Name: chronic salmonella infection induced intestinal fibrosis
Uploaded: 2019-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis at JoVE.com

Vi tackar Ingrid Barta för histologi tjänster.

Alla djur protokoll godkändes av djur hälso nämnden vid University of British Columbia.
1. beredning av salmonella typhimurium ΔAroA kulturer för oral Sonning av möss
<ol><li>Från en fryst glycerol lager av S. Typhimurium δaroa, Förbered en strimma plattan med lb agar som innehåller 100 μg/ml streptomycin med en steril vaccinera loop. Inkubera över natten vid 37 ° c. Strimma plattor kan förvaras upp till en vecka vid 4 ° c.</li>
	<li>En dag före infektionen,...

<ol>
	<li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+colitis.">Ulcerative colitis.</a> New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).</li><li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+disease.">Crohn's disease.</a> The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li><li>Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+inflammatory+bowel+disease+pathogenesis:+linking+host+genetics+and+the+microbiome.">Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome.</a> Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).</li><li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li><li>Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+immunopathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).</li><li>Ogura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frameshift+mutation+in+NOD2+associated+with+susceptibility+to+Crohn's+disease.">A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease.</a> Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).</li><li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease.">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li><li>Rivas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+resequencing+of+GWAS+loci+identifies+independent+rare+variants+associated+with+inflammatory+bowel+disease.">Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease.</a> Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).</li><li>Rioux, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+new+susceptibility+loci+for+Crohn+disease+and+implicates+autophagy+in+disease+pathogenesis.">Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis.</a> Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).</li><li>Uhlig, H. H., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+intestinal+inflammation+as+tools+to+understand+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).</li><li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li><li>Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+enteric+Salmonella+infections.">Pathogenesis of enteric Salmonella infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).</li><li>Barthel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host.">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li><li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Enteric+Salmonella+Infection+in+Mice+Leads+to+Severe+and+Persistent+Intestinal+Fibrosis.">Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li><li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aromatic-dependent+Salmonella+typhimurium+are+non-virulent+and+effective+as+live+vaccines.">Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li><li>Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+Salmonella+virulence+and+host+resistance.">Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).</li><li>Valdez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nramp1+drives+an+accelerated+inflammatory+response+during+Salmonella-induced+colitis+in+mice.">Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).</li><li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORalpha+and+group+3+innate+lymphoid+cells+drive+fibrosis+in+a+mouse+model+of+Crohn's+disease.">The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease.</a> Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).</li><li>Burke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenesis+in+Crohn's+disease.">Fibrogenesis in Crohn's disease.</a> American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).</li><li>Hogan, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+and+regeneration+of+the+respiratory+system:+complexity,+plasticity,+and+mechanisms+of+lung+stem+cell+function.">Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).</li><li>Fiocchi, C., Lund, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themes+in+fibrosis+and+gastrointestinal+inflammation.">Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).</li><li>Rieder, F., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis+in+IBD&#8212;a+dynamic,+multifactorial+process.">Intestinal fibrosis in IBD&#8212;a dynamic, multifactorial process.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).</li><li>Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+for+adult+Crohn's+disease:+what+is+the+actual+risk?.">Surgery for adult Crohn's disease: what is the actual risk?.</a> Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).</li><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis.">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).</li><li>Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picrosirius+staining+plus+polarization+microscopy,+a+specific+method+for+collagen+detection+in+tissue+sections.">Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections.</a> Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).</li><li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22+Preserves+Gut+Epithelial+Integrity+and+Promotes+Disease+Remission+during+Chronic+Salmonella+Infection.">IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection.</a> Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).</li><li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IL-13+triggers+TGF-beta1-dependent+tissue+fibrosis+in+chronic+2,4,6-trinitrobenzene+sulfonic+acid+colitis.">Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).</li><li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-13+signaling+via+IL-13R+alpha2+induces+major+downstream+fibrogenic+factors+mediating+fibrosis+in+chronic+TNBS+colitis.">IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis.</a> Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).</li><li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis+is+reduced+by+early+elimination+of+inflammation+in+a+mouse+model+of+IBD:+impact+of+a+&amp;#34;Top-Down&amp;#34;+approach+to+intestinal+fibrosis+in+mice.">Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a &amp;#34;Top-Down&amp;#34; approach to intestinal fibrosis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).</li><li>Darfeuille-Michaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+adherent-invasive+Escherichia+coli+associated+with+ileal+mucosa+in+Crohn's+disease.">High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).</li><li>Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+infection+with+Crohn's+disease-associated+adherent-invasive+Escherichia+coli+leads+to+chronic+inflammation+and+intestinal+fibrosis.">Persistent infection with Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis.</a> Nature Communications. 4, 1957 (2013).</li><li>Imai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin-mediated+activation+of+IL-33-ST2+signaling+by+a+pathobiont+promotes+intestinal+fibrosis.">Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis.</a> Mucosal Immunology. , (2019).</li></ol>

