Name: chronic salmonella infection induced intestinal fibrosis
Uploaded: 2019-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis at JoVE.com

Vi takker Ingrid Barta for histologi tjenester.

Alle dyre protokoller blev godkendt af dyresundheds komiteen på University of British Columbia.
1. forberedelse af salmonella typhimurium ΔAroA kulturer for oral sonde af mus
<ol><li>Fra en frosset glycerol bestand af S. Typhimurium ΔAroA, Forbered en stribe plade ved hjælp af LB agar indeholdende 100 μg/mL streptomycin med en steril inokulerende løkke. Inkuber natten over ved 37 °C. Stribe pladerne kan opbevares i op til en uge ved 4 °C.</li>
	<li>En dag før infek...

<ol>
	<li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+colitis.">Ulcerative colitis.</a> New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).</li><li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+disease.">Crohn's disease.</a> The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li><li>Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+inflammatory+bowel+disease+pathogenesis:+linking+host+genetics+and+the+microbiome.">Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome.</a> Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).</li><li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li><li>Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+immunopathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).</li><li>Ogura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frameshift+mutation+in+NOD2+associated+with+susceptibility+to+Crohn's+disease.">A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease.</a> Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).</li><li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease.">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li><li>Rivas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+resequencing+of+GWAS+loci+identifies+independent+rare+variants+associated+with+inflammatory+bowel+disease.">Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease.</a> Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).</li><li>Rioux, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+new+susceptibility+loci+for+Crohn+disease+and+implicates+autophagy+in+disease+pathogenesis.">Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis.</a> Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).</li><li>Uhlig, H. H., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+intestinal+inflammation+as+tools+to+understand+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).</li><li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li><li>Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+enteric+Salmonella+infections.">Pathogenesis of enteric Salmonella infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).</li><li>Barthel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host.">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li><li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Enteric+Salmonella+Infection+in+Mice+Leads+to+Severe+and+Persistent+Intestinal+Fibrosis.">Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li><li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aromatic-dependent+Salmonella+typhimurium+are+non-virulent+and+effective+as+live+vaccines.">Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li><li>Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+Salmonella+virulence+and+host+resistance.">Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).</li><li>Valdez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nramp1+drives+an+accelerated+inflammatory+response+during+Salmonella-induced+colitis+in+mice.">Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).</li><li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORalpha+and+group+3+innate+lymphoid+cells+drive+fibrosis+in+a+mouse+model+of+Crohn's+disease.">The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease.</a> Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).</li><li>Burke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenesis+in+Crohn's+disease.">Fibrogenesis in Crohn's disease.</a> American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).</li><li>Hogan, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+and+regeneration+of+the+respiratory+system:+complexity,+plasticity,+and+mechanisms+of+lung+stem+cell+function.">Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).</li><li>Fiocchi, C., Lund, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themes+in+fibrosis+and+gastrointestinal+inflammation.">Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).</li><li>Rieder, F., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis+in+IBD&#8212;a+dynamic,+multifactorial+process.">Intestinal fibrosis in IBD&#8212;a dynamic, multifactorial process.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).</li><li>Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+for+adult+Crohn's+disease:+what+is+the+actual+risk?.">Surgery for adult Crohn's disease: what is the actual risk?.</a> Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).</li><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis.">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).</li><li>Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picrosirius+staining+plus+polarization+microscopy,+a+specific+method+for+collagen+detection+in+tissue+sections.">Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections.</a> Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).</li><li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22+Preserves+Gut+Epithelial+Integrity+and+Promotes+Disease+Remission+during+Chronic+Salmonella+Infection.">IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection.</a> Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).</li><li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IL-13+triggers+TGF-beta1-dependent+tissue+fibrosis+in+chronic+2,4,6-trinitrobenzene+sulfonic+acid+colitis.">Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).</li><li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-13+signaling+via+IL-13R+alpha2+induces+major+downstream+fibrogenic+factors+mediating+fibrosis+in+chronic+TNBS+colitis.">IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis.</a> Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).</li><li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis+is+reduced+by+early+elimination+of+inflammation+in+a+mouse+model+of+IBD:+impact+of+a+&amp;#34;Top-Down&amp;#34;+approach+to+intestinal+fibrosis+in+mice.">Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a &amp;#34;Top-Down&amp;#34; approach to intestinal fibrosis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).</li><li>Darfeuille-Michaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+adherent-invasive+Escherichia+coli+associated+with+ileal+mucosa+in+Crohn's+disease.">High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).</li><li>Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+infection+with+Crohn's+disease-associated+adherent-invasive+Escherichia+coli+leads+to+chronic+inflammation+and+intestinal+fibrosis.">Persistent infection with Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis.</a> Nature Communications. 4, 1957 (2013).</li><li>Imai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin-mediated+activation+of+IL-33-ST2+signaling+by+a+pathobiont+promotes+intestinal+fibrosis.">Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis.</a> Mucosal Immunology. , (2019).</li></ol>

