SUMO-bindende enheder gør det muligt at isolere endogene SUMOylated proteiner in vivo. Dette er ret udfordrende på grund af tilstedeværelsen af aktiv SUMO-specifik protease og de lave fraktioner af SUMOylated proteiner in vivo. Isoleringen af SUMOylated proteome ved hjælp af SUMO-bindende enheder er fordelagtig, da det udsætter en stigning i den samlede affinitet for SUMO-substrater.
Dette skyldes, at SUBE'er er almindelige i proteiner, der omfatter tandemre repeatere af SIM-kort, hvilket anerkender specifikt SUMO-molekyler på modificerede proteiner. Brugen af SUMO-bindende enheder til isolering og karakterisering af SUMOylated proteome i leverkræft er en hurtig og følsom metode. Det giver tidligere oplysninger om den temmelig ukendte rolle SUMOylation vej i leverkræft i en potentiel terapeutisk tilgang.
SUMO-bindende enheder kan bruges til at isolere og karakterisere SUMOylated proteome i andre væv udover leveren, både fra menneskelige prøver og dyremodeller, samt i flere cellulære modeller. Selv om denne teknik er let at udføre, bør der tages omhu, når man analyserer flere prøver på samme type. kølerterningen til de mange involverede trin.
Derfor anbefaler vi omhyggelig udjænkning af rørene, før du påbegynder dette eksperiment. Den visuelle demonstration af brugen af SUMO-bindende enheder letter revolutionen af denne protokol, især på grund af vanskelighederne med at håndtere bits og tab af materiale under protokollen. Humane hepatoma celler er tidligere blevet udarbejdet ved plating celler i P100 plader på en tæthed på 1,2 til 1,5 millioner celler pr fad og vedligeholde dem i standard vækstmedier på 37 grader Celsius.
Når du er klar til at bruge cellerne, aspirere medierne fra pladerne og vask dem med fem millimeter steril PBS. Læg pladen på is og tilsæt 500 mikroliter lysis buffer suppleret i henhold til manuskriptet retninger. Brug derefter en celleskraber til forsigtigt at skrabe cellerne af bunden af pladen i lysismediet.
Alternativt kan du høste cellerne ved trypsinisering og tilføje en milliliter trypsin-EDTA til pladen og sørge for, at cellerne er dækket. Sæt pladen i en 37 grader Celsius inkubator i fem minutter for at give dem mulighed for at løsrive sig fra pladen, derefter tilføje to milliliter forvarmt vækstmedium for at stoppe trypsinisering. Centrifuge cellerne ved 150 gange G i 10 minutter og aspirere supernatant.
Derefter vaskes cellerne med PBS og centrifuge i yderligere 10 minutter. Inspirer supernatanten og tilsæt 500 mikroliter lysisbuffer. Centrifuge lyse celler på 15000 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter, derefter overføre supernatanter til et frisk rør og kassér pellet.
Når du er klar til at bruge de høstede muselever, homogenisere 75 milligram friske eller knækkede frosne fragmenter i en milliliter iskold lysis buffer. Kør homogenisatoren i henhold til håndskriftsanvisningerne. Efter vævshomogenisering centrifugeres prøverne ved 15000 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter.
Overfør supernatanten til et frisk rør og kassér pellet. Forbered glutathion perler ved at tilføje en milliliter de-ioniseret vand til 70 milligram perler og rekonstituere dem natten over på fire degress Celsius. Efter hævelse vaskes perlerne tre gange med 10 milliliter de-ioniseret vand eller PBS, centrifugering ved 300 gange G i fem minutter efter hver vask.
Efter vaskningerne opsaltrede perlerne i en milliliter PBS for at opnå en gylle på 50 % for hver prøve ved 100 mikrogram GST-SUBE eller GST-kontrol til 100 mikroliter af glutathionsalte og 500 mikroliter PBS. Inkuber blandingen ved fire grader Celsius i mindst to timer, mens du roterer, og gendan derefter perlerne ved centrifugering ved 300 gange G i fem minutter og opslæm dem igen i PBS. Tag 10% af den tidligere forberedte celle lysate og fortyndes det i et tilsvarende volumen af 3X kogende buffer.
Der tilsættes 450 mikroliter af det afklarede lysat til 100 mikroliter af glutathionsæmeslamur. Inkuber lysatet med perlerne ved fire grader Celsius i mindst to timer, mens den langsomt roterer. Efter inkubationen drejes perlerne ned ved 300 gange G i fem minutter og indsaml supernatanten til analyse.
Overfør 10% af det samlede volumen til et separat rør og tilsæt et tilsvarende volumen på 3X kogende buffer. Den resterende prøve vaskes tre gange ved at tilsætte en milliliter iskold PBS med 05%Tween 20 og dreje den ned ved 300 gange G og fire grader Celsius i et minut. Inspirer forsigtigt supernatanten og sørg for, at der ikke er væske tilbage.
Derefter eluter prøven med 15 mikroliter af 3X kogende buffer og 15 mikroliter lysis buffer. Kør en western blot analyse i henhold til manuskriptet retninger. Hvis massespektrometri, afsalt peptiderne ved hjælp af fase-tip C18 mikrokolonner og resuspend dem i 0,1% myresyre før analyse.
Læg prøverne på et LC-MS-system, og analysér dem i tre eksemplarer. Fortsæt med protein identifikation og overflod beregning ved hjælp af den tilhørende software. Udfør statistisk analyse i henhold til manuskriptvejledningen.
Denne protokol er blevet brugt til at isolere SUMOylated proteiner i mus med glycin N-methyltransferasemangel, som forårsager spontan udvikling af leverkræft og deres vilde type littermates. Ponceau S farvning blev udført på input, flow-through, og bundet fraktioner fra SUBEs pull-down assay. Western blot analyse af LKB1 fanget med SUBEs viser, at niveauet af LKB1 SUMOylation er forstærket i levertumorer.
Humane hepatoma celler og ikke-transformerede lever epitelceller blev brugt til at undersøge kapaciteten af SUMO-fælden til at interagere med naturligt SUMOylated proteiner. For det første blev konventionel proteinfarvning brugt til at visualisere det samlede materiale, der blev fanget med SUBE'er. Derefter viste massespektrometri, at 742 proteiner blev beriget i hepatomacelle-SUBEs-prøven, og 577 blev beriget i leverepinden, ikke-transformeret celle SUBEs-prøve.
Når der udføres forsøg med SUBE'er, er det vigtigt at vedligeholde celler og væv på is og tilføje specifikke milliliter til lysisbufferen for at opretholde renheden af SUMOylated. Efter visualisering af SUMOylated proteome med SUBEs, kan vi finde karakterisering ved hjælp af enten vestlige blot analyse eller Mass-Spectrometri. Anvendelsen af SUBE'er til at isolere og karakterisere SUMOylated proteome i leverkræft væv og hepatoma celler baner vejen for at udforske den rolle, post-translationelle ændringer af