritas aqui podem ser amplamente aplicadas para obter valiosos insights mecanísticos de muitos sistemas de DNA enzimático.

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Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

É apresentado aqui um protocolo para executar a transferência de energia da ressonância da único-molécula Förster para estudar a definição HJ. A excitação alternada de duas cores é usada para determinar as constantes de dissociação. O lapso de tempo da único-cor smFRET é aplicado então em ensaios do clivagem do tempo real para obter a distribuição do tempo de permanência antes da definição de HJ.

Métodos de transferência da energia da ressonância da único-molécula Förster para a investigação tempo real da definição da junção de Holliday por GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Este protocolo nos permite monitorar a dinâmica de interação e a resolução da junção holliday por retalho endonuclease 1 ao nível de molécula única e outros sistemas enzimáticos. Bem, alguns terão uma média em toda a população molecular ou garantem os passos mecanicistas individuais subjacentes e há. Métodos de molécula única fornecem esses detalhes monitorando o comportamento em tempo real de moléculas individuais.Métodos de molécula única podem detectar eficientemente interações biomoleculares na faixa pico e nanomolar com alta especificidade. O que é útil para muitas soluções práticas em diagnósticos, sequenciamento de genomas e sensoriamento. Métodos ópticos e forçados de medição de moléculas únicas são amplamente aplicados em Física, Química e Biologia e são comprovados para fornecer observações nobres que são inacessíveis por outros métodos.Meu conselho para os usuários iniciantes é acompanhar de perto os passos detalhados estabelecidos neste protocolo. As ilustrações visuais do procedimento prático deste protocolo levarão à implementação bem sucedida da técnica. Para preparar a célula de fluxo de canal único, comece perfurando dois furos de 1,22 milímetros de diâmetro na parte média de um slide de quartzo de 50 por 20 milímetros com os centros a 37 milímetros de distância e 6,5 milímetros da borda do slide.Use um cortador eletrônico para cortar um canal de 41 por 2,25 milímetros em um pedaço de 50 por 20 milímetros de uma folha de adesivo duplo e retire o lado plástico da tampa protetora. Alinhe as bordas da peça com as bordas do slide de quartzo e use um par de pinças de politetrafluoroetileno para remover suavemente quaisquer bolhas de ar presas. Retire o lado do papel da peça adesiva e monte a peça sobre a superfície funcionalizada de um deslizamento de tampa.Em seguida, corte um pedaço de tubo de polietileno com um diâmetro interno de 1,22 milímetros para um comprimento de 11 centímetros para a entrada e um pedaço de tubulação de 25 centímetros para a tomada. Em seguida, insira os tubos nos orifícios previamente perfurados como os tubos de entrada e saída para a célula de fluxo. E use cola epóxi de cinco minutos para selar as bordas da interface de deslizamento de tampa de quartzo nos tubos de entrada e saída.Quando a célula secar, use uma seringa de 1 milímetro para lavar 0,2 micrômetro filtrado 0,03 miligramas por mililitro de concentração de pbs na célula usando uma segunda seringa cheia apenas com tampão para lavar qualquer excesso de avidin no final da profusão. Para realizar um experimento fret de cor única, primeiro aplique uma gota de óleo de imersão em um objetivo total de fluorescência de reflexão interna 100 vezes maior e coloque a multiplicação on chip de fotoeletrões para um ganho adequado para otimizar o sinal ao fundo e evitar a saturação. Coloque cuidadosamente a célula de fluxo no suporte da amostra e use o ajuste do curso para aumentar gradualmente o objetivo até que o óleo toque o deslizamento da tampa.Ligue o laser de 532 nanômetros e mude para o modo de ajuste fino do objetivo. Direcione a emissão para a porta da câmera para observar a imagem no monitor e ajustar a altura do objetivo até que a superfície funcionalizada do deslizamento da tampa seja colocada em foco e possa ser observada no monitor. Verifique se o fundo da superfície funcionalizada dos deslizamentos de cobertura não excede poucos pontos antes de fluir no HJ rotulado fluorescentemente. Quando o sistema estiver pronto entre 0,2 e 0,5 microlitres do substrato diluído de interesse em 120 microliters de tampão de imagem com sistema de limpeza de oxigênio em um tubo de 0,5 mililitro e conecte a saída da célula lenta a uma bomba de seringa.Insira o tubo de entrada no tubo de 1,5 mililitro e inicie a bomba de seringa a um microliter de 30 a 50 por minuto para retirar a solução do tubo. Frequentemente imagem a superfície brevemente com o laser verde para confirmar uma boa cobertura da célula com 100 a 300 partículas de substrato homogêneo distribuído e bem espaçado. Se a superfície da célula de fluxo estiver adequadamente coberta, lave outros 120 microliters de tampão de imagem a 30 a 50 microliters por minuto para lavar qualquer HJ não vinculado e permitir que a célula de fluxo se sente por 5 minutos para permitir que o sistema de escoamento de oxigênio despoje o oxigênio dissolvido.Ajuste o tempo de exposição para aproximadamente 60 milissegundos. O tempo de ciclo será definido automaticamente pelo software com base na velocidade de transferência de dados. Especifique o número desejado de ciclos