Name: isolation of intact eyeball to obtain integral ocular surface tissue for histological examination and immunohistochemistry
Uploaded: 2019-10-20T13:00:00
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Die Autoren danken Prof. Rong Ju für die kritische Lektüre des Manuskripts und allen Labormitgliedern für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, China), das Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, Provinz Guangdong, China), "100 People Plan" von der Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, Provinz Guangdong, China) und Forschungsgelder vom State Key Laboratory of Ophthalmology am Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, Provinz Guangdong, China).

Alle Verfahren zur Verwendung von Mäusen wurden vom Animal Care and Use Committee, Zhongshan Ophthalmic Center, genehmigt und befolgten die ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung.
1. Zerlegung des Augapfels mit intakter Augenoberfläche und Augenlidern
<ol><li>Sezieren Sie den Kopf.<ol>
<li>Euthanisieren Sie postnatale Tag 10 (P10) und P28 Mäuse (siehe Tabelle der Materialien für Mausstämme) durch Zervixdislokation, schneiden Sie den K...

<ol>
	<li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li><li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film.">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene.">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li><li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface.">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li><li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice.">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li><li>Gipson, I. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction.">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li><li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo.">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta/activin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure.">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li><li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation.">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li><li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+(PLTP).">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity.">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li><li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium.">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene.">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li></ol>

Eine wichtige Erinnerung für die Vorbereitung des intakten Augapfels ist, dass alle Orbitalknochen vollständig entfernt werden müssen, insbesondere die Juga- und Tränenknochen, die klein sind und sich in der Nähe der Unterseite der Augenhöhle befinden. Alle übrig gebliebenen Knochen können die anschließende Histologie erschweren. Falls ein winziges Stück Knochen nicht versehentlich vollständig aus der Zerlegung entfernt wurde, kann es aus dem Einbettungsparaffinblock mit einem Paar Scharfmacher herausgenommen ...