Vores forståelse af patogenesen af IBD er blevet stærkt forstærket af musemodeller af tarmbetændelse. Selv om sådanne individuelle modeller ikke rekapitulerer alle funktioner i den komplekse og multifaktorielle menneskelige sygdom, de har været nyttige i at identificere centrale elementer i sygdomsprogression. Fibrotiske strikturer forbundet med IBD er fortsat et stort uopfyldt klinisk behov, da aktuelle behandlinger er ineffektive til at vende sygdomsudvikling. Desuden er intestinal fibrose svært at studere i et ...

Ulcerativ colitis (UC) og Crohns sygdom (CD) er de to vigtigste former for IBD og er karakteriseret som kroniske og recidiverende inflammatoriske lidelser i mave-tarmkanalen 1,2. Disse lidelser har stor indflydelse på patienternes livskvalitet. Symptomerne på IBD omfatter abdominalsmerter, diarré, kvalme, vægttab, feber, og træthed3. Nylige undersøgelser har identificeret genetiske og miljømæssige faktorer, der bidrager til sygdoms patogenese; Det menes, at sådanne risikofaktorer bidrager til forstyrrelsen af epitelial barrieren, hvilket resulterer i translokation eller oversampling af luminale antigener4. Som en konsekvens, dette indleder en afvigende inflammatorisk reaktion på den kommensal flora medieret af tarm immunceller4. Funktioner af IBD-associerede komplikationer kan strække sig til steder ud over mave-tarmkanalen påvirker forskellige organer, herunder leddene, hud, og leveren1,2. Kendetegn for UC omfatter svær og diffus inflammation typisk lokaliseret i tyktarmen1. Sygdoms patologi påvirker slimhinden og submucosa i tarmen, hvilket resulterer i overfladiske slimhinde ulcerationer1. I modsætning, CD kan påvirke nogen del af mave-tarmkanalen selvom tegn på sygdom er almindeligt forekommende i tyktarmen og distale ileum2. Desuden er betændelse i CD transmural, påvirker alle lag af tarmvæggen2.
Adskillige IBD-følsomheds gener, der er blevet identificeret, indikerer, at dysregulering af epitelial barrieren eller immuniteten er kritiske bidragydere til sygdomsprogression5. Mutationer i nucleotidoligomerisering domæne 2 (NOD2) udtrykt ved monocytter blev fundet at være forbundet med øget følsomhed over for CD; Dette fremhæver en sammenhæng mellem ændret medfødte immun påvisning af bakterie komponenter og sygdommen6. Nyere Genome-dækkende Associations studier (GWAS) har afsløret yderligere veje, som potentielt er involveret i IBD'S patogenese, herunder genetiske variationer i: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R afhængige veje knyttet til adaptive immunitet, MUC1, MUC19, og PTGER4 i intestinal barriere vedligeholdelse, og ATG16L-medieret autophagy7,8,9. Mens disse populations-baserede genetik undersøgelser har forbedret vores forståelse af IBD, modtagelighed alleler alene er sandsynligvis utilstrækkelige i initiering og opretholdelse af kronisk sygdom3. Andre ikke-genetiske faktorer, herunder ændringer i tarm mikrobiom sammensætning og en reduktion i mangfoldighed har været forbundet med tarmbetændelse. Det er imidlertid uklart, om Gut dysbiosis går forud for eller er konsekvensen af dysregulerede immunrespons3. Selvom etiologien af IBD fortsat er uklar, vores forståelse af patogenesen af sygdommen er blevet forstærket af eksperimentelle musemodeller af tarmbetændelse10,11. Disse modeller individuelt repræsenterer ikke fuldt ud kompleksiteten af den menneskelige sygdom, men de er værdifulde for belyse patofysiologiske veje, der kunne være relevante for IBD og for validering af foreløbig terapeutiske strategier10, 11. Sådanne musemodeller er typisk afhængige af indledning af betændelse ved kemisk induktion eller infektion, immuncelle overførsel eller genetisk manipulation. Desuden omfatter disse strategier ofte forstyrrelser i epitelial integritet eller graduering af medfødte eller adaptive immunitet.
