8.0K Views
•
00:06 min
•
August 23rd, 2019
DOI :
August 23rd, 2019
•0:04
Title
0:26
Fluorescent Protein Expression Induction and Cell Imaging Preparation
1:24
Live Cell Imaging Program Setup
2:34
Image Dividing Cells
4:31
Results: Representative Live Imaging of Cell Cycle Defects Due to Mitotic Checkpoint Activation in S2 Cells
5:50
Conclusion
Transcript
Ons protocol kan worden gebruikt om ruimtelijke en temporele dynamische gebeurtenissen te bepalen tijdens mitose, en kan ook worden gebruikt om de effecten van mytotische regelgevers in realtime te visualiseren. Met behulp van dubbele kleurbeeldvorming maakt een gelijktijdige analyse van twee moleculaire markers mogelijk. We kunnen bijvoorbeeld de microtubuli van de mytotische as en de kinetische kernstructuur van gerepliceerde chromosomen visualiseren.
Om fluorescerende eiwitexpressie te induceren, vier dagen na de behandeling van RNA-interferentie, stelt u induceerbare metallo-thyanine-promotor doorfecteerde cellen gedurende 24 tot 36 uur bloot aan een uiteindelijke concentratie van 500 micromolarkopersulfaat. Om het fluorescerende eiwit voor te bereiden dat cellen uitdrukt voor beeldvorming, breng je de cellen over naar een steriele buis van 15 milliliter en sediment de cellen na het tellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in verse, 25 graden Celsius opgewarmde SIM, aangevuld met 10%FBS, op een twee keer 10 tot de 6 cellen per milliliter concentratie, en behandelen de cellen met extra 500 micromolar kopersulfaat.
Voeg vervolgens 200 tot 500 microliter cellen toe aan een put van een multi-well live celkamer en plaats de kamer op een omgekeerde fluorescerende microscoopfase. Terwijl de cellen zich in de kamer vestigen, opent u de live celbeeldvormingssoftware en klikt u op nieuw en experimenteert u. Als u een timelapse-lus wilt invoegen waarover de afbeeldingen worden gemaakt, klikt u op het pictogram timelapse-lus.
Stel het interval in op seconden en verdeel de gewenste totale experimentlengte in seconden door het interval om het aantal cycli in te stellen. Laat de lus herhalen over de gewenste totale periode. Als u een infraroodfocuscontrole wilt invoegen om de focus van de doelstelling te behouden, klikt u op het pictogram XY verplaatsen en selecteert u Z driftcompensatie om een Z-driftcompensatiestap toe te voegen binnen de tijdslooplaag.
Als u de aankoop van een afbeelding met meerdere kanalen wilt toestaan, klikt u op het pictogram van de groep met meerdere kanalen om een meerkanaalsgroeplaag toe te voegen en klikt u op het pictogram van de stapellus toevoegen om een Z-stapelluslaag toe te voegen. Stel vervolgens de gewenste stapgrootte en het aantal segmenten in en stel de belichting van elk kanaal zo laag mogelijk in om het bleken van foto's te minimaliseren. Als u een celdeling wiltafbeeldingen, selecteert u een 40 of 60 keer olieonderdompelingsdoelstelling en het mCherry-florescentiekanaal en lijnt u het doel langs de boven- of onderkant van de put uit.
Ga dan weg van de verticale putverdeler om interferentie met de Z drift compensatie stap te voorkomen. Zoek een cel of cellen in de late G2- of vroege M-fase en klik op de knop Live View om cellen in het softwarescherm te bekijken. Het vinden van geschikte cellen op de G2 naar M overgang is de sleutel tot het beeldvorming van een celdeling.
Zoek een cel met een intacte kern en precies twee centrosomes voor de beste resultaten. Met behulp van de fijne focus knop van de microscoop, richten op de cellen van belang en klik op offset te vinden om de infrarood focus controle in te stellen. Klik op start om het time lapse imaging-programma te starten en selecteer het gewenste kanaal en pas de gemiddelde pixelintensiteiten aan om de histogrammen zo nodig aan te passen, om de cellen van belang duidelijk te visualiseren.
Controleer de cellen na 15 tot 20 minuten om te bevestigen dat de nucleaire envelop afbraak heeft plaatsgevonden, zoals bepaald door het verdwijnen van de ronde, donkere gebroken plek in de buurt van het centrum van de cel. Controleer na nog eens 15 tot 20 minuten of er een anafase is opgetreden. Stop vervolgens het programma en sla het bestand op.
Als u de kernentubsafbraak wilt bepalen tot de begintijd van de afbouw, klikt u op de knop frame-up om de tijd van kernenvelotoning en de tijd van de initiële chromosoomscheiding in enkele minuten te bepalen en de afbraaktijd van de begintijd af te trekken om de kernenpeiling te verkrijgen om de begintijd voor een bepaalde cel te verbreken. Ga vervolgens verder met scannen op voorverdelende cellen om meerdere uiteinden te verkrijgen voor een bepaalde voorwaarde gedurende maximaal 12 uur vanaf de eerste vestiging. Cellen die op het punt staan te delen, kunnen het doelwit zijn van de aanwezigheid van twee centrosomen en een intacte kern, zoals aangegeven door gebroken licht en een donkerdere vlek in de cel wanneer deze wordt bekeken in het alfa tubulinkanaal.
Nucleaire envelop afbraak kan worden gevisualiseerd door het verdwijnen van deze donkere plek, wat resulteert in de uniforme kleuring van het cytoplasma. Na het uitvallen van de nucleaire envelop kan de tijd die elke cel neemt om de as te vormen en de chromosomen te scheiden worden gemeten door de tijdspunten van deze gebeurtenissen te noteren ten opzichte van de kernpeiling. Behandeling met dubbel gestrand RNA gericht tegen korte stop, een actine microtubuli crosslinking eiwit waarvan wordt vermoed dat het de celcyclusdynamiek beïnvloedt, resulteert in een aanzienlijke mytotische vertraging.
Deze behandeling resulteert in een aanzienlijke vertraging, met veel cellen die bij de metafase worden gearresteerd en nooit overgaan naar een afase tijdens het hele beeldvormingsexperiment van twee tot drie uur. Co-behandeling met dubbelstrengs RNA tegen schot en ruwe deal, een belangrijk onderdeel van dit checkpoint, leidt tot een onderdrukking van het arrestatiefenotype, wat resulteert in nucleaire enveloppe afbraak naar anafase tijden vergelijkbaar met gecontroleerde, onbehandelde cellen. Zorg ervoor dat u de juiste cellen selecteert en verspil geen tijd aan het imaging-cellen die niet beginnen met deling.
Als een cel niet binnen 20 minuten begint te delen, zoekt u een andere cel. Onderzoekers kunnen deze procedure volgen om te helpen bij het identificeren van nieuwe mytotische regelgevers, of mogelijk nieuwe droge verbindingen die specifieke gebeurtenissen in celdeling beïnvloeden.
Celsplitsingen kunnen in real-time worden gevisualiseerd met behulp van fluorescently gelabelde eiwitten en timelapse-microscopie. Met behulp van het protocol hier gepresenteerd, gebruikers kunnen analyseren celdeling timing dynamiek, mitotische spindel assemblage, en chromosoom congressen en segregatie. Defecten in deze gevallen na RNA-interferentie (RNAi)-gemedieerde Gene knockdown kunnen worden beoordeeld en bepaald.
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved