Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Detta arbete stöddes av kung Abdullah University of Science and Technology genom Core finansiering och konkurrenskraftig forskning Award (CRG3) till S. M. H.

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

I denna studie, olika smFRET tekniker genomfördes för att bestämma kinetik av HJ upplösning av GEN130. Liknande smfret metoder användes för att följa dubbel-flik DNA-överensstämmningskrav och klyvning av DNA-replikation och reparation flik Endonuklease 142,43,44. Här diskuteras kritiska steg i detta protokoll. Silaniseringsreaktionen bör vara fri från alla spår av fukt. Pegylationslösningen bör snabbt appliceras på det silaniserade glaset när PEG är upplöst för att undvika hydrolys. I cellen flerkanaligt flöde bör eventuell instängd luft i limmet avlägsnas för att undvika läckage mellan angränsande kanaler. PCA-lösningen bör vara nyberedd eftersom den oxiderar med tiden. Tillsatsen av 10 N NaOH bör vara dropwise, med vortexa däremellan. Fluorescensbakgrunden i täckglåtet bör vara minimal innan du strömmar den Fluorescent som heter HJ. Bildtagning i cellen flöde bör utföras i en riktning för att undvika Imaging blekt områden. I ALEX experiment, kraften i den röda lasern bör reduceras för att undvika snabb blekning av acceptorn. I tids fördröjnings experimenten måste cykelns tid vara kortare än den snabbaste händelsen.
smFRET är en känslig teknik som kan ge värdefulla insikter i realtid i biomolekylära reaktioner. Emellertid, denna metod har flera tekniska utmaningar, bland vilka är att uppnå mätbara förändring i FRET under den biokemiska reaktionen. Detta är nödvändigt för att få väl separerade funktioner i histogrammen och distinguishable stater i tid-spår. I många fall kräver smFRET noggrann utformning av substrat, val av fluorophore par och deras positioner, och förstärkning av FRET förändringar i DNA-substrat på grund av de små strukturella förändringarna i substratet45. En annan metod för att utföra FRET är att använda märkta proteiner46. Observations fönstret i FRET begränsas av stabiliteten i acceptorn som Cy5 eller Alexa fluor 647 som tenderar att bleka snabbare än givaren (Cy3 i detta fall). Därför kräver FRET en kontinuerlig sökning efter stabila fluoroforer att förlänga experimentets varaktighet och ansträngningar för att utveckla syre rensning system för att förlänga fluorescenssignalen och maximera signal-brus-förhållande47,48 .
Bland de tips för felsökning i smFRET balanserar flera parametrar inblandade i Imaging såsom lasereffekt, exponeringstid, cykeltid, och antal cykler för att maximera fluorescensutsläpp, förlänga experimentets varaktighet, och uppnå lämpliga provtagningsintervall för enzymdynamiken. Längre observations tider och minimala effekter från foto blekning är nödvändiga för att erhålla hög fidelity Dwell Time-distributioner som representerar enzymdynamiken. ALEX genererar bättre histogram eftersom denna metod utsätts för lägre bidrag från photoblekt partiklar jämfört med enfärgad FRET. Men den temporala upplösningen i ALEX är lägre än i enfärgad FRET.
Slutligen, smFRET betoning på att upptäcka kon Formations struktur/strukturella förändringar i enskilda molekyler i realtid överbryggar klyftan mellan hög upplösning strukturella tekniker (dvs., röntgen kristallografi, kärnmagnetisk resonans, elektronmikroskopi), som ger atomär upplösning strukturella Detaljer under statiska förhållanden och bulkmetoder som ger ensemblen genomsnittet av en mätbar egenskap. I många avseenden har smFRET visat sig vara en kraftfull teknik för att studera biologiska system i realtid.