Die Augenoberfläche besteht aus einem kontinuierlichen Blatt regionalisiertes Epithel einschließlich palpebrale Bindehaut, Bulbar-Konjunktiva und Hornhaut1. Viele Drüsenstrukturen sind mit dem Augenoberflächenepithel assoziiert und erzeugen zusammen eine Schicht Tränenfolie, die die Hornhautoberfläche vor Trocknung und Umweltinvasionen schützt2. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltreizstoffe oder ihre Wechselwirkungen tragen zu pathologischen Veränderungen des OS3,4bei. Dementsprechend wurden eine Vielzahl von gentechnisch veränderten und physikalisch oder chemisch induzierten Tiermodellen zur Untersuchung von Krankheitsprozessen des menschlichen Betriebssystems verwendet.
Die Struktur und Funktion des Maus-OS ist ähnlich wie die des Menschen in vielerlei Hinsicht. Die von den Augendrüsen sezernierten Tränenfilmkomponenten ähneln auch bei Mäusen und Menschen. Eine Fülle von Studien wurde mit Mausmodellen zur Aufklärung von Mechanismen menschlicher OS-Erkrankungen5,6,7durchgeführt. In vielen Fällen ist es wichtig, globale statt lokale molekulare Veränderungen des Betriebssystems zu analysieren, um umfassende Informationen unter der gleichen experimentellen Behandlung zu erhalten. Daher ist eine Probenvorbereitung mit guter Integrität erforderlich, um sicherzustellen, dass jeder Teil des Betriebssystems gleichzeitig analysiert wird.
Das Mausbetriebssystem verbindet sich eng mit dem Augapfel, der in die Augenhöhle/Orbit eingebettet war (eine knöcherne Tasse aus mehreren verschiedenen Schädelknochen) und verbindet sich mit ihm durch dünnes Bindegewebe. Es gibt enorme Herausforderungen für die Sezieren der gesamten Augenoberfläche, ohne die palpebrale oder bulbar Konjunktiva zu beschädigen. Diese Herausforderungen gehen von: (i) das Betriebssystem ist weich und dünn und befestigt an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln, daher anfällig für Verzerrungen und Beschädigungen; und (ii) der begrenzte Abstand zwischen den Orbitalknochen und dem Augapfel die Seziervorgänge einschränken. Die Herausforderungen sind viel größer für die erwachsene Maus. In der embryonalen Maus ist die Orbitalknochenverknösung nicht vollständig und das umgebende Gewebe ist relativ locker8. Der Kopf kann entfernt und zerlegt werden und dann direkt paraformaldehyd (PFA) Fixierung und Einbettungausgesetzt 9. Im Gegensatz dazu sind die postnatalen und erwachsenen Maus-Orbitalknochen vollständig mit dicken umgebenden Geweben verknözt, was das Eindringen von Fixativen weniger effizient macht. Darüber hinaus sind die Orbital-/Schädelknochen hart und spröde, leicht gebrochen, wenn sie in die weichen Einbettverbindungen wie Paraffin geschnitten werden. Die gebrochenen Knochenstücke reißen einstimmig die nahegelegenen Gewebe, was zu einer minderwertigen Gewebemorphologie führt.
Viele veröffentlichte Studien zeigten oft partielle Augenoberfläche, die für ihre speziellen Forschungszwecke ausreichen kann10,11. Eine grobe Untersuchung der Literatur ergab nur wenige Studien, die zeigten, dass die gesamte intakte Augenoberfläche ohne detaillierte Beschreibung der Sezierprotokolle12,13nachgewiesen wurde. In diesem Protokoll haben wir eine Seziermethode beschrieben, um eine integrierte postnatale Augenoberfläche zu erhalten, bei der Orbital- und Schädelknochen geordnet entfernt wurden, wobei die unberührte Augenoberfläche zusammen mit dem Augapfel und den Augenlidern zurückbleibt, wodurch die körperlichen Schäden minimiert werden. Wir untersuchten die OS-Histologie und führten die Immunhistochemie mit den mit diesem Protokoll hergestellten Gewebeabschnitten durch.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>FG701-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Suggested concentration 1:500 - 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Suggested concentration 1:500 - 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-K12 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124975</td>
			<td>Suggested concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-K14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Suggested concentration 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope.</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave ovens</td>
			<td>Galanz</td>
			<td>P70D20TL-D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td>C57/BL6 and Sv129 mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501978-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 4% solution in 1&#215; PBS and filter with 0.45&#956;m filter membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBW6818</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact eyeball to obtain integral ocular surface tissue for histological examination and immunohistochemistry

Die Augenoberfläche (OS) besteht aus einem Epithelblatt mit drei verbundenen Teilen: palpebrale Bindehaut, Bulbarkonjunktiviva und Hornhautepithel. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). In experimentellen Tiermodellen mit bestimmten genetischen Modifikationen oder künstlichen Operationen ist es sinnvoll, alle Teile des OS-Epithelblatts zu untersuchen, um relative pathogenetische Veränderungen jedes Teils parallel zu bewerten. Die Zerlegung des OS-Gewebes als Ganzes ohne Verzerrung oder Beschädigung war jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Weichheit und Dünnheit des Os, das an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln befestigt ist. Darüber hinaus ist die tiefe Augenhöhle, die durch die harten Schädel/Orbitalknochen gebildet wird, durch den Augapfel voll belegt, so dass nur begrenzter Platz für die Bedienung von Sezierungen bleibt. Als Ergebnis würde eine direkte Zerlegung des Augapfels mit zugehörigem OS-Gewebe von der Gesichtsseite oft zu Gewebeschäden führen, insbesondere der palpebralen und bulbaren Bindehaut. In diesem Protokoll beschrieben wir eine Methode, um den Schädel und die Orbitalknochen sequenziell von einem zerkularten Mauskopf zu entfernen, wobei Augenlider, Augenoberfläche, Linse und Netzhaut in einem Stück zusammengelassen werden. Die Integrität des OS-Blattes war gut erhalten und konnte durch Histologie oder Immunostainierung in einem einzigen Abschnitt untersucht werden.