Vår förståelse av patogenesen för IBD har förbättrats kraftigt genom musmodeller av tarminflammation. Även om sådana enskilda modeller inte recapitulate alla funktioner i komplexa och multifaktoriell mänskliga sjukdomen, de har varit användbara för att identifiera viktiga funktioner i sjukdomsprogression. Fibrotiska strikturer i samband med IBD förblir ett stort icke tillgodosedda kliniskt behov eftersom nuvarande behandlingar är ineffektiva i att vända sjukdomsutveckling. Dessutom är intestinal fibros sv?...

Ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD) är de två stora formerna av IBD och kännetecknas som kroniska ochskovvis inflammatoriskasjukdomar i mag-tarmkanalen 1,2. Dessa sjukdomar har en stor inverkan på livskvaliteten för patienter. Symtom på IBD inkluderar buksmärtor, diarré, illamående, viktminskning, feber, och trötthet3. Nyligen genomförda studier har identifierat genetiska och miljömässiga faktorer som bidrar till sjukdomens patogenes; Det är tänkt att sådana riskfaktorer bidrar till störningen av epitelbarriären vilket resulterar i flyttning eller översampling av luminala antigener4. Som en följd, detta initierar en avvikande inflammatorisk reaktion på kommensaler Flora medierad av intestinala immunceller4. Dragen av IBD-associerade komplikationer kan utsträckas till platser bortom mag-tarmkanalen påverkar olika organ inklusive leder, hud, och lever1,2. Kännetecken av UC inkluderar svår och diffus inflammation typiskt lokaliserad i tjocktarmen1. Sjukdoms patologi påverkar slemhinnan och submucosa i tarmen vilket resulterar i ytliga slemhinnor ulcerationer1. Däremot kan CD påverka någon del av magtarmkanalen även om tecken på sjukdom är vanligt förekommande i tjocktarmen och distala ileum2. Dessutom, inflammationen i CD är transmural, påverkar alla skikt av tarmväggen2.
Flera IBD känslighet gener som har identifierats skulle tyda på att dysreglering av epitelbarriären eller immunitet är kritiska bidragande till sjukdomsprogression5. Mutationer i nukleotid oligomerisering domän 2 (NOD2) uttryckt av monocyter konstaterades vara förknippade med ökad känslighet för CD; Detta belyser en koppling mellan förändrad medfödda immun upptäckt av bakteriella komponenter och sjukdomen6. Nyare genomomfattande Associations studier (GWAS) har avslöjat ytterligare vägar som kan vara involverade i patogenesen för IBD, inklusive genetiska variationer hos: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R beroende vägar kopplad till adaptiv immunitet , MUC1, MUC19, och PTGER4 i tarmbarriären underhåll, och ATG16L-medierad autofagi7,8,9. Medan dessa populationsbaserade genetik studier har förstärkt vår förståelse av IBD, känslighet alleler ensamt är sannolikt otillräckliga för att initiera och upprätthålla kronisk sjukdom3. Andra icke-genetiska faktorer inklusive förändringar i Gut mikrobiomet sammansättning och en minskning av mångfalden har förknippats med intestinal inflammation. Emellertid, det är oklart om gut dysbios föregår eller är följden av dysreglerade immunsvar3. Även etiologin av IBD förblir oklar, vår förståelse av patogenesen av sjukdomen har förbättrats genom experimentella musmodeller av tarminflammation10,11. Dessa modeller representerar inte helt komplexiteten hos den mänskliga sjukdomen, men de är värdefulla för att belysa patofysiologiska vägar som kan vara relevanta för IBD och för validering av preliminära terapeutiska strategier10, 11. Sådana musmodeller förlitar sig vanligtvis på initiering av inflammation genom kemisk induktion eller infektion, immun cells överföring, eller genetisk manipulation. Dessutom, dessa strategier involverar ofta störningar i epitelial integritet eller modulering av medfödd eller adaptiv immunitet.
Salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar är intestinala patogener som kan infektera människor och möss. Efter intag, salmonella kan kolonisera tarmen genom direkt invasion av epitelia, M celler, eller antigen presenterande celler12. Möss infekterade oralt med S. Typhimurium resultat i koloniseringen främst av systemiska platser såsom mjälte och mesenteriska lymfkörtlar med relativt lågt överflöd i magtarmkanalen12. Emellertid, förbehandling av möss med streptomycin ökar effektiviteten av salmonella kolonisering av tarmen genom att minska värd skyddande effekterna av den normala bakterieflora13. Patologiska funktioner i denna modell inkluderar störning eller sår av epitelbarriären, granulocyt rekrytering, och svår ödem13. Alternativt, infektion med vaccin klass S. Typhimurium ΔAroA Mutant leder till kronisk kolonisering av blindtarmen och tjocktarmen som kvarstår upp till dag 40 efter infektion14. Den S. Typhimurium ΔAroA stam har en defekt i biosyntesen av aromatiska aminosyror; Detta gör den muterade stammen Avirulenta och kan utnyttjas som en mycket effektiv vaccin15. Oral infektion hos möss leder till en Th1-och Th17-cytokin associerade inflammatoriska svar, omfattande vävnad remodeling, och kollagen deposition. Vävnads patologi är förknippad med förhöjda nivåer av Pro-fibrotiska faktor såsom TGF-β1, CTGF, och IGF14. Den transmural fibrotiska ärrbildning rapporteras i denna modell påminner om striktur formationer ofta observerats i IBD. Induktion av fibros genom salmonella kräver virulens kodat av salmonella pathogenicitetsöar (SPI)-1 och 2 12. Viktigt, detta S. Tymphimurium ΔAroA infektion modell är ett användbart system för studiet av fibrotiska svar i muterade möss upprätthålls på en C57/Bl6 bakgrund. C57/Bl6-stammen är extremt känslig för S. Typhiumurim SL1344 infektion på grund av en förlust-av-funktion mutation i genen kodning av naturliga resistensassocierade makrofagprotein (nramp)-116,17. Vi har funnit att Il-17a och rorα-beroende medfödda lymfoida celler är viktiga bidragande till patogenes i denna modell18.
En stor komplikation av CD är den dysreglerade och överdriven deposition av extracellulära matrix (ECM) inklusive kollagen2,19. Även om magtarmkanalen har en relativt hög kapacitet för förnyelse, fibrotisk ärrbildning kan uppstå på grund av olösta sårläkning svar som är förknippade med kronisk och svår inflammation20,21. I CD, detta resulterar i skadliga effekter på vävnads arkitektur leder till betydande organskada21,22. Den transmural karaktären av inflammationen observerats i CD i slutändan föregår förtjockning av tarmväggen i samband med symtomatisk stenos eller striktur formation21. Om en tredjedel av CD-patienter kräver intestinal resektion för denna komplikation22. Det finns inga effektiva anti-fibrotiska terapier i IBD med tanke på att användningen av immunsuppressiva medel såsom azatioprin eller anti-TNFα Biologics inte har någon effekt eller endast blygsamt minskat behovet av kirurgiska ingrepp19,23 . Medan fibros är tänkt vara följden av kronisk inflammation, celler av mesenkymala ursprung såsom fibroblaster och pericyter tros vara den primära cellulära källor av ECM i fibrotisk ärrbildning21,24. Kronisk S. Typhimurium ΔAroA infektion är en robust musmodell av intestinal fibros som kan erbjuda insikter i patogenesen av CD-liknande funktioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 ml round bottom safe lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipet Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2707134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL megablock plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1972.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gavage needles</td>
			<td>FST</td>
			<td>18061-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>MM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chronic salmonella infection induced intestinal fibrosis

