Användning av Drosophila S2-celler för levande avbildning av cell delning

Vårt protokoll kan användas för att bestämma spacial och tidsmässiga dynamiska händelser under mitos, och kan också användas för att visualisera effekterna av mytotiska regulatorer i realtid. Använda dubbla färgavbildning möjliggör en samtidig analys av två molekylära markörer. Vi kan till exempel visualisera mikrotubuli i den mytotiska spindeln och den kinetiska kärnstrukturen hos replikerade kromosomer.

Att inducera fluorescerande protein uttryck, fyra dagar efter RNA-interferens behandling, exponera inducible metallo-thyanin promotorn transfected celler till en slutlig koncentration av 500 mikromolar kopparsulfat i 24 till 36 timmar. För att förbereda det fluorescerande proteinet som uttrycker celler för avbildning, överför cellerna till ett sterilt 15 milliliterrör, och, efter att ha räknat, sedimentera cellerna genom centrifugeringen. Resuspend pelleten i färska, 25 grader Celsius värms SIM, kompletterad med 10%FBS, vid en två gånger 10 till 6 celler per milliliter koncentration, och behandla cellerna med ytterligare 500 mikromolarmiska sulfat.

Tillsätt sedan 200 till 500 mikroliter celler till en brunn av en multi-well levande cellkammare, och placera kammaren på en inverterad fluorescerande mikroskop skede. Medan cellerna bosätter sig i kammaren, öppna levande cell bildbehandling programvara och klicka på nya och experimentera. Om du vill infoga en tidsförloppsslinga över vilken bilderna ska tas klickar du på ikonen för tidsförloppssling.

Ställ in intervallet på sekunder, och dela den önskade övergripande experimentlängden i sekunder med intervallet för att ställa in antalet cykler. Låt slingan upprepas under den önskade totala tidsperioden. Om du vill infoga en IR-fokuskontroll för att behålla målets fokus klickar du på ikonen för flytta XY och väljer Z-avdriftskompensation för att lägga till ett Z-avdriftskompensationssteg inom skiktet för loopar för tidsförlopp.

Om du vill tillåta anskaffning av en flerkanalsbild klickar du på gruppikonen för flera kanaler för att lägga till ett grupplager med flera kanaler och klickar på ikonen lägg till en Z-stackslinga för att lägga till ett Z-stackslinglager. Ställ sedan in önskad stegstorlek och antal skivor, och ställ in exponeringen för varje kanal på så låg som möjligt för att minimera fotoblekning. För att avbilda en celldelning väljer du ett mål för 40 eller 60 gånger oljebadning, och mCherry-florescencekanalen, och riktar målet längs brunnens över- eller underdel.

Flytta sedan bort från den vertikala brunnsavdelaren för att undvika störningar i Z-avdriftskompenseringssteget. Leta reda på en cell eller celler i sen G2- eller tidig M-fas och klicka på livevisningsknappen för att börja visa celler i programvaruskärmen. Att hitta lämpliga celler vid G2 till M övergången är nyckeln till imaging en celldelning.

Lokalisera en cell med en intakt kärna och exakt två centrosomes för bästa resultat. Med hjälp av den fina fokus ratten i mikroskop, fokusera på cellerna av intresse och klicka hitta offset för att ställa in infraröd fokus check. Klicka på start för att initiera programmet för avbildning av tidsförlopp, och välj önskad kanal och justera medelvärdet av pixelintensiteterna för att justera histogrammen efter behov, för att tydligt visualisera cellerna av intresse.

Kontrollera cellerna efter 15 till 20 minuter för att bekräfta att kärnkuvertet haveriet har inträffat, vilket bestäms av försvinnandet av den runda, mörka bryts plats nära cellens centrum. Efter ytterligare 15 till 20 minuter, kontrollera för att avgöra om anafas debut har inträffat. Stoppa sedan programmet och spara filen.

För att bestämma kärnkuvertuppdelningen till anafas insjuknat timing, klicka på knappen ram upp för att bestämma tiden för kärnkuvert uppdelning och tidpunkten för inledande kromosom separation i minuter, och subtrahera uppdelningstiden från insjuknat tid för att få kärnkuvertet uppdelning till anaphase insjuknat tid för en viss cell. Fortsätt sedan skanna efter för dividerande celler för att få flera ändar för ett givet villkor i upp till 12 timmar från den inledande sedimentering. Celler som är på väg att dela sig kan riktas genom förekomsten av två centrosomes och en intakt kärna, som anges av bryts ljus och en mörkare plats i cellen när de ses i alfa tubulin kanal.

Kärnkuvert uppdelning kan visualiseras genom försvinnandet av denna mörka fläck, vilket resulterar i enhetlig färgning av cytoplasman. Efter kärn- kuverthaveri, den tid som varje cell tar för att bilda spindlen, och till kongressen och segregera kromosomerna kan mätas, genom att notera pekar av dessa händelser släkting till kärn- kuvertsammandelning. Behandling med dubbel strandsatta RNA riktade mot shortstop, en aktin mikrotubuli crosslinking protein misstänks påverka cellcykel dynamik resulterar i en betydande mytotic fördröjning.

Denna behandling resulterar i en betydande fördröjning, med många celler som arresterar vid metafasen och aldrig övergår till anafas under hela två till tre timmars bildframställning experiment. Sambehandling med dubbelsträngat RNA mot skott och grov affär, en viktig komponent i denna kontrollpunkt, leder till ett undertryckande av gripandet fenotyp, vilket resulterar i nukleära kuvert uppdelning till anafas gånger liknar kontrollerade, obehandlade celler. Var noga med att välja lämpliga celler, och slösa inte tid avbildning celler som inte börjar division.

Om en cell inte börjar dela sig inom 20 minuter hittar du en annan cell. Forskare kan följa detta förfarande för att identifiera nya mytotiska tillsynsmyndigheter, eller möjligen nya torra föreningar som påverkar specifika händelser i celldelning.