Bruk av Drosophila S2 Cells for Live Imaging av Cell Division

Vår protokoll kan brukes til å bestemme spacial og timelige dynamiske hendelser under mitose, og kan også brukes til å visualisere effekten av mytotiske regulatorer i sanntid. Ved hjelp av dobbel fargeavbildning gir en samtidig analyse av to molekylære markører. For eksempel kan vi visualisere mikrotubuli av mytotisk spindel og den kinetiske kjernestrukturen til replikerte kromosomer.

For å indusere fluorescerende proteinuttrykk, fire dager etter RNA interferensbehandling, utsetter induserbare metallo-thyanintransfectede celler til en endelig konsentrasjon på 500 mikrorør kobbersulfat i 24 til 36 timer. For å forberede fluorescerende protein som uttrykker celler for avbildning, overfør cellene til et sterilt 15 milliliter rør, og etter telling sedimenter cellene ved sentrifugering. Resuspend pellet i frisk, 25 grader Celsius varmet SIM, supplert med 10% FBS, på en to ganger 10 til 6 celler per milliliter konsentrasjon, og behandle cellene med ytterligere 500 mikromus kobbersulfat.

Deretter legger du til 200 til 500 mikroliter celler til en brønn av et flerbrønns levende cellekammer, og plasser kammeret på et omvendt fluorescerende mikroskopstadium. Mens cellene bosetter seg i kammeret, åpner du live cellebildeprogramvaren og klikker på ny og eksperimenterer. Hvis du vil sette inn en tidsforløpssløyfe som bildene skal tas over, klikker du på tidsforløpssløyfeikonet.

Sett intervallet til sekunder, og del ønsket total eksperimentlengde i sekunder med intervallet for å angi antall sykluser. La løkken gjenta over ønsket total tidsperiode. Hvis du vil sette inn en infrarød fokuskontroll for å opprettholde fokuset på målet, klikker du på flytt XY-ikonet og velger Z driftkompensasjon for å legge til et Z-driftkompensasjonstrinn innen tidsforløpssløyfelaget.

Hvis du vil tillate anskaffelse av et flerkanalsbilde, klikker du på gruppeikonet for flere kanaler for å legge til et gruppelag med flere kanaler, og klikker ikonet legg til en Z-stakksløyfe for å legge til et Z-stabelsløyfelag. Still deretter inn ønsket trinnstørrelse og antall skiver, og sett eksponeringen for hver kanal til så lav som mulig for å minimere bleking av bilder. Hvis du vil se for deg en celledeling, velger du et mål om 40 eller 60 ganger oljenedsenking, og mCherry florescence-kanalen, og justerer målet øverst eller nederst i brønnen.

Flytt deretter bort fra den vertikale brønndeleren for å unngå interferens med Z driftkompensasjonstrinnet. Finn en celle eller celler i slutten av G2- eller tidlig M-fasen, og klikk på live view-knappen for å begynne å vise celler i programvareskjermen. Å finne passende celler ved G2 til M-overgangen er nøkkelen til å forestille seg en celledeling.

Finn en celle med en intakt kjerne og nøyaktig to centrosomes for best resultat. Bruk den fine fokusknappen på mikroskopet, fokuser på cellene av interesse og klikk finn forskyvning for å angi infrarød fokuskontroll. Klikk start for å starte tidsforløpsprogrammet, og velg ønsket kanal og juster gjennomsnittspikselintensitetene for å justere histogrammene etter behov, for å visualisere interessecellene tydelig.

Sjekk cellene etter 15 til 20 minutter for å bekrefte at atomkonvoluttsammenbruddet har skjedd, som bestemt av forsvinningen av det runde, mørke brytesstedet nær cellens sentrum. Etter ytterligere 15 til 20 minutter, sjekk for å finne ut om anaphase utbruddet har oppstått. Deretter stopper programmet og lagrer filen.

For å bestemme atomkonvoluttsammenbrudd for å anafase utbruddet timing, klikk på rammen opp knappen for å bestemme tidspunktet for kjernefysisk konvolutt sammenbrudd og tidspunktet for første kromosom separasjon i minutter, og trekke nedbrytningstiden fra begynnelsen tid for å få kjernefysisk konvolutt sammenbrudd for å anaphase utbruddet tid for en gitt celle. Fortsett deretter å skanne etter pre-dividering celler for å få flere ender for en gitt tilstand i opptil 12 timer fra den første bosettingen. Celler som er i ferd med å dele kan målrettes av tilstedeværelsen av to centrosomes og en intakt kjerne, som indikert av refracted lys og et mørkere sted i cellen når sett i alfa tubulin kanal.

Kjernefysisk konvolutt sammenbrudd kan visualiseres gjennom forsvinningen av dette mørke stedet, noe som resulterer i ensartet farfaring av cytoplasma. Etter atomkonvolutt sammenbrudd, tiden hver celle tar for å danne spindelen og til kongressen og segregere kromosomene kan måles ved å legge til tidspunktene for disse hendelsene i forhold til kjernefysisk konvolutt sammenbrudd. Behandling med dobbelt strandet RNA rettet mot shortstop, en actin microtubule crosslinking protein mistenkt for å påvirke celle syklus dynamikk resulterer i en betydelig mytotisk forsinkelse.

Denne behandlingen resulterer i en betydelig forsinkelse, med mange celler som arresterer ved metafasen og aldri går over til anafase under hele to til tre timers bildeeksperiment. Samtidig behandling med dobbelttrådet RNA mot skudd og grov avtale, en viktig del av dette kontrollpunktet, fører til en undertrykkelse av arrestfenotypen, noe som resulterer i atomkonvolutt sammenbrudd til anafase ganger som ligner på kontrollerte, ubehandlede celler. Pass på å velge passende celler, og ikke kast bort tid av imaging celler som ikke begynner divisjon.

Hvis en celle ikke begynner å dele seg innen 20 minutter, finner du en annen celle. Forskere kan følge denne prosedyren for å identifisere nye mytotiske regulatorer, eller muligens nye tørre forbindelser som påvirker spesifikke hendelser i celledeling.