ou quadros para aproximadamente 400.A emissão do doador e fluoroforos aceitores são divididas em canais de cores por um dispositivo divisor de imagens. Selecione uma área adequada na superfície, ajuste a altura do objetivo para focar a imagem e gravar e salvar o filme em formato de tiff de 16 bits. Então mude-se para uma nova área.Lave a célula com 120 microliters de tampão de imagem complementados com as concentrações indicadas de GEN1 a uma taxa de fluxo de 30 microliters por minuto, uma concentração por vez. Na resolução do experimento de decote HJ, ajuste a taxa de fluxo para 110 microliters por minuto e inicie a gravação de 5 a 10 segundos antes da entrada da enzima na célula de fluxo. a imagem para iniciar de 5 a 10 segundos antes da entrada da enzima na célula de fluxo maximizará o número de eventos.Quando todas as concentrações forem testadas, use um slide de contas fluorescente fixo para mapear o doador e as partículas aceitadoras umas para as outras no dispositivo de divisão de imagens. Após a instalação do pacote de software apropriado para gerar uma matriz de transformação, abra a filme de slides de contas gravada e selecione as posições das contas individuais nos canais doador e aceitador. Quando a matriz tiver sido gerada a partir do slide de contas fixa clique em Carregar TFORM e selecione o arquivo de matriz de transformação.No menu suspenso do filtro de canal, clique na opção D&A para selecionar partículas rotuladas com o doador e o aceitor. Em seguida, digite plotTimetraceCW como instruído no manual para gerar os traços de tempo para cada molécula. Para realizar um experimento ALEX FRET, grave um filme composto de quadros consecutivos de emissões de doadores e aceitadores por excitações diretas com os lasers verde e vermelho.Abra os filmes alex adquiridos e estabeleça o limite de detecção adequado em aproximadamente 300 para cada uma das emissões de doadores devido à excitação do doador, emissão de aceitação devido à excitação do doador e emissão de aceitação devido aos canais de excitação direta. Aplique os filtros de canal apropriados para selecionar para as partículas que foram doadoras e aceitadoras e vincular 200 a 300 partículas em cada um dos três canais. Use o código plotHistALEX MATLAB para gerar histogramas ALEX que encaixem diferentes picos nas funções do histograma e use um programa de grafia e análise adequado para determinar a porcentagem da área sob a curva para cada população.Em seguida, use o código plotTimetraceALEX MATLAB para gerar um rastreamento de tempo para cada molécula mostrando a emissão do doador pela excitação direta nas emissões de aceitadores devido ao FRET e à excitação direta. Este histograma fret de excitação representativa do rótulo adjacente X-0 mostra dois picos que correspondem à troca dos isômeros mais abundantes e menos abundantes. As taxas de isomerização obtidas a partir dos histogramas de tempo de Dwell dos isômeros são consistentes com as relatadas anteriormente.Os histogramas fret de molécula única da junção de rótulo adjacente X-0 em diferentes concentrações GEN1 adquiridas por ALEX, revelam um pico correspondente ao isômero fret alto livre e um pico correspondente à população hj vinculada depois de subtrair a contribuição do isômero menos abundante do pico de baixo FRET. Em uma concentração de GEN1 saturante, o histograma FRET de X-0 tem apenas um único pico fret baixo correspondente ao GEN1 ligado a qualquer isômero do HJ como previsto pelo modelo. A ligação do monômero GEN1 ao HJ seguido pela formação de dimer é uma característica única do eucariótico HJ resolvase GEN1 em comparação com resoluções procarióticas que existem em forma dimeric na solução.Outra evidência de que o monômero GEN1 liga e distorce o HJ é a observação de um número significativo de vestígios de partículas impiedosas com um estado fret baixo estável na presença de magnésio em baixas concentrações gen1. A partida simultânea do doador e do aceitador após um estado fret baixo estável em traços de X-0 resolvido que ocorre sem o surgimento de um intermediário indica que uma resolução completa ocorre durante a vida útil do complexo GEN1 HJ. Observe que o fundo da superfície de vidro funcionalizado não deve exceder alguns pontos e que partículas distribuídas uniformemente são essenciais para obter bons resultados.Use sempre equipamentos de proteção individual e um capuz de fumaça enquanto prepara a imagem de serialização. Certifique-se de usar óculos de proteção específicos para os comprimentos de onda ao trabalhar com lasers. Outros métodos, como crio ap, ressonância magnética nuclear, podem fornecer detalhes estruturais de nível atômico.Essas informações são fundamentais para o desenho e interpretação dos experimentos fret de molécula única. Molécula única FRET abre novas visões no campo da replicação do DNA resultando em uma compreensão mais profunda dos mecanismos de ações helicases e nucleases.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Genética

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Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformação, edição do genoma e fenotipagem do nitrogênio-fixação tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigação do papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 por crispr/Cas9 Ribonucleoproteína em células de leucemia mielóide aguda

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...