Salmonella enterica d er intestinale patogener, der kan inficere mennesker og mus. Efter indtagelse kan salmonella kolonisere tarmen ved direkte invasion af epithelia, M-celler eller antigen, som præsenterer cellerne12. Mus inficeret oralt med S. Typhimurium resulterer i koloniseringen primært af systemiske steder som milten og mesenteriske lymfeknuder med relativt lav overflod i mave-tarmkanalen12. Men, forbehandling af mus med streptomycin øger effektiviteten af salmonella kolonisering af tarmen ved at mindske værten beskyttende virkninger af den normale mikrobiota13. Patologiske funktioner i denne model omfatter afbrydelse eller ulceration af epitelial barriere, granulocyt rekruttering, og svær ødem13. Alternativt, infektion med vaccine grade S. Typhimurium ΔAroA mutant fører til kronisk kolonisering af cecum og kolon, der fortsætter op til dag 40 efter infektion14. The S. Typhimurium ΔAroA stamme har en defekt i biosyntesen af aromatiske aminosyrer; Dette gør den mutante stamme avirulent og kan udnyttes som en meget effektiv vaccine15. Oral infektion i mus fører til en Th1-og Th17-cytokin associeret inflammatorisk respons, omfattende væv Remodeling, og kollagen deposition. Vævs patologi er forbundet med forhøjede niveauer af Pro-fibrotisk faktor som TGF-β1, CTGF, og IGF14. Transmural fibrotisk ardannelse rapporteret i denne model minder om striktur formationer ofte observeret i IBD. Induktion af fibrose ved salmonella kræver virulens, som er kodet af salmonella patogenicitetsøer (SPI)-1 og 2 12. Vigtigere, dette S. Tymphimurium ΔAroA infektion model er et nyttigt system til undersøgelse af fibrotiske reaktioner i mutant mus vedligeholdt på en C57/Bl6 baggrund. Den C57/Bl6 stamme er ekstremt følsom over for S. Typhiumurim SL1344 infektion på grund af en tab-af-funktion mutation i genet kodning den naturlige resistens-associeret makrofag protein (nramp)-116,17. Vi har konstateret, at IL-17A og RORα-afhængige medfødte lymfoide celler er vigtige bidragydere til patogenesen i denne model18.
En stor komplikation af CD er den dysregulerede og overdreven aflejring af ekstracellulære matrix (ECM) herunder kollagen2,19. Selv om mave-tarmkanalen har en relativ høj kapacitet til regenerering, kan fibrotisk ardannelse opstå på grund af uløste sårheling svar, der er forbundet med kronisk og svær inflammation20,21. I cd, dette resulterer i skadelige virkninger på væv arkitektur fører til signifikant organ svækkelse21,22. Den transmural karakter af inflammation observeret i CD i sidste ende går forud for fortykkelse af tarmvæggen forbundet med symptomatisk stenose eller striktur dannelse21. Omkring en tredjedel af CD-patienter kræver tarm resektion for denne komplikation22. Der er ingen effektive anti-fibrotiske behandlinger i IBD, da brugen af immunsuppressiva såsom azathioprin eller anti-tnfα biologiske lægemidler ikke har nogen indvirkning eller kun beskedent reducerede kravet om kirurgiske indgreb19,23 . Mens fibrose menes at være konsekvensen af kronisk inflammation, celler af mesenchymal oprindelse såsom fibroblaster og pericytes menes at være de primære cellulære kilder til ECM i fibrotisk ardannelse21,24. Kroniske S. Typhimurium ΔAroA infektion er en robust musemodel af tarm fibrose, der kan tilbyde indsigt i patogenesen af CD-lignende funktioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 ml round bottom safe lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipet Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2707134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL megablock plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1972.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gavage needles</td>
			<td>FST</td>
			<td>18061-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>MM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chronic salmonella infection induced intestinal fibrosis