Vävnad fibros kännetecknas av patologiska ansamling av extracellulär matris såsom kollagen är resultatet av ihållande inflammation och dysreglerad reparation. Vid inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) leder fibros till återkommande striktur formationer för vilka det inte finns någon effektiv behandling annat än kirurgisk resektion. På grund av dess sena debut, de processer som driver fibros är mindre studeras och till stor del okända. Därför, fibrotiska komplikationer utgör en stor utmaning i IBD. I detta protokoll beskrivs en robust in vivo-modell av intestinal fibros där streptomycin förbehandling av C57Bl/6-möss följt av oral Sonda med vaccin klass salmonella typhimurium ΔAroA Mutant leder till ihållande patogen kolonisering och fibros i blindtarmen. Metoder för beredning av S. Typhimurium ΔAroA för ympning, kvantifiering av patogen laster i blindtarmen och mjälte, och utvärdera kollagen deposition i tarm vävnader förklaras. Denna experimentella sjukdoms modell är användbar för att undersöka värd faktorer som antingen förstärker eller förvärerar CD-liknande tarm fibros.

Behandling med streptomycin följt av oral infektion med S. Typhimurium ΔAroA leder till robust tarminflammation och fibros särskilt i blindtarmen (figur 1). Typiska patogen bördor på 108 till 109 CFU per 1 g blindtarmen och 104 CFU per 1 g mjälte kan återvinnas från smittade djur (figur 2). Bedömning av fibros i picrosirius röd färgade cecal avsnitt indikerar topp fibros 21 dagar efter infektion medan mycket a...

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis at JoVE.com

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Detta protokoll beskriver en musmodell av salmonella driven intestinal fibros som liknar viktiga patologiska kännetecken för Crohns sjukdom inklusive transmural inflammation och fibros. Denna metod kan användas för att utvärdera värd faktorer som förändrar fibrotiska resultat med muterade möss upprätthålls på en C57Bl/6 genetisk bakgrund.

Kronisk salmonella infektion inducerad intestinal fibros

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Vävnadsfibros är det primära sättet att organ misslyckas över tiden, som svar på kronisk inflammation eller åldrande. Och i själva verket skulle jag hävda att om du inte dör av ett smittämne eller cancer, kommer du förmodligen att dö av organfibros när du åldras. Tyvärr finns det inte många bra musmodeller för att efterlikna mänsklig vävnadsfibros.Så vad vi har utvecklat är en mus modell av Crohns sjukdom, det är en sjukdom hos människor som orsakar fibros i tarmen och är till stor del behandlingsbar. I själva verket, det enda sättet du kan behandla det är genom kirurgiskt avlägsnande av fibrotisk vävnad och re-ligatur i tarmen. Fördelen med vår modell är att det är helt penetrant i alla mus stammar och det mycket nära härmar mänskliga Crohns sjukdom och fibros kvarstår i över en månad, vilket verkligen är en robust modell.Den mest utmanande delen av detta förfarande är hantering av möss och särskilt den muntliga sondmatning eftersom det kräver en hel del praxis särskild certifiering. När du utför denna procedur för första gången, bör man vara medveten om att arbeta med Salmonella kräver ordentliga säkerhetsåtgärder och steril teknik. Bortskaffande av avfall och bakterier bör alla planeras före försöket.Den visuella demonstrationen av detta förfarande är mycket viktigt eftersom det innebär hantering av Salmonella som kräver särskilda säkerhetsåtgärder samt korrekt steril teknik. För att påbörja detta förfarande, anges en platta med LB agar som innehåller Streptomycin vid en koncentration av 100 mikrogram per milliliter. Med hjälp av en steril inokulera slinga, strimma plattan med en fryst glycerol lager av S typhimurium delta pil a.Inkubera över natten vid 37 grader Celsius. Streckplattor kan förvaras vid fyra grader Celsius i upp till en vecka. En dag före infektion, lös 0,5 gram Streptomycin i 2,5 milliliter vatten för att förbereda antibiotika.Filtrera sterilisera Streptomycinlösningen. Använd sedan en glödlampa-tippade 22 gauge sondmatning nål med en en milliliter spruta till oralt sondmatning mössen med 100 mikroliter av streptomycin lösningen. Därefter lägger du till tre milliliter LB-buljong som innehåller Streptomycin vid en koncentration av 50 mikrogram per milliliter till ett odlingsrör.Med hjälp av en inokuleringsslinga, inokulera LB-buljongen med en enda koloni. Inkubera kulturen aerobt över natten vid 37 grader Celsius med skakningar vid 200 rpm. På dagen för infektion, utföra två på varandra följande en till 10 utspädningar av natten Salmonella kulturer med steril PBS att förbereda den slutliga infektionen dosen.Detta resulterar i en 100 microliter inokulat som innehåller cirka tre miljoner kolonin bildar enheter. Efter detta, använd en glödlampa-tippade 22 gauge sondmatning nål med en milliliter spruta till sondmatning varje mus med 100 mikroliter av den beredda Salmonella. Först anges två milliliter safe-lock runda botten mikrorör, tillsätt en milliliter steril PBS och en autoclaved rostfritt stål pärla till varje rör.För väga rören före vävnadsinsamling. Efter att avliva möss, resect deras cecal och splenic vävnader, se till att samla vävnad från enskilda djur i separata rör. Väg varje rör för att bestämma vävnadsvikterna.Använd en mixer kvarn apparat för att homogenisera vävnaderna vid 30 hertz i 15 minuter. Överför sedan 900 mikroliter PBS till varje brunn av ett 96-väl två milliliter megablock. Pipett 100 mikroliter av vävnad homogenates i den första brunnen, och blanda väl.Utför serieutspädningar genom att tillsätta 100 mikroliter till efterföljande brunnar, tills en 10 till den negativa sjätte spädningen erhålls. Plate 10 mikroliter av varje spädning i tre exemplar på LB-agar som innehåller Streptomycin. Räkna sedan de genomsnittliga koloniformningsenheterna och bestämma koloniformningsenheterna per gram vävnad som skisseras i textprotokollet.