Enmolekyl-metoder baserade på fluorescensdetektion ger hög signal-till-brus-förhållanden1. FRET är en spektroskopisk teknik som kan mäta avstånd i intervallet 1 – 10 nm, vilket gör denna teknik som en molekylär linjal för att mäta avstånd i nanometer Range2,3. Acceptorens absorptionsspektrum har en partiell spektralöverlappning med givarens emissions spektrum vid den kortare våglängdsänden. FRET förmedlas av strålningen-mindre energiöverföring mellan en givare och acceptor par, medan effektiviteten i energiöverföringen är beroende av avstånd och orientering av acceptor4.
Flera metoder har implementerats för att minimera bakgrunden och förbättra detekterings effektiviteten hos fluorescenssignalen5,6. Ett tillvägagångssätt är konfokalmikroskopi, där ett hål begränsar excitationspotten till en storlek under diffraktionsgränsen7. En annan metod är total inre reflektions fluorescens (TIRF), som är en bred fälts belysning teknik där ljuset riktas off-axeln över en kritisk vinkel8. Ljuset är då helt internt reflekteras i gränssnittet mellan glas och vattenlösning, genererar en försvinnande våg som bara lyser upp fluoroforer fäst vid glasytan och förhindrar bakgrund från fluoroforer i resten av lösningen.
I konfokalmikroskopi kan molekylerna antingen vara fritt diffuserande eller ytimmobiliserade. Den uppnådda temporala upplösningen kan vara inom mikrosekunder till flera millisekunder9. Den konfokala detektering för en enda molekyl utförs av Single-Photon lavin diod (SPAD) och punkt-för-punktskanning av regionen av intresse10. I TIRF, en tidsserie av några hundratals molekyler immobiliserade på ytan registreras av en positions känslig tvådimensionell laddning kopplad detektor (CCD). CCD förstärker fluorescens signalen antingen genom intensifierad fosfor skärm och MicroChannel-plattan eller on-chip multiplikation av photoelektroner (EMCCD). Den temporal upplösningen är anhörigen på avläsning-rusad och quantumeffektivitet av CCD och vanligt på beställa av fåtalet tio av millisekunder6.
HJ är en central intermediär i DNA-reparation och rekombination11,12,13,14. HJ har två kontinuerliga och två korsning strängar som ansluter mellan de kontinuerliga strängarna utan korsande varandra. HJ finns i lösning som X-staplade kon Formations apparater, som genomgår kontinuerlig isomerisering av de kontinuerliga strängarna blir korsning och korsningen strängarna blir kontinuerlig i de andra conformer15. Isomer preferens för hj är beroende av kärnan sekvens och jonisk miljö och har studerats utförligt av FRET16,17,18,19.
GEN120 är ett monomer protein i lösning21 och kräver Dimerization att klyva hj, vilket möjliggör korrekt separation av de rekombinerade delarna22,23. Den stapling conformer preferens för HJ påverkar resultatet av genetisk rekombination genom att fastställa inriktningen av resolutionen av HJ resolvaser24. Förstå hur GEN1 binder hj, samordnar de två snitt, och säkerställer dess fulla upplösning har alla varit under intensiv studie21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
I denna studie, en objektiv baserat TIRF set-up används som beskrivs tidigare31. Tvåfärgad omväxlande excitation (ALEX) tillämpas för att bestämma de överensstämde förändringar på samspelet mellan GEN1 med fluorophore märkt HJ. Alex producerar 2D-histogram baserat på två ratiometriska parametrar FRET effektivitet E, som är givare-acceptor avstånd-beroende, och stökiometri parameter S, som mäter donator-acceptor stökiometri32. ALEX möjliggör sortering av fluorescerande arter baserade på stoichiometrier av fluoroforer, inklusive endast givare, acceptor och blandade subpopulationer. ALEX kan förlänga användningen av FRET till hela sortimentet och kan upptäcka skillnader i fluorophore ljusstyrka och oligomerisering samt övervaka makromolekyl-ligand interaktioner33.
