当社のプロトコルは、有糸分裂時の静時および時間的動的事象を決定するために使用することができ、また、リアルタイムでの組織の効果を可視化するために使用することができます。デュアルカラーイメージングを使用すると、2つの分子マーカーを同時に解析できます。例えば、複製染色体のミクロチューブと、その動態のコア構造を可視化することができます。
蛍光タンパク質発現を誘導するために、RNA干渉処理の4日後に、誘導性メタロ・チアニインプロモータートランスフェクション細胞を24〜36時間の間500マイクロモル硫酸銅の最終濃度に曝露する。蛍光タンパク質発現細胞をイメージング用に調製するために、細胞を無菌15ミリリットルチューブに移し、そして、カウント後、遠心分離によって細胞を沈下する。新鮮な25°Cの加温SIMでペレットを再懸濁し、10%FBSで補い、1ミリリットル当たり6細胞に2倍10で、さらに500ミクロモル硫酸銅で細胞を処理する。
その後、マルチウェルライブセルチャンバーの1つのウェルに200〜500マイクロリットルの細胞を加え、逆蛍光顕微鏡ステージにチャンバーを置きます。細胞がチャンバーに落ち着いている間に、ライブセルイメージングソフトウェアを開き、新しい実験をクリックします。画像が撮影されるタイムラプスループを挿入するには、タイムラプスループアイコンをクリックします。
間隔を秒に設定し、必要な全体の実験の長さを秒単位で割って、サイクル数を設定します。ループを目的の合計期間に繰り返します。目標のフォーカスを維持するために赤外線フォーカスチェックを挿入するには、移動 XY アイコンをクリックし、[Z ドリフト補正]を選択して、タイムラプス ループ レイヤー内に Z ドリフト補正ステップを追加します。
マルチチャンネル画像の取得を許可するには、マルチチャンネルグループアイコンをクリックしてマルチチャンネルグループレイヤーを追加し、[Zスタックループを追加]アイコンをクリックしてZスタックループレイヤーを追加します。次に、希望のステップサイズとスライス数を設定し、写真の漂白を最小限に抑えるために、各チャンネルの露出をできるだけ低く設定します。細胞分裂を画像化するには、油浸し目標の40倍または60倍、およびmCherryの蛍光チャネルを選択し、ウェルの上部または下部に沿って目的を揃えます。
次に、Zドリフト補正ステップとの干渉を避けるために、垂直井戸ディバイダから離します。G2 後期または初期 M フェーズでセルを見つけ、ライブ ビュー ボタンをクリックして、ソフトウェア画面でセルの表示を開始します。G2からMへの移行で適切な細胞を見つけることは、細胞分裂をイメージングする鍵です。
最良の結果を得るには、無傷の核と正確に2つのセントロソームを持つ細胞を見つけます。顕微鏡の細かいフォーカスノブを使用して、対象のセルに焦点を当て、オフセットを見つけるをクリックして赤外線フォーカスチェックを設定します。[開始]をクリックしてタイムラプスイメージングプログラムを開始し、目的のチャンネルを選択し、必要に応じて平均ピクセル強度を調整してヒストグラムを調整し、対象の細胞を明確に視覚化します。
15~20分後に細胞を調べて、細胞の中心付近の丸くて暗い屈折した場所の消失によって決定された核エンベロープの分解が起こったことを確認します。さらに15~20分後に、アナフェーズ発症が発生したかどうかを確認します。その後、プログラムを停止し、ファイルを保存します。
核エンベロープの分解を解剖学的発症タイミングに決定するには、フレームアップボタンをクリックして、核エンベロープの分解時間と初期染色体分離の時間を分単位で決定し、発症時から分解時間を差し引いて、特定の細胞の解剖発症時間に核エンベロープの分解を得る。次に、細胞の事前分割をスキャンし続け、最初の沈降から最大12時間、所定の条件で複数の端を得ます。分裂しようとしている細胞は、アルファチューブリンチャネルで見たときに屈折光と細胞内の暗いスポットによって示されるように、2つのセントロソームと無傷の核の存在によって標的とすることができる。
核エンベロープの分解は、この暗い場所の消失を通して視覚化することができ、細胞質の均一な着色をもたらす。核エンベロープの分解後、各細胞がスピンドルを形成し、議会に、染色体を分離するためにかかる時間は、核エンベロープの分解に関連してこれらの事象の時点を注意して測定することができます。遊撃手に対して標的となる二重鎖RNAによる治療は、細胞周期ダイナミクスに影響を与えると疑われるアクチン微小管架橋タンパク質が、著しい菌体遅延をもたらす。
この治療は、多くの細胞がメタフェーズで逮捕され、2〜3時間のイメージング実験全体でアナフェーズに移行することはありません。このチェックポイントの重要な成分であるショットとラフディールに対する二本鎖RNAとの共処理は、逮捕表現型の抑制をもたらし、核エンベロープが制御された未処理細胞と同様の解相時間まで分解する結果となる。適切な細胞を選択し、分裂を開始しない細胞をイメージングする時間を無駄にしないでください。
セルが 20 分以内に分割されない場合は、別のセルを検索します。研究者は、新しい菌細症の調節因子、またはおそらく細胞分裂の特定の事象に影響を与える新しい乾燥化合物を同定するために、この手順に従うことができます。
