Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Эта работа была поддержана Университетом науки и техники короля Абдаллы через основное финансирование и премию за конкурентные исследования (CRG3) С.М.Х.

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

В этом исследовании были внедрены различные методы smFRET для определения кинетики разрешения HJ GEN130. Аналогичные подходы smFRET были использованы для выполнения двойного клапана ДНК конформационного требования и расщепления репликации ДНК и ремонта клапана эндонуклеаза 142,43,44. Здесь обсуждаются критические шаги в этом протоколе. Реакция силанизации должна быть свободна от любых следов влажности. Решение пегилации следует быстро применять к силанизированному стеклу после растворения ПЭГ, чтобы избежать гидролиза. В многоканальной ячейке потока любой захваченный воздух в клейом листе должен быть удален, чтобы избежать утечки между соседними каналами. Раствор PCA должен быть свежеприготовлен, так как он окисляется с течением времени. Добавление 10 N NaOH должно быть dropwise, с вихрем между ними. Фон флуоресценции в крышке должен быть минимальным, прежде чем течь флуоресцентно помечены HJ. Изображение в ячейке потока должно быть выполнено в одном направлении, чтобы избежать отбеленных изображений областей. В экспериментах ALEX, сила красного лазера должна быть уменьшена, чтобы избежать быстрого отбеливания приемного. В экспериментах замедленного времени время цикла должно быть короче, чем самое быстрое событие.
smFRET является чувствительным методом, который может обеспечить ценную информацию в режиме реального времени в биомолекулярных реакциях. Тем не менее, этот метод имеет ряд технических проблем, среди которых является достижение измеримых изменений в FRET во время биохимической реакции. Это необходимо для того чтобы получить well-separated характеристики в гистограммах и различимых положениях в следах времени. Во многих случаях smFRET требует тщательного проектирования субстратов, выбора пар фторофора и их позиций, а также усиления изменений FRET в субстрате ДНК из-за незначительного структурных изменений в субстрате45. Другой подход для выполнения FRET заключается в использовании помеченных белков46. Окно наблюдения в FRET ограничено стабильностью приемного, такого как Cy5 или Alexa Fluor 647, который имеет тенденцию к отбеливанию быстрее, чем донор (Cy3 в данном случае). Таким образом, FRET требует постоянного поиска стабильных фторофоров, чтобы продлить продолжительность эксперимента и усилия по разработке систем очистки кислорода, чтобы продлить сигнал флуоресценции и максимизировать соотношение сигнала к шуму47,48 .
Среди советов по устранению неполадок в smFRET является балансирование нескольких параметров, участвующих в визуализации, таких как мощность лазера, время экспозиции, время цикла, и количество циклов, чтобы максимизировать выброс флуоресценции, продлить продолжительность эксперимента, и достичь соответствующие интервалы отбора проб для динамики ферментов. Более длительное время наблюдения и минимальные эффекты от фотоотбелевания имеют важное значение для получения высокой точности осязать распределение времени, которые представляют динамику фермента. ALEX генерирует лучшие гистограммы, так как этот метод подвергается более низкому вкладу от фотоотраблированных частиц по сравнению с одноцветной FRET. Тем не менее, временное разрешение в ALEX ниже, чем в одноцветных FRET.
Наконец, акцент smFRET на обнаружение конформационных/структурных изменений в отдельных молекулах в режиме реального времени преодолевает разрыв между структурными методами высокого разрешения (т.е. рентгеновская кристаллография, ядерный магнитный резонанс, электронная микроскопия), которая обеспечивает структурное разрешение атомного разрешения в статических условиях и методах, которые дают среднему ансамблю измеримое свойство. Во многих аспектах smFRET зарекомендовал себя как мощный метод изучения биологических систем в режиме реального времени.

