Name: isolation of intact eyeball to obtain integral ocular surface tissue for histological examination and immunohistochemistry
Uploaded: 2019-10-20T13:00:00
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著者は、原稿の批判的な読み取りのためにロン・ジュ教授に感謝し、すべてのラボメンバーは技術的な援助を受けました。この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC:31571077)からの助成金によって支援されました。北京、中国)、広州市科学技術イノベーションプロジェクト(201707020009;広東省広州)、太陽八千大学の「100人プラン」(8300-18821104;広東省広州)、中山眼科研究所の眼科国家キー研究所からの研究資金(303060202400339;広東省広州)。

マウスの使用に関するすべての手順は、動物ケアと使用委員会、中山眼科センターによって承認され、眼科および視力研究における動物の使用に関するARVO声明に従いました。
1. 眼表面とまぶたを無傷で切除する眼球の解剖
<ol><li>頭を解剖して<ol>
<li>子宮頸部脱臼により出生後10日目(P10)およびP28マウス(マウス株の材料表を参照)を安楽死させ、鋭いはさみで...

<ol>
	<li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li><li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film.">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene.">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li><li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface.">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li><li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice.">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li><li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+of+the+conjunctiva:+A+review+of+recent+findings.">Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).</li><li>Nowell, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction.">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li><li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo.">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta/activin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure.">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li><li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation.">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li><li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+(PLTP).">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity.">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li><li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium.">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene.">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li></ol>

無傷の眼球の準備のための1つの重要なリマインダーは、すべての軌道骨、特に小さく、眼窩の底の近くに位置するジュガとラクリマル骨を完全に除去しなければならないということです。残った骨は、その後のヒスロジーを複雑にする可能性があります。小さな骨が誤って解剖から完全に除去されなかった場合には、シャープトウィーザーのペアを使用して埋め込みパラフィンブロックから...

眼表面は、パルペブラー結膜、バルバル結膜および角膜1を含む局所的な上皮の連続シートから成っている。多くの腺構造は、眼表面上皮に関連し、一緒に乾燥および環境侵食から角膜表面を保護する涙液膜の層を生成する2.OSの破壊は、角膜炎、結膜炎、またはその両方(角膜結膜炎)につながる。遺伝的要因および環境刺激物またはその相互作用の両方が、OS3,4の病理学的変化に寄与する。したがって、様々な遺伝子操作され、物理的または化学的に誘発された動物モデルが、ヒトOSの疾患プロセスを研究するために使用されてきた。
マウスOSの構造と機能は、多くの点で人間の構造と機能に似ています。眼腺によって分泌される涙液膜成分は、マウスとヒトの間でも類似している。ヒトOS疾患5,6,7のメカニズムを解明するためのマウスモデルを用いて豊富な研究が行われている。多くの場合、同じ実験的処置の下で包括的な情報を得るためには、OSの局所的な分子変化ではなく、グローバルな分析が重要です。したがって、OS の各部分を同時に分析するには、整合性の高いサンプル調製が必要です。
マウスOSは、眼窩/軌道(いくつかの異なる頭蓋骨で作られた骨のカップ)に埋め込まれた眼球と密接に関連し、薄い結合組織を介してそれに接続します。パルペブラーやバルバル結膜を損傷することなく、眼の表面全体を解剖するための途方もない課題があります。これらの課題は、(i)OSが柔らかく薄く、物理的に離動可能なまぶたと眼球に貼り付けられており、ひずみや損傷に対して脆弱です。そして(ii)眼窩骨と眼球の間の限られたスペースは解剖操作を制限する。課題は、大人のマウスのためにはるかに大きいです。胚性マウスでは、眼窩骨の骨化は完全ではなく、周囲の組織は相対的に緩い8である。頭部を除去し、二分し、次にパラホルムアルデヒド(PFA)固定および埋め込み9を直接行うことができる。対照的に、産後および成体マウスの軌道骨は、周囲の組織の厚さで完全に骨化され、固定剤の浸透効率が低下する。さらに、軌道/頭蓋骨の骨は硬く脆く、パラフィンなどの柔らかい埋め込み化合物でそれらを断面すると簡単に壊れます。骨の破片は、近くの組織を満場一致で引き裂き、その結果、劣った組織形態を引き起こす。
多くの公表された研究は、多くの場合、彼らの特定の研究目的のために十分であり得る部分的な眼表面を示しました10,11.文献の総試験は、解剖プロトコル12、13の詳細な説明なしに実証されている全体の無傷の眼表面を示すわずかな研究しか見つかりませんでした。このプロトコルでは、眼球とまぶたと一緒に手つかずの眼表面を残し、物理的な損傷を最小限に抑える、出生後の一体的な眼表面を得るための解剖方法を詳述した。さらにOS組織学を検討し、このプロトコルで調製した組織切片を用いて免疫組織化学を行った。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>FG701-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Suggested concentration 1:500 - 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Suggested concentration 1:500 - 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-K12 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124975</td>
			<td>Suggested concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-K14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Suggested concentration 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope.</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave ovens</td>
			<td>Galanz</td>
			<td>P70D20TL-D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td>C57/BL6 and Sv129 mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501978-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 4% solution in 1&#215; PBS and filter with 0.45&#956;m filter membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBW6818</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact eyeball to obtain integral ocular surface tissue for histological examination and immunohistochemistry

