Brug af Drosophila S2-celler til levende billeddannelse af celle division

Vores protokol kan bruges til at bestemme spacial og tidsmæssige dynamiske begivenheder under mitose, og kan også bruges til at visualisere virkningerne af mytotiske regulatorer i realtid. Ved hjælp af dobbelt farve billeddannelse giver mulighed for en samtidig analyse af to molekylære markører. For eksempel kan vi visualisere mikrotubuli af mytotiske spindel og den kinetiske kernestruktur af replikerede kromosomer.

For at fremkalde fluorescerende proteinudtryk, fire dage efter RNA-interferensbehandling, udsættes inducerende metallo-thyaninpromotortransficerede celler for en endelig koncentration på 500 mikromolar kobbersulfat i 24 til 36 timer. For at forberede fluorescerende protein, der udtrykker celler til billeddannelse, overføres cellerne til et sterilt 15 milliliterrør, og efter optælling sediment cellerne ved centrifugering. Opslæm pellet i frisk, 25 grader Celsius opvarmet SIM, suppleret med 10% FBS, på en to gange 10 til 6 celler pr milliliter koncentration, og behandle cellerne med yderligere 500 mikromolar kobbersulfat.

Derefter tilsættes 200 til 500 mikroliter af celler til en brønd af en multi-godt levende celle kammer, og placere kammeret på en omvendt fluorescerende mikroskop fase. Mens cellerne bosætter sig i kammeret, skal du åbne live cellebilleddannelsessoftwaren og klikke på nyt og eksperimentere. Hvis du vil indsætte en tidsfortidsløkke, som billederne skal tages over, skal du klikke på ikonet for den tidsforskãbe at sløjfe.

Indstil intervallet til sekunder, og divider den ønskede samlede eksperimentlængde i sekunder med intervallet for at angive antallet af cyklusser. Lad løkken gentage sig over den ønskede samlede tidsperiode. Hvis du vil indsætte en infrarød fokuskontrol for at bevare målsætningens fokus, skal du klikke på XY-ikonet for at flytte og vælge Z-afdriftkompensation for at tilføje et Z-afdriftkompensationstrin inden for tidsforskydningsløjfelaget.

Hvis du vil tillade anskaffelse af et billede med flere kanaler, skal du klikke på gruppeikonet med flere kanaler for at tilføje et gruppelag med flere kanaler og klikke på ikonet Tilføj en Z-stakløkke for at tilføje et Z-stakløkkelag. Derefter indstille den ønskede trinstørrelse og antallet af skiver, og indstille eksponeringen af hver kanal til så lavt som muligt for at minimere foto blegning. Hvis du vil afbilde en celledeling, skal du vælge en 40- eller 60 gange målsætning om nedsænkning af olie og mCherry florescence-kanalen og justere målet langs toppen eller bunden af brønden.

Derefter bevæge sig væk fra den lodrette brønd divider for at undgå interferens med Z drift kompensation trin. Find en eller flere celler i slutningen af G2- eller den tidlige M-fase, og klik på knappen Live View for at begynde at få vist celler på softwareskærmen. At finde passende celler ved G2-M-overgangen er nøglen til at afbildne en celledeling.

Find en celle med en intakt kerne og præcis to centrosomer for de bedste resultater. Brug mikroskopets fine fokusknap, fokus på de celler af interesse og klik på find offset for at indstille den infrarøde fokuskontrol. Klik på start for at starte det tidsforskydningsbilleddannelsesprogram, og vælg den ønskede kanal, og juster de gennemsnitlige pixelintensiteter for at justere histogrammerne efter behov for klart at visualisere de celler, der er af interesse.

Kontroller cellerne efter 15 til 20 minutter for at bekræfte, at den nukleare kuvert opdeling har fundet sted, som bestemt af forsvinden af den runde, mørke brydes stedet nær cellens centrum. Efter yderligere 15 til 20 minutter, kontrollere at afgøre, om anaphase debut har fundet sted. Stop derefter programmet, og gem filen.

For at bestemme den nukleare kuvert opdeling til anafase debut timing, skal du klikke på rammen op-knappen for at bestemme tidspunktet for nukleare kuvert opdeling og tidspunktet for den første kromosom adskillelse i minutter, og trække nedbrydningstiden fra debut tid for at opnå den nukleare kuvert opdeling til anaphase debut tid for en given celle. Fortsæt derefter med at scanne efter fordeprerede celler for at opnå flere ender i en given tilstand i op til 12 timer fra den første afregning. Celler, der er ved at opdele kan målrettes ved tilstedeværelsen af to centrosomes og en intakt kerne, som angivet ved brydes lys og en mørkere plet i cellen, når de ses i alpha tubulin kanal.

Nukleare kuvert opdeling kan visualiseres gennem forsvinden af denne mørke plet, hvilket resulterer i en ensartet farvning af cytoplasmaet. Efter nukleare kuvert opdeling, den tid hver celle tager at danne spindel og til kongressen og adskille kromosomer kan måles ved at bemærke de tidspunkter af disse begivenheder i forhold til nukleare kuvert opdeling. Behandling med dobbeltstrenget RNA rettet mod shortstop, en actin microtubule crosslinking protein mistænkes for at påvirke cellecyklus dynamik resulterer i en betydelig mytotisk forsinkelse.

Denne behandling resulterer i en betydelig forsinkelse, hvor mange celler arresterer ved metafasen og aldrig overgår til anaphase under hele det to til tre timers billedforsøg. Co-behandling med dobbeltstrenget RNA mod skud og hård handel, en vigtig del af dette checkpoint, fører til en undertrykkelse af anholdelsen fænotype, hvilket resulterer i nukleare kuvert opdeling til anaphase gange svarende til kontrollerede, ubehandlede celler. Sørg for at vælge passende celler, og spild ikke tidsbilleddannelsesceller, der ikke begynder i divisionen.

Hvis en celle ikke begynder at dele sig inden for 20 minutter, skal du finde en anden celle. Forskere kan følge denne procedure for at hjælpe med at identificere nye mytotiske regulatorer, eller eventuelt nye tørre forbindelser, der påvirker specifikke begivenheder i celledeling.