Öppna Fiji, som är en öppen källkod bildhantering programvara och dra och släpp tif bildfilen på verktygsfältet. På menyraden väljer du Bild, Typ, RGB-stack för att dela bilden i röda, gröna och blå kanaler. Skjut den vågräta listen längst ned på panelen för att ställa in kanalen på grönt.Öppna bild, Justera, Tröskel verktyg. Justera minimi- och maximigränser för att eliminera eventuella bakgrundssignaler. När det önskade tröskelvärdet har ställts in stänger du tröskelverktyget och går till Analysera, Ange mått, bocka av Område, Områdesfraktion, Gräns till tröskelvärde och Display-etikett.Få vävnadsvalet med antingen frihandsvalen eller polygonvalverktyget och mät procentområdet positivt för kollagen genom att klicka på Analysera, Mät. Sedan normalisera det absoluta området positivt för kollagenfärgning till vävnadsområde. Streptomycin behandling följt av muntliga infektion med S typhimurium delta pilen en leder till robust intestinala inflammation och fibros, särskilt i det cecum.Typiska patogenbördor på 100 miljoner till en miljard kolonibildande enheter kan återvinnas per gram cecum från infekterade djur, medan 10 tusen kolonibildande enheter vanligtvis kan återvinnas per gram mjälte. Bedömning av fibros i picrosirius röda färgade cecal sektioner indikerar topp fibros 21 dagar efter infektion, medan mycket av patologi är löst med dag 42 post infektion. Grundlig beredning av material är viktigt eftersom detta experiment kräver flera dagar att ställa upp.Beredning av LB plattor och Salmonella och Streptomycin bör alla göras aseptiskt. Innan försöket, se till att experimentören är bekant med djurprotokollet samt säkerhetsrisker. Vid bedömning av kollagenbördan kan försöksmaskinen välja att utföra andra biologiska analyser, såsom RNA-sekvensering för att bedöma genuttrycksprofiler eller flödescytometri för att bedöma immuncellsdelser eller en vävnad ELISA för att bedöma cytokinprofiler.Så vår modell är särskilt bra på att härma en mänsklig sjukdom som kallas Crohns sjukdom där du får fibros i tarmen, som är till stor del untreatable och det enda sättet du kan behandla det är att ta bort en del av tarmen och sy ihop den igen och hoppas att det inte kommer tillbaka. Vår modell är mycket robust och vi har redan visat att rikta medfödda lymfoida celler typ tre, en transkriptionsfaktor som kallas rå alfa, eller interleukin 17 lindrar sjukdomen och förhindrar fibros. Vår modell är särskilt bra på att identifiera de faktorer som spelar i patogenesen vid Crohns sjukdom och tarmfibros och vi är redan på väg att identifiera ett antal mål som kan behandlas terapeutiskt för att lindra inflammatorisk tarmsjukdom.Vår modell har redan angett samma ILC3 eller alfa NIL17 tillgång kan vara i spel i andra fibrotic sjukdom och dessa inkluderar saker som psoriasis, multipel skleros, idiopatisk lungfibros. Så det är möjligt att rikta samma faktorer kan lindra fibros i dessa sjukdomar också. Även om den muterade Salmonella strömmen inte är virulent, är det viktigt att följa de vanliga biohazard säkerhetsprotokoll som ges av anläggningen.Också, eftersom formaldehyd ångor är kända för att vara cancerframkallande, det är viktigt att arbeta bakom en rök huva under fixeringssteget.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Långsiktig Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway infektion hos möss

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

En musmodell för patogen-inducerad Kronisk inflammation vid lokala och system webbplatser

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Ett protokoll för att infektera<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Med<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifiering av cytosoliska vs. vakuolär<em&gt; Salmonella</em&gt; I primära makrofager genom Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

En Multimodal Imaging strategi baserad på Micro-CT och fluorescens molekylär tomografi för längsgående bedömning av Bleomycin-inducerad lungfibros hos möss

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller-derived intestinal Organoider att studera och modifiera epitelial cell skydd mot salmonella och andra patogener

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Mekanistisk insikt i utvecklingen av TNBS-medierad intestinal fibros och utvärdering av de hämmande effekterna av rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En fördröjd inokulering modell av kronisk pseudomonas aeruginosa Sår infektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Phage Terapi Ansökan att motverka Pseudomonas aeruginosa infektion i cystisk fibros Zebrafish Embryon

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...