Det finns att GEN1 konsekvent lyckas lösa HJ inom livslängden för GEN1-HJ-komplexet. De tidsberoende kon Formations förändringarna härleds från tids spåren av enskilda molekyler, medan histogrammen representerar fördelningen av de underliggande populationerna. Använda Time-lapse enfärgad FRET, snabb på-priser och långsam off-priser för GEN1 dimer demonstreras, vilket ökar affiniteten av den sammansatta GEN1 dimer vid den första snitt produkten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

Bulkmetoder mäter Ensemble beteendet hos molekyler, där individuella reaktionshastigheter av de underliggande stegen är genomsnittliga i hela populationen. Single-molekyl Förster resonans Energy Transfer (smFRET) ger en inspelning av de överensstämde förändringar som sker genom enskilda molekyler i realtid. Därför är smFRET kraftfull i att mäta strukturella förändringar i enzymet eller substrat under bindning och katalys. Detta arbete presenterar ett protokoll för Single-molekylen avbildning av samspelet mellan en fyra-vägs Holliday korsning (HJ) och gap Endonuklease I (GEN1), en cytosolisk homolog rekombination enzym. Också presenteras är enfärgad och tvåfärgad omväxlande excitation (ALEX) smFRET experimentella protokoll för att följa upplösningen av HJ av GEN1 i realtid. Kinetik av GEN1 Dimerization bestäms vid hj, som har föreslagits att spela en nyckelroll i resolutionen av HJ och har förblivit svårfångade tills nu. De tekniker som beskrivs här kan tillämpas i stor utsträckning för att få värdefulla mekanistiska insikter i många enzym-DNA-system.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Presenteras här är ett protokoll för att utföra Single-molekyl Förster resonans energiöverföring för att studera HJ upplösning. Tvåfärgad omväxlande excitation används för att bestämma dissociationskonstanter. Enfärgad tidsfördröjning smFRET tillämpas sedan i realtid klyvning analyser för att få Dwell tid fördelning före HJ upplösning.

Single-molekyl Förster resonans energiöverförings metoder för real tids utredning av Holliday Junction resolution av GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Detta protokoll gör det möjligt för oss att övervaka interaktionsdynamiken och upplösningen av Holliday-korsningen genom flap endonuclease 1 på enmolekylnivå och andra enzymatiska system. Tja, vissa kommer i genomsnitt i hela den molekylära befolkningen eller säkrar de underliggande individuella mekanistiska steg och det finns. Enmolekyl metoder ger dessa detaljer genom att övervaka realtid beteende enskilda molekyler.Enmolekylmetoder kan effektivt detektera biomolekylära interaktioner i pico- och nanomolarområdet med hög specificitet. Vilket är praktiskt för många praktiska lösningar inom diagnostik, genomsekvensering och avkänning. Optiska och påtvingade mätmetoder med en molekyl tillämpas allmänt inom fysik, kemi och biologi och har visat sig ge ädla observationer som är otillgängliga med andra metoder.Mitt råd till första gången användare är att noga följa de detaljerade steg som anges i detta protokoll. Visuella illustrationer av det praktiska förfarandet för detta protokoll kommer att leda till ett framgångsrikt genomförande av tekniken. För att förbereda den enda kanalen flöde cell, börja med att borra två 1,22 millimeter-diameter hål i den mellersta delen av en 50 med 20 millimeter kvarts glida med centra 37 millimeter isär och 6,5 millimeter från kanten av bilden.Använd en elektronisk fräs för att skära en 41 med 2,25 millimeters kanal i en 50 med 20 millimeters bit av en dubbel självhäftande ark och skala av plastsidan av skyddshöljet. Rikta in kanterna på pjäsen med kanterna på kvartssply och använd ett par polytetrafluoretenpincett för att försiktigt ta bort eventuella fångade luftbubblor. Skala av papperssidan av den självhäftande biten och montera pjäsen på den funktionaliserade ytan av en täcksli.Därefter skär en bit polyetenrör med en inre diameter på 1,22 millimeter till en 11 