Одномолекулярные методы, основанные на обнаружении флуоресценции, обеспечивают высокое соотношение сигнала к шуму1. FRET является спектроскопической техникой, которая может измерять расстояния в диапазоне 1-10 нм, делая этот метод молекулярным линейкой для измерения расстояний в диапазоне нанометров2,3. Спектр поглощения принимает частичное спектральное совпадение со спектром выбросов донора на более коротком конце волны. FRET опосредовано передачей энергии без излучения между парой донора и принимающего, в то время как эффективность передачи энергии зависит от расстояния и ориентации принимающего4.
Было реализовано несколько подходов, чтобы свести к минимуму фон и повысить эффективность обнаружения сигнала флуоресценции5,6. Одним из подходов является конфокальная микроскопия, в которой пинхол ограничивает место возбуждения размером ниже предела дифракции7. Другим подходом является тотальная внутренняя флуоресценция отражения (TIRF), которая представляет собой широкополевой метод освещения, в котором свет направлен вне оси выше критического угла8. Свет затем полностью внутренне отражается на интерфейсе между стеклом и водным раствором, генерируя эвакуационную волну, которая освещает флюорофоры, прикрепленные к стеклянной поверхности, и предотвращает фон от флюорофоров в остальной части решение.
В конфокальной микроскопии молекулы могут быть либо свободно рассеяны, либо обездвижены на поверхности. Достигнутое временное разрешение может быть в пределах микросекунд до нескольких миллисекунд9. Конфоккодное обнаружение для одной молекулы осуществляется однофотональным лавинным диодом (SPAD) и точечное сканирование области, представляющим интерес10. В TIRF, временные ряды из нескольких сотен молекул, обездвиженных на поверхности, регистрируется позиционно-чувствительным двухмерным детектором заряда (CCD). CCD усиливает сигнал флуоресценции либо за счет усиленного фосфорного экрана и микроканальной пластины, либо помножения фотоэлектронов на чипе (EMCCD). Временное разрешение зависит от скорости считывания и квантовой эффективности CCD и обычно на порядка нескольких десятков миллисекунд6.
HJ является центральным промежуточным в реабире ДНК и рекомбинации11,12,13,14. HJ имеет две непрерывные и две пересекающиеся нити, которые соединяются между непрерывными нитями, не пересекаясь друг с другом. HJ существует в решении как X-штабированные конформисты, которые проходят непрерывную изомеризацию непрерывными стренгами, становясь скрещиваниями, а стыковки становятся непрерывными в другом конформате15. Изомер предпочтения HJ зависит от основной последовательности и ионной среды и был широко изучен FRET16,17,18,19.
GEN120 является мономерным белком в растворе21 и требует димеризации, чтобы расщеплять HJ, что позволяет правильное разделение рекомбинированных нитей22,23. Укладка конформат предпочтения HJ влияет на результат генетической рекомбинации, установив ориентацию резолюции HJ resolvases24. Понимание того, как GEN1 связывает HJ, координирует два разреза, и обеспечивает его полное разрешение все были в интенсивномисследовании21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
В этом исследовании используется объективная настройка TIRF, как описано ранее31. Двухцветные переменные возбуждения (ALEX) применяется для определения конформационных изменений при взаимодействии GEN1 с флюорофором помечены HJ. ALEX производит 2D гистограммы на основе двух соотношений FRET эффективности E, которая является донором-приемщиком расстояния зависит, и stoichiometry параметр S, который измеряет донора-приемного stoichiometry32. ALEX позволяет сортировать флуоресцентные виды на основе стоихиометрии флюорофоров, включая только донора, только принимать, и смешанные субпопуляции. ALEX может расширить использование FRET в полном диапазоне и может обнаружить различия в яркости флюорофора и олигомеризации, а также контролировать макромолекулы-лиганд взаимодействия33.
Установлено, что GEN1 последовательно успешно решает Проблему HJ в течение всего срока службы комплекса GEN1-HJ. Зависящие от времени конформационные изменения происходят из временных следов отдельных молекул, в то время как гистограммы представляют распределение основных популяций. С использованием замедленного одноцветного FRET, быстрые на-ставки и медленные off-тарифы для GEN1 димер продемонстрированы, которые увеличивают сродство собранного GEN1 dimer на первом продукте разреза.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

