सेल डिवीजन के लाइव इमेजिंग के लिए Drosophila S2 कोशिकाओं का उपयोग

हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोसिस के दौरान रिक्ति और लौकिक गतिशील घटनाओं को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, और वास्तविक समय में मायटोटिक नियामकों के प्रभावों की कल्पना करने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है। दोहरी रंग इमेजिंग का उपयोग दो आणविक मार्कर के एक साथ विश्लेषण की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, हम मायटोटिक धुरी के माइक्रोट्यूबल और दोहराए गए गुणसूत्रों की गतिज कोर संरचना की कल्पना कर सकते हैं।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, आरएनए हस्तक्षेप उपचार के चार दिन बाद, 24 से 36 घंटे के लिए 500 माइक्रोमोलर कॉपर सल्फेट की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रेरक धातु-थायनिन प्रमोटर संक्रमित कोशिकाओं को बेनकाब करें। इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, कोशिकाओं को बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और, गिनती के बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को तलछट करें। ताजा, 25 डिग्री सेल्सियस गर्म सिम में गोली को फिर से खर्च करें, 10% एफबीएस के साथ पूरक, दो बार 10 से 6 कोशिकाओं को मिलीलीटर एकाग्रता, और अतिरिक्त 500 माइक्रोमॉलर कॉपर सल्फेट के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।

फिर एक बहु-अच्छी तरह से लाइव सेल कक्ष के एक कुएं में कोशिकाओं के 200 से 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कक्ष को एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप चरण पर रखें। जबकि कोशिकाओं कक्ष में बसने रहे हैं, लाइव सेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलने के लिए और नए और प्रयोग पर क्लिक करें । एक समय चूक पाश जिस पर छवियों को लिया जाएगा डालने के लिए, समय चूक पाश आइकन पर क्लिक करें ।

अंतराल को सेकंड के लिए सेट करें, और चक्रों की संख्या निर्धारित करने के लिए अंतराल द्वारा सेकंड में वांछित समग्र प्रयोग लंबाई विभाजित करें। लूप को वांछित कुल समय अवधि में दोहराने की अनुमति दें। उद्देश्य का ध्यान बनाए रखने के लिए एक अवरक्त फोकस चेक डालने के लिए, मूव एक्सवाई आइकन पर क्लिक करें और समय चूक लूप लेयर के भीतर जेड बहाव क्षतिपूर्ति कदम जोड़ने के लिए जेड बहाव मुआवजा का चयन करें।

मल्टी-चैनल इमेज के अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए, मल्टी-चैनल ग्रुप आइकन को मल्टी-चैनल ग्रुप लेयर जोड़ने के लिए क्लिक करें, और जेड स्टैक लूप लेयर जोड़ने के लिए जेड स्टैक लूप आइकन जोड़ने पर क्लिक करें। फिर वांछित चरण आकार और स्लाइस की संख्या निर्धारित करें, और फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए प्रत्येक चैनल के एक्सपोजर को यथासंभव कम करें। एक सेल डिवीजन छवि के लिए, एक 40 या 60 बार तेल विसर्जन उद्देश्य, और mCherry फ्लोरेस चैनल का चयन करें, और अच्छी तरह से ऊपर या नीचे के साथ उद्देश्य संरेखित करें।

फिर जेड बहाव मुआवजा कदम के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए ऊर्ध्वाधर कुएं डिवाइडर से दूर ले जाएं। देर से G2 या जल्दी एम चरण में एक सेल या कोशिकाओं का पता लगाएं, और सॉफ्टवेयर स्क्रीन में कोशिकाओं को देखने शुरू करने के लिए लाइव व्यू बटन पर क्लिक करें । जी-2 से एम संक्रमण में उपयुक्त कोशिकाओं को ढूंढना सेल डिवीजन इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है।

सर्वोत्तम परिणामों के लिए एक अक्षुण्ण नाभिक और वास्तव में दो सेंट्रोसोम के साथ एक कोशिका का पता लगाएं। माइक्रोस्कोप के ठीक फोकस घुंडी का उपयोग करना, ब्याज की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें और इन्फ्रारेड फोकस चेक सेट करने के लिए ऑफसेट खोजने पर क्लिक करें। समय चूक इमेजिंग कार्यक्रम शुरू करने के लिए शुरू पर क्लिक करें, और वांछित चैनल का चयन करें और आवश्यक के रूप में हिस्टोग्राम समायोजित करने के लिए मतलब पिक्सेल तीव्रता को समायोजित करें, स्पष्ट रूप से ब्याज की कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए ।