Vævs fibrose karakteriseret ved den patologiske ophobning af ekstracellulære matrix såsom kollagen er resultatet af vedvarende inflammation og dysreguleret reparation. I inflammatorisk tarmsygdom (IBD), fibrose fører til recidiverende striktur formationer, som der ikke er nogen effektiv behandling andre end kirurgisk resektion. På grund af sin sene debut, de processer, der drev fibrose er mindre undersøgt og stort set ukendt. Derfor udgør fibrotiske komplikationer en stor udfordring i IBD. I denne protokol beskrives en robust in vivo-model af intestinal fibrose, hvor streptomycin forbehandling af C57Bl/6-mus efterfulgt af oral sonde med vaccine kvalitet salmonella typhimurium ΔAroA mutant fører til vedvarende patogen kolonisering og fibrose af cecum. Metoder til udarbejdelse af S. Typhimurium ΔAroA for inokulation, kvantificere patogenet belastninger i cecum og milt, og evaluere kollagen deposition i tarm væv forklares. Denne eksperimentelle sygdomsmodel er nyttig til at undersøge værts faktorer, der enten forbedrer eller forværrer CD-lignende tarm fibrose.

Behandling med streptomycin efterfulgt af oral infektion med S. Typhimurium ΔAroA fører til robust tarmbetændelse og fibrose især i cecum (figur 1). Typiske patogen byrder på 108 til 109 CFU pr. 1 g cecum og 104 CFU pr. 1 g milt kan inddrives fra inficerede dyr (figur 2). Vurdering af fibrose i picrosirius rødfarvede cecal sektioner indikerer peak fibrose 21 dage efter infektion, mens en stor del af patologien er l...

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis at JoVE.com

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Denne protokol beskriver en musemodel af salmonella drevet tarm fibrose, der ligner de vigtigste patologiske kendetegn af Crohns sygdom, herunder transmural inflammation og fibrose. Denne metode kan bruges til at evaluere værts faktorer, der ændrer fibrotiske udfald ved hjælp af muterede mus, som vedligeholdes på en C57Bl/6 genetisk baggrund.