Массовые методы измеряют ансамбльное поведение молекул, в которых индивидуальные показатели реакции основных шагов усредняются по всей популяции. Одномолекулярная ремолекула Фюрстерской рецензной передачи энергии (smFRET) обеспечивает запись конформанформивальных изменений, происходящих отдельными молекулами в режиме реального времени. Таким образом, smFRET является мощным в измерении структурных изменений в ферменте или субстрате во время связывания и катализа. Эта работа представляет собой протокол для одномолекулярной визуализации взаимодействия четырехсторонней коллидейской развязки (HJ) и зазорной эндонуклеазы I (GEN1), цитосоликического гомолегаричного фермента рекомбинации. Также представлены одноцветные и двухцветные переменные возбуждения (ALEX) smFRET экспериментальных протоколов следовать резолюции HJ GEN1 в режиме реального времени. Кинетика димеризации GEN1 определяется в HJ, который, как было предложено, играет ключевую роль в разрешении HJ и остается неуловимым до сих пор. Описанные здесь методы могут быть широко применены для получения ценных механистических идей многих ферментно-ДНК-систем.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Представлен протокол для выполнения одномолекулярной рецензной передачи энергии Фюрстера для изучения разрешения HJ. Двухцветные переменные возбуждения используется для определения констант диссоциации. Одноцветный промежуток времени smFRET затем применяется в анализах расщепления в режиме реального времени, чтобы получить распределение времени пребывания до разрешения HJ.

Одномолекулярная Фюрстерская резонная передача энергии Методы для реального времени Исследование Холлидей Джанкшн Резолюция GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Этот протокол позволяет нам контролировать динамику взаимодействия и разрешение перекрестка Холлидей с помощью лоскутной эндонуклеазы 1 на уровне одной молекулы и других энзиматических систем. Ну, некоторые будут усреднения по всей молекулярной популяции или обеспечивает основные индивидуальные механистические шаги и есть. Методы одной молекулы обеспечивают эти детали путем мониторинга поведения отдельных молекул в режиме реального времени.Методы одной молекулы могут эффективно обнаруживать биомолекулярные взаимодействия в диапазоне пико и наномоляров с высокой специфичностью. Что удобно для многих практических решений в диагностике, секвенировании генома и зондировании. Оптические и принудительные методы измерения одной молекулы широко применяются в физике, химии и биологии и, как доказано, обеспечивают благородные наблюдения, недоступные другими методами.Мой совет для впервые пользователей заключается в том, чтобы внимательно следить за подробные шаги, изложенные в этом протоколе. Визуальные иллюстрации практической процедуры этого протокола приведут к успешной реализации методики. Чтобы подготовить одноканайную ячейку потока, начните с бурения двух отверстий диаметром 1,22 миллиметра в средней части кварцевой горки диаметром 50 на 20 миллиметров с разрозней центрами на 37 миллиметров и на 6,5 миллиметра от края горки.Используйте электронный резак, чтобы сократить 41 на 2,25 миллиметра канала в 50 на 20 миллиметров кусок двойного клея листа и снять пластиковую сторону защитной крышки. Выровняйте края фигуры с краями кварцевой горки и используйте пару полиэтиленовых пинцетов для мягкого удаления любых захваченных пузырьков воздуха. Снимите бумажную сторону клея и смонтировать кусок на функциональной поверхности крышки скольжения.Затем вырежьте один кусок полиэтиленовой трубки с внутренним диаметром 1,22 миллиметра до 11 сантиметров длиной для вставки и один кусок трубки до 25 сантиметров для розетки. Затем вставьте трубки в ранее просверленные отверстия в качестве входных и розетки труб для потока ячейки. И использовать пять минут эпоксидного клея, чтобы запечатать края кварцевой крышки скольжения интерфейса в входе и розетке труб.Когда клетка высохла, используйте 1 миллиметр шприца, чтобы промыть 0,2 микрометра фильтруется 0,03 миллиграмма на миллилитр концентрации avidin в PBS в клетку с помощью второго шприца заполнены буфером только для мытья любого избытка avidin в конце изобилия. Для выполнения одноцветного эксперимента FRET сначала нанесите одну каплю масла погружения на 100-кратную цель внутреннего отражения флуоресценции и установите на чипе умножение фотоэлектронов на подходящий выигрыш для оптимизации сигнала на заднем плане и предотвращения насыщения. Аккуратно поместите ячейку потока на держатель образца и используйте регулировку курса, чтобы постепенно поднять цель до тех пор, пока масло не коснется крышки скольжения.Включите лазер 532 нанометров и переключитесь на режим тонкой регулировки цели. Навейте выбросы в порт камеры, чтобы наблюдать за изображением на мониторе и регулировать высоту цели до тех пор, пока функциональное покрытие крышки не будет скольжено в фокусе и не будет наблюдаться на мониторе. Убедитесь, что фон с функциональной поверхности крышки скользит не превышает несколько пятен, прежде чем течь в флуоресцентно помечены HJ. Когда система будет готова на 0,2 до 0,5 микролитров разбавленного субстрата интереса в 120 микролитров буфера изображения с кислородной системой очистки в 0,5 миллилитровую трубку и подключить выход медленной ячейки к шприц-насосу.Вставьте входную трубку в 1,5 миллилитровую трубку и запустите шприц-насос на 30-50 микролитров в минуту, чтобы снять раствор из трубки. Часто изображение поверхности кратко с зеленым лазером, чтобы подтвердить хорошее покрытие клетки со 100 до 300 частиц однородно распределены, хорошо распределено субстрата. Если поверхность клетки потока адекватно покрыта, промыть еще 120 микролитров буфера изображений на 30 до 50 микролитров в минуту, чтобы смыть любой несвегающий HJ и позволить клетке потока сидеть в течение 5 минут, чтобы кислородная система струйки истощать растворенный кислород.Установите время экспозиции примерно до 60 миллисекунд. Время цикла будет автоматически устанавливаться программным обеспечением на основе скорости передачи данных. Укажите нужное количество циклов или кадров примерно до 400.Выбросы от донора и флюорофоров принимаетеля делятся на цветные каналы устройством сплиттера изображений. Выберите подходящую область на поверхности, отрегулируйте высоту цели, чтобы сфокусировать изображение и записать и сохранить фильм в формате 16 бит tiff. Затем переместись в новую область.Промыть клетку 120 микролитров буфера изображений, дополненных указанными концентрациями GEN1 при скорости потока 30 микролитров в минуту, по одной концентрации за раз. В разрешении эксперимента по расщеплению HJ отрегулируйте скорость потока до 110 микролитров в минуту и начните запись за 5-10 секунд до входа фермента в клетку потока. изображение, чтобы начать от 5 до 10 секунд до входа фермента в клетку потока будет максимизировать количество событий.