15 से 20 मिनट के बाद कोशिकाओं की जांच करने की पुष्टि करने के लिए कि परमाणु लिफाफा टूटने हुआ है, के रूप में दौर के लापता होने से निर्धारित, सेल के केंद्र के पास अंधेरे अपवर्तित जगह । एक और 15 से 20 मिनट के बाद, यह निर्धारित करने के लिए जांच करें कि एनाफेज शुरुआत हुई है या नहीं। फिर कार्यक्रम बंद करें और फ़ाइल को सहेजें।

परमाणु लिफाफा टूटने का निर्धारण करने के लिए एनाफेज शुरुआत समय के लिए, फ्रेम अप बटन पर क्लिक करें परमाणु लिफाफा टूटने का समय और मिनटों में प्रारंभिक गुणसूत्र जुदाई के समय का निर्धारण करने के लिए, और एक दिए गए सेल के लिए anaphase शुरुआत समय के लिए परमाणु लिफाफा टूटने प्राप्त करने के लिए शुरुआत के समय से टूटने के समय घटाना । फिर प्रारंभिक बसने से 12 घंटे तक के लिए एक दिए गए हालत के लिए कई सिरों को प्राप्त करने के लिए पूर्व-विभाजन कोशिकाओं के लिए स्कैनिंग जारी रखें। कोशिकाओं है कि विभाजित करने के बारे में दो सेंट्रोसोम्स और एक अक्षुण्ण नाभिक की उपस्थिति से लक्षित किया जा सकता है, के रूप में अपवर्तित प्रकाश और सेल के भीतर एक गहरे रंग की जगह जब अल्फा ट्यूबलिन चैनल में देखा द्वारा संकेत मिलता है ।

परमाणु लिफाफा टूटने इस अंधेरे स्थान के गायब होने के माध्यम से कल्पना की जा सकती है, जिसके परिणामस्वरूप साइटोप्लाज्म की वर्दी रंग। परमाणु लिफाफा टूटने के बाद, समय प्रत्येक सेल धुरी बनाने के लिए और कांग्रेस के लिए लेता है और गुणसूत्रों को अलग परमाणु लिफाफा टूटने के सापेक्ष इन घटनाओं के समय अंक टिप्पण द्वारा मापा जा सकता है । डबल फंसे आरएनए के साथ उपचार शॉर्टस्टॉप के खिलाफ लक्षित, एक ऐक्टिन माइक्रोट्यूबुल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन सेल चक्र गतिशीलता को प्रभावित करने के लिए एक महत्वपूर्ण mytotic देरी में परिणाम संदिग्ध ।

इस उपचार के परिणामस्वरूप एक महत्वपूर्ण देरी होती है, जिसमें कई कोशिकाएं मेटाफेज पर गिरफ्तार होती हैं और पूरे दो से तीन घंटे के इमेजिंग प्रयोग के दौरान एनाफेज में संक्रमण नहीं करती हैं। शॉट और किसी न किसी सौदे के खिलाफ डबल फंसे आरएनए के साथ सह-उपचार, इस चौकी का एक महत्वपूर्ण घटक, गिरफ्तारी फेनोटाइप का दमन होता है, जिसके परिणामस्वरूप नियंत्रित, अनुपचारित कोशिकाओं के समान एनाफेज समय के लिए परमाणु लिफाफा टूटने का परिणाम होता है । उपयुक्त कोशिकाओं का चयन करना सुनिश्चित करें, और समय इमेजिंग कोशिकाओं को बर्बाद न करें जो विभाजन शुरू नहीं करते हैं।

यदि कोई कोशिका 20 मिनट के भीतर विभाजित होना शुरू नहीं होती है, तो दूसरी कोशिका ढूंढें। शोधकर्ता इस प्रक्रिया का पालन करने में मदद करने के लिए नए mytotic नियामकों, या संभवतः उपंयास शुष्क यौगिकों कि सेल विभाजन में विशिष्ट घटनाओं को प्रभावित की पहचान कर सकते हैं ।