Kronisk salmonella infektion induceret tarm fibrose

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Vævfibrose er den primære måde, at organer mislykkes over tid, som reaktion på kronisk betændelse eller aldring. Og faktisk vil jeg hævde, at hvis du ikke dør af en smitsom agent eller kræft, vil du sandsynligvis dø af organfibrose som du alder. Desværre er der ikke en masse store musemodeller til at efterligne human vævfibrose.Så hvad vi har udviklet, er en mus model af Crohns sygdom, det er en sygdom i mennesker, der forårsager fibrose i tarmen og er stort set uhelbredelig. Faktisk er den eneste måde du kan behandle det er gennem kirurgisk fjernelse af fibrotisk væv og re-ligation af tarmen. Fordelen ved vores model er, at det er fuldt penetrant i alle mus stammer, og det meget nøje efterligner menneskelige Crohns sygdom og fibrose fortsætter i over en måned, hvilket virkelig er en robust model.Den mest udfordrende del af denne procedure er håndteringen af musene og især den orale sonde, da det kræver en masse praksis særlig certificering. Når du udfører denne procedure for første gang, bør man være opmærksom på, at arbejde med Salmonella kræver ordentlige sikkerhedsforanstaltninger og steril teknik. Bortskaffelse af affald og bakterier bør alle planlægges forud for forsøget.Den visuelle demonstration af denne procedure er meget vigtig, fordi det indebærer håndtering af Salmonella, der kræver særlige sikkerhedsforanstaltninger samt korrekt steril teknik. For at begynde denne procedure, der er fastsat en plade med LB agar indeholdende Streptomycin i en koncentration på 100 mikrogram per milliliter. Brug en steril inokulerende løkke, streak pladen med en frossen glycerol bestand af S typhimurium delta pil a.Inkuber natten over ved 37 grader Celsius. Stribeplader kan opbevares ved fire grader Celsius i op til en uge. En dag før infektion, opløse 0,5 gram Streptomycin i 2,5 milliliter vand til at forberede antibiotika.Streptomycinopløsningen steriliseres. Brug derefter en pære-tippet 22 gauge sonde nål med en en milliliter sprøjte til mundtligt sonde musene med 100 mikroliter af streptomycin opløsning. Dernæst tilsættes tre milliliter LB bouillon indeholdende Streptomycin i en koncentration på 50 mikrogram pr. milliliter til et kulturrør.Ved hjælp af en vaccinationsløkke skal LB bouillon med en enkelt koloni vaccineres. Inkuber kulturen aerobt natten over ved 37 grader Celsius med rystelser ved 200 rpm. På infektionsdagen udføres to på hinanden følgende en til 10 fortyndinger af nattens Salmonella-kulturer med steril PBS for at forberede den endelige infektionsdosis.Dette resulterer i en 100 mikroliter inoculum indeholder omkring tre millioner kolonidannende enheder. Derefter skal du bruge en pærespids 22 gauge sondenål med en millilitersprøjte til at sonde hver mus med 100 mikroliter af den forberedte Salmonella. Først, der er fastsat to milliliter sikker-lock runde bund mikrorør, tilsæt en milliliter sterile PBS og en autoklaveret rustfrit stål perle til hvert rør.Forvej rørene før vævsindsamling. Efter euthanizing mus, resect deres cecal og milt væv, sørg for at indsamle væv fra de enkelte dyr i separate rør. Vejes hvert rør for at bestemme vævsvægten.Brug en mixer mølle apparat til at homogenisere væv på 30 hertz i 15 minutter. Derefter overføres 900 mikroliter PBS til hver brønd af en 96-brønd to milliliter mega blok. Pipette 100 mikroliter af væv homogenerer i den første brønd, og bland godt.Udfør serielle fortyndinger ved at tilsætte 100 mikroliter til efterfølgende brønde, indtil der opnås en 10 til den negative sjette fortynding. Plade 10 mikroliter af hver fortynding i tre eksemplarer på LB agar, der indeholder Streptomycin. Derefter tælle den gennemsnitlige koloni danner enheder og bestemme kolonidannende enheder pr gram væv som skitseret i tekstprotokollen.Åbn Fiji, som er en open sourced billedbehandling software og trække og slippe tif billedfilen på værktøjslinjen. Vælg Billede, Type, RGB-stak på menulinjen for at opdele billedet i røde, grønne og blå kanaler. Skub den vandrette bjælke nederst i panelet for at indstille kanalen til grøn.