Когда все концентрации были протестированы, используйте фиксированный флуоресцентный слайд шарика, чтобы сопоставить частицы донора и принимаетеля друг с другом в устройстве разделения изображений. После установки соответствующего пакета программного обеспечения для создания матрицы преобразования, откройте записанный шарик слайд фильм и выбрать позиции отдельных бусин в донорских и приемоктор каналов. Когда матрица была создана из фиксированного слайда шарика нажмите Load TFORM и выберите файл матрицы преобразования.В меню фильтра канала опустите меню, нажмите на опцию D и A, чтобы выбрать для частиц, помеченных как донором, так и принимаеттелем. Затем введите plotTimetraceCW в соответствии с инструкциями в руководстве для генерации следов времени для каждой молекулы. Для выполнения эксперимента ALEX FRET завехайте фильм, состоящий из последовательных кадров донорских и приемокторских выбросов путем прямых возбуждений с помощью зеленых и красных лазеров.Откройте приобретенные фильмы ALEX и установите подходящий порог обнаружения на уровне примерно 300 для каждого из донорских выбросов из-за возбуждения донора, выброса приемора из-за возбудивания донора и выброса acceptor из-за прямых каналов возбуждения. Примените соответствующие фильтры каналов, чтобы выбрать для частиц, которые были как донором, так и принимаеттелем, и связать от 200 до 300 частиц в каждом из трех каналов. Используйте код plotHistALEX MATLAB для генерации гистограмм ALEX, соответствующих различным пикам в функциях гистограммы, и используйте подходящую программу графикирования и анализа для определения процентной доли области под кривой для каждой популяции.Затем используйте код plotTimetraceALEX MATLAB для генерации трассировки времени для каждой молекулы, показывающей выброс донора прямым возбуждением в выбросах приемора из-за FRET и прямого возбуждения. Этот представитель чередуя возбуждение FRET гистограмма соседней этикетки X-0 показывает два пика, которые соответствуют обмену более обильные и менее обильные изомеры. Показатели изомеризации, полученные из гистограмм времени жилищ изомеров, соответствуют тем, о них сообщалось ранее.Одноя молекула FRET гистограммы соседней этикетки X-0 соединения в различных концентрациях GEN1, приобретенных ALEX, выявить один пик, соответствующий свободной высокой FRET изомера и один пик, соответствующий связаны HJ населения после вычитания вклад менее обильные изомера от низкого пика FRET. При насыщении концентрации GEN1 гистограмма FRET X-0 имеет только один низкий пик FRET, соответствующий GEN1, связанный с либо изомером HJ, как это было предсказано моделью. Привязка мономера GEN1 к HJ с последующим образованием димера является уникальной особенностью эукариотической ХДж-решения GEN1 по сравнению с прокариотическими растворимами, которые существуют в димерикической форме в растворе.Еще одним доказательством того, что мономер GEN1 связывает и искажает HJ, является наблюдение значительного количества следов нечистых частиц со стабильным низким состоянием FRET при наличии магния при низких концентрациях GEN1. Одновременный отъезд донора и принимаетеля после стабильно низкого состояния FRET в следах разрешенного X-0, который происходит без появления промежуточного указывает на то, что полное разрешение происходит в течение всего срока службы комплекса GEN1 HJ. Обратите внимание, что фон функциональной стеклянной поверхности не должен превышать нескольких пятен и что равномерно распределенные частицы необходимы для получения хороших результатов.Всегда используйте средства индивидуальной защиты и дым капот при подготовке серийной картины. Обязательно носите защитные очки, характерные для длин волн при работе с лазерами. Другие методы, такие как крио ап, ядерный магнитный резонанс, может обеспечить атомный уровень структурных деталей.Эта информация является неотъемлемой частью для разработки и интерпретации одной молекулы FRET экспериментов. Единая молекула FRET открывает новые взгляды в области репликации ДНК, что приводит к более глубокому пониманию механизмов действий геликавов и ядер.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Обнаружение экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крыс с использованием количественной ПЦР в реальном времени

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Одно Молекула Анализ лазерных локализованные псоральны аддукты

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Выявление мутаций путем таяния высокого разрешения в TILLING населения риса

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Преобразование, редактирование генома и фенотипирование азота фиксации тропических каннабацеи Дерево Параспония andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Исследование транскрипционной роли интронического глушителя RUNX1 от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Эффективная транскрипционно контролируемая система выражения плазмида для исследования стабильности транскриптов мРНК в первичных альвеолярных эпителиальных клетках

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...