眼表面(OS)は、パルペブラル結膜、バルバル結膜および角膜上皮の3つの接続された部分を有する上皮シートから成っている。OSの破壊は、角膜炎、結膜炎、またはその両方(角膜結膜炎)につながる。特定の遺伝子改変または人工操作を有する実験動物モデルにおいて、OS上皮シートのすべての部分を調べて、各部分の相対病因性変化を並行して評価することが有用である。しかし、OS組織全体の解剖は、主に物理的に分離しながら可動のまぶたと眼球に付貼されたOSの柔らかさと薄さのために困難であった。さらに、硬い頭蓋骨/軌道骨によって形成される深い目のソケットは、手術解剖のための限られたスペースを残して眼球によって完全に占められている。その結果、顔面側から関連するOS組織を伴う眼球の直接解剖は、しばしば組織損傷、特にパルプブラルおよびバルバル結膜につながる。このプロトコルでは、頭蓋骨と眼窩の骨を二分されたマウスヘッドから順番に取り除き、まぶた、眼表面、レンズ、網膜を一つに残す方法を説明した。OSシートの完全性は十分に保存され、単一のセクションで組織学または免疫染色によって調べることができた。

異なる視点から見た主要な頭蓋骨は図1A-Eに示され、異なる骨を示す色が示された。私たちは、解剖プロセスのデモンストレーションのために4週齢の動物を使用しました。解剖ステップ 1.1.1-1.1.3 と短い接頭辞 (ステップ 1.1.4) に続いて、関連する顔の骨を持つ眼球を図 1Eに示します。さらにトリミ?...

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Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

このプロトコルは、比較的無傷の位置でまぶた、眼表面、前部および後部セグメントを用いてマウス眼球を単離する方法を説明する。

組織学的検査と免疫組織化学のための一体的な眼表面組織を得るための無傷の眼球の単離

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

私たちの研究室では、眼の発達と病気に焦点を当てています。このプロトコルは、解剖されたマウスヘッドから頭蓋骨と軌道骨を順次除去する方法を記述する。まぶた、眼表面、レンズ、およびレチナを一体に残す。このプロトコルは、眼表面教訓に興味を持っている眼科医に利益をもたらす。私はディアンレル・グオです, 顔の骨を解剖しながら、眼球の損傷を避けようとするときに可能性の高い闘争で技術を伝えるために.この解剖問題の主な利点は、眼表面上皮シートの完全性が十分に保持されており、眼表面の異なる部分が1つのセクションで占体または免疫染色によって調べることができるということです。柔らかい組織のすべての小さな骨や破片を切断してください。理由は、それ以外の場合は、組織セクションに瘢痕マークを引き起こす。マウスを安楽死させた後、まっすぐハサミを使って頭を切り落とし、鼻に対して腹腔内骨から始まる矢状中線に沿って二分します。二分した頭の各半分をきれいなシャー皿に入れ、鋭いはさみを使って顎と舌を切り落とします。視神経を切断して、視神経を切断する前に、視神経を切断します。そして、頭蓋骨の壁に取り付けられている嗅球を含むすべての脳組織を取り除きます。今、残りの組織のすべては、眼球に関連付けられている頭蓋骨と軌道骨のすべてを持っている必要があります。残りの部分をPBSで洗い、血液や毛の破片を取り除きます。4%パラホルムアルデヒドを含む50ミリリットルチューブに入れ、室温で回転させることで、組織を事前に固定します。接頭辞が完了したら、PBSで解剖された頭部を3回素早く洗い、毛髪や固定剤をさらに除去します。ティッシュを10センチメートルのシャーレに入れ、図1のテキストプロトコルで示された平面に沿って頭蓋骨を3つの部分に切ります。眼球とソケットは、頭蓋骨の中央部に、エスモイド、前頭、上顎骨の下に隠されています。エスモイドの骨を剥がし、正面および上顎骨を完全に露出させるために、4つのストレート鉗子の2組を使用してください。その後、地理的に4つの領域に頭蓋骨の表面を分割します。湾曲した鉗子の先端を各領域に水平に挿入して、上顎骨と前頭骨を連続して除去します。この後、根底にある涙骨とジューガルの骨が露出します。2つの骨と関連する皮下の筋肉と眼球を取り巻く脂肪を取り除きます。取り付けられたまぶたと皮膚を小さな正方形のブロックにトリミングして、組織の体積を減らし、埋め込むときに組織の配向を容易にします。眼球と関連組織を4%パラホルムアルデヒドに戻し、4%で一晩固定し続ける

Research

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生物学

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

ヒトタンパ​​ク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

ベージュ/ブライト細胞間質血管細胞の単離と分化

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

生後マウスにおける聴覚ブラの解剖：中耳の骨の単離および組織学的解析

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

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