centimeter lång för inloppet och en bit slangar till 25 centimeter för utloppet. Sätt sedan in rören i de tidigare borrade hålen som in- och utloppsrör för flödescellen. Och använd fem minuters epoxilim för att täta kanterna på kvartslockslimgränssnittet i inlopps- och utloppsrören.När cellen har torkat, använd en 1 millimeter spruta för att spola 0,2 mikrometer filtrerad 0,03 milligram per milliliter koncentration avidin i PBS i cellen med hjälp av en andra spruta fylld med buffert ensam för att tvätta ut eventuellt överskott avidin i slutet av profusion. För att utföra en enfärgad FRET experiment, först tillämpa en droppe nedsänkning olja på en 100 gånger total inre reflektion fluorescens mål och ställa in på chip multiplikation av fotoelektroner till en lämplig vinst för att optimera signalen till bakgrunden och för att förhindra mättnad. Placera försiktigt flödescellen på provhållaren, och använd kursjustering för att gradvis höja målet tills oljan vidrör täcksligen.Slå på 532 nanometerlasern och växla till finjusteringsläge för målsättningen. Rikta emissionen till kameraporten för att observera bilden på monitorn och justera höjden på målsättningen tills täcksliens funktionsdugliga yta förs i fokus och kan observeras på monitorn. Kontrollera att bakgrunden från täckluckans funktionaliserade yta inte överskrider få fläckar innan den flyter i det fluorescerande märkta HJ. När systemet är klart på 0,2 till 0,5 mikroliter av det utspädda substratet av intresse i 120 mikroliter av bildbuffert med syrgasrensningssystem till ett 0,5 milliliterrör och anslut den långsamma cellens utlopp till en sprutpump.Sätt in inloppsröret i 1,5 milliliterröret och starta sprutpumpen med en 30 till 50 mikroliter per minut för att dra tillbaka lösningen från röret. Ofta bilden ytan kort med den gröna lasern för att bekräfta en god täckning av cellen med 100 till 300 partiklar av homogent fördelade, väl fördelade substrat. Om flödescellytan är tillräckligt täckt, spola ytterligare 120 mikroliter av bildbuffert vid 30 till 50 mikroliter per minut för att tvätta bort eventuell obunden HJ och låta flödescellen sitta i 5 minuter så att syresvvassystemet kan tömma det upplösta syret.Ställ in exponeringstiden på cirka 60 millisekunder. Cykeltiden kommer automatiskt att ställas in av programvaran baserat på hastigheten på dataöverföring. Ange önskat antal cykler eller bildrutor till ungefär 400.Emissionen från givaren och acceptorfluoroforer delas upp i färgkanaler av en bilddelareanordning. Välj ett lämpligt område på ytan, justera höjden på målsättningen för att fokusera bilden och spela in och spara filmen i 16 bitars tiff-format. Flytta sedan till ett nytt område.Spola cellen med 120 mikroliter av bildframställningsbuffert kompletterad med de indikerade koncentrationerna av GEN1 vid en 30 mikroliter per minut flödeshastighet, en koncentration i taget. I upplösningen av HJ-klyvningsexperimentet, justera flödet till 110 mikroliter per minut och starta inspelningen 5 till 10 sekunder före enzymets ingång i flödescellen. avbildningen för att starta 5 till 10 sekunder innan ingången av enzymet i flödet cellen kommer att maximera antalet händelser.När alla koncentrationer har testats, använd en fast fluorescerande pärla glida för att kartlägga givaren och acceptorpartiklar till varandra i bild-uppdelning enheten. Efter installation av lämpligt programpaket för att generera en transformationsmatris, öppna den inspelade pärlans bildfilm och välj positionerna för de enskilda pärlorna i givar- och acceptorkanalerna. När matrisen har genererats från den fasta pärlan slide klicka på Ladda TFORM och välj omvandlingsmatrisfilen.Klicka på alternativet D&A i rullgardinsmenyn för kanalfilter för att välja för partiklar som är märkta med både donatorn och acceptorn. Sedan, ange plotTimetraceCW enligt anvisningarna i handboken för att generera tidsspåren för varje molekyl. För att utföra en ALEX FRET experiment, spela in en film som består av på varandra följande ramar av givare och acceptor utsläpp genom direkta excitations med gröna och röda lasrar.