Åbn billede, Juster, Tærskelværktøj. Juster minimums- og maksimumgrænser for at eliminere baggrundssignaler. Når den ønskede grænse er angivet, skal du lukke tærskelværktøjet og gå til Analysér, Indstil målinger, aflys område, områdefraktion, Grænse til grænse og Vis etiket.Få vævsvalget med enten værktøjet frihåndsvalg eller polygonmarkegmarkering, og mål det procentområde, der er positivt for kollagen, ved at klikke på Analysér, Mål. Derefter normalisere det absolutte område positiv for kollagen farvning til væv område. Streptomycin behandling efterfulgt af oral infektion med S typhimurium delta pil en fører til robust tarmbetændelse og fibrose, især i cecum.Typiske patogenbyrder på 100 millioner til en milliard kolonidannende enheder kan genvindes pr. gram cecum fra inficerede dyr, mens 10.000 kolonidannende enheder typisk kan genvindes pr. gram milt. Vurdering af fibrose i picrosirius rød farvede cecal sektioner indikerer peak fibrose 21 dage efter infektion, mens en stor del af patologien er løst ved dag 42 efter infektion. Grundig forberedelse af materialer er afgørende, da dette eksperiment kræver flere dage at oprette.Fremstilling af LB plader og Salmonella og Streptomycin bør alle gøres aseptisk. Før forsøget skal du sikre dig, at eksperimentatoren er fortrolig med dyreprotokollen samt sikkerhedsrisici. Ved vurdering af kollagen byrde, kan eksperimentatoren vælge at udføre andre biologiske analyser, såsom RNA sekventering at vurdere genekspression profiler eller flow cytometri at vurdere immuncelle subsets eller et væv ELISA at vurdere cytokin profiler.Så vores model er særlig god til at efterligne en menneskelig sygdom kaldet Crohns sygdom, hvor du får fibrose i tarmen, som er stort set uhelbredelig, og den eneste måde du kan behandle det er at fjerne en del af tarmen og sy den sammen igen og håber, at det ikke kommer tilbage. Vores model er meget robust, og vi har allerede vist, at målretning medfødte lymfoide celler type tre, en transskription faktor kaldet rå alpha, eller interleukin 17 forbedrer sygdommen og forhindrer fibrose. Vores model er særlig god til at identificere de faktorer, der spiller i patogenesen af Crohns sygdom og tarmfibrose, og vi er allerede på vej til at identificere en række mål, der kunne behandles terapeutisk for at lindre inflammatorisk tarmsygdom.Vores model har allerede indtastet den samme ILC3 eller alpha NIL17 adgang kan være på spil i andre fibrotiske sygdom, og disse omfatter ting som psoriasis, multipel sklerose, idiopatisk lungefibrose. Så det er muligt, at målrette de samme faktorer kan afhjælpe fibrose i disse sygdomme samt. Selvom den mutante Salmonella-strøm ikke er virulent, er det vigtigt at følge de standardsikkerhedsprotokoller for biologisk fare, som anlægget har givet.Også, da formaldehyd dampe er kendt for at være kræftfremkaldende, er det vigtigt at arbejde bag en røg hætte under fiksering trin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langtids kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftvejsinfektion i mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

En mus Model for Patogen-induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

En protokol til at inficere<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Med<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantificering af Cytosolisk vs. vakuolær<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primære Makrofager af Differential Permeabilisering

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

En multimodale Imaging tilgang baseret på Micro-CT og fluorescens molekylære tomografi langsgående vurdering af Bleomycin-induceret lungefibrose i mus

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Ved hjælp af human induceret pluripotente stamceller-afledte tarm Organoider til at studere og ændre epitelial cellebeskyttelse mod salmonella og andre patogener

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Mekanistisk indsigt i udviklingen af TNBS-medieret intestinal fibrose og evaluere de hæmmende virkninger af Rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En forsinket vaccination Model af kronisk Pseudomonas aeruginosa Sårinfektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Fagterapi Ansøgning om at modvirke Pseudomonas aeruginosa infektion i cystisk fibrose zebrafisk embryoner

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...