Die wichtigsten Schädelknochen aus verschiedenen Perspektiven wurden in Abbildung 1A-Edargestellt, mit Farben, die verschiedene Knochen bezeichnen. Wir benutzten vier Wochen altes Tier, um die Sezierprozesse zu demonstrieren. Nach den Sezierschritten 1.1.1-1.1.3 und einer kurzen Präfixierung (Schritt 1.1.4) wird der Augapfel mit den zugehörigen Gesichtsknochen in Abbildung 1Egezeigt. Weitere T...

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Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung des Mausauges mit Augenlid-, Augenoberfläche-, vorderen und hinteren Segmenten in relativ intakter Position.

Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Unser Labor konzentriert sich auf die Augenentwicklung und die Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um den Schädel und die Orbitalknochen sequenziell vom sezierten Mauskopf zu entfernen. Augenlider, Augenoberfläche, Linse und Netzhaut in einem Stück zusammen lassen. Das Protokoll kommt Augenärzten zugute, die sich für Augenoberflächendidaktik interessieren. Ich bin Dianlel Guo, um die Technik mit einem wahrscheinlichen Kampf zu erzählen, wenn ich versuche, die Beschädigung des Augapfels zu vermeiden, während die Gesichtsknochen sezieren. Der Hauptvorteil dieser Sezierstoffe besteht darin, dass die Integrität des Augenoberflächenepithelblatts gut erhalten ist und die verschiedenen Teile der Augenoberfläche durch Histologie oder Immunfärbung in einem einzigen Abschnitt untersucht werden können. Achten Sie darauf, alle kleinen Knochen und Ablagerungen von den Weichteilen abzuschneiden. Grund, es wird Narbenspuren auf Gewebeabschnitt sonst verursachen. Nach der Einschläferung der Maus, verwenden Sie eine gerade Schere, um den Kopf abzuschneiden und bisect es entlang der sagittalen Mittellinie beginnend an der intraparietalen Knochen rostral zur Nase. Legen Sie jede Hälfte des geteilten Kopfes in eine saubere Petrischale und schneiden Sie den Kiefer und die Zunge mit einer scharfen Schere ab. Befreien Sie den Sehnerv, indem Sie ihn vor der optischen Chiasm-Position vom Gehirn abschneiden. Und entfernen Sie alle Hirngewebe einschließlich der Olfaktor-Lampe, die an der Schädelwand befestigt ist. Nun sollen alle verbleibenden Gewebe alle Schädel- und Orbitalknochen haben, die mit dem Augapfel verbunden sind. Waschen Sie die restlichen Teile mit PBS, um Blut und Haarreste zu reinigen. Fixieren Sie das Gewebe vorab, indem Sie es in ein 50-Milliliter-Rohr legen, das 4% Paraformaldehyd enthält, und sie bei Raumtemperatur drehen. Nachdem die Präfixierung abgeschlossen ist, waschen Sie den sezierten Kopf in PBS dreimal schnell, um die gebrochenen Haare und Fixativen weiter zu beseitigen. Legen Sie das Gewebe in eine 10 Zentimeter lange Petrischale und schneiden Sie den Schädel in drei Teile entlang der in Abbildung eins des Textprotokolls angegebenen Ebenen. Der Augapfel und die Steckdose sind im mittleren Teil des Schädels unter ethmoiden, frontalen und kieferllbeinen Knochen versteckt. Verwenden Sie zwei Paare von Nummer vier geradeZange, um den ethmoiden Knochen abzuschälen und die Frontal- und Kieferknochen vollständig freizulegen. Dann teilen Sie die Schädeloberfläche geographisch in vier Bereiche. Setzen Sie die Spitze der gekrümmten Zangen horizontal in jeden Bereich ein, um die Oberkiefer- und Frontalknochen sequenziell zu entfernen. Danach werden die darunter liegenden Tränen- und Jugalknochen freigelegt. Entfernen Sie die beiden Knochen und die damit verbundenen subkutanen Muskeln und Fette, die den Augapfel umgeben. Schneiden Sie den Augapfel mit befestigten Augenlidern und Haut in einen kleinen, quadratischen Block, um das Gewebevolumen zu reduzieren und die Orientierung des Gewebes beim Einbetten zu erleichtern. Augapfel und zugehöriges Gewebe wieder in 4%Paraformaldehyd geben und über Nacht bei 4 fixieren

Research

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Biologie

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Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas

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Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

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