Öppna de förvärvade ALEX-filmerna och ställ in den lämpliga detektionströskeln till cirka 300 för var och en av donatorutsläppen på grund av givarexcitation, acceptorutsläpp på grund av givarutstrålningen och acceptorutsläpp på grund av de direkta excitationskanalerna. Tillämpa lämpliga kanalfilter för att välja för de partiklar som har varit både givare och acceptor och länka 200 till 300 partiklar i var och en av de tre kanalerna. Använd plotHistALEX MATLAB-koden för att generera ALEX histogram som passar olika toppar i histogrammets funktioner och använda ett lämpligt graf- och analysprogram för att bestämma den procentuella andelen av området under kurvan för varje population.Använd sedan plotTimetraceALEX MATLAB-koden för att generera ett tidsspår för varje molekyl som visar givaremissionen genom den direkta exciteringen i acceptorutsläppen på grund av FRET och den direkta excitationen. Denna representant omväxlande excitation FRET histogram av intilliggande etikett X-0 visar två toppar som motsvarar utbyte av de mer rikliga och mindre rikliga isomerer. Den isomerisering priser som erhållits från Dwell tid histogram av isomerer är förenligt med de som rapporterats tidigare.Single molecule FRET histograms of the adjacent label X-0 junction at different GEN1 concentrations acquired by ALEX, reveal one peak corresponding to the free high FRET isomer and one peak corresponding to the bound HJ population after subtratrahering the contribution of the less abundant isomer from the low FRET peak. Vid en mättande GEN1-koncentration har FRET-histogrammet av X-0 endast en enda låg FRET-topp som motsvarar GEN1 bunden till antingen isomer av HJ som förutspåtts av modellen. Bindningen av GEN1 monomer till HJ följt av dimer formation är en unik egenskap hos eukaryota HJ resolvase GEN1 jämfört med prokaryota resolvaser som finns i dimeric form i lösning.Ytterligare bevis för att GEN1 monomer binder och snedvrider HJ är observation av ett betydande antal spår av morrågiga partiklar med en stabil låg FRET tillstånd i närvaro av magnesium vid låga GEN1 koncentrationer. Den samtidiga avgång av givaren och acceptor efter en stabil låg FRET tillstånd i spår av löst X-0 som uppstår utan uppkomsten av en mellanliggande indikerar att en fullständig upplösning sker inom livslängden för GEN1 HJ komplex. Observera att bakgrunden från den funktionaliserade glasytan inte bör överstiga några fläckar och att jämnt fördelade partiklar är väsentliga för att få goda resultat.Använd alltid personlig skyddsutrustning och en draghuva samtidigt som du förbereder serialiseringsbilden. Var noga med att bära skyddsglasögon som är specifika för våglängderna när du arbetar med laser. Andra metoder som cryo ap, kärnmagnetisk resonans, kan ge atomär nivå strukturella detaljer.Denna information är integrerad för utformningen och tolkningen av den enda molekylen FRET experiment. Single molecule FRET öppna nya vyer inom området DNA-replikation vilket resulterar i djupare förståelse av mekanismerna för åtgärder helicases och nukleaser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detektion av mikroRNA-uttryck i peritonealt membran hos råttor med användning av kvantitativ realtids-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Enda molekyl Analys av Laser Lokaliserade psoralen Addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifiera mutationer genom högupplöst smältning i en TILLING population av ris

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformering, genom-redigering och fenotypning av kvävefixerande tropiska Cannabaceae träd Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Effektivt transkriptionsstyrt plasmiduttryckssystem för undersökning av stabiliteten hos mRNA-avskrifter i primära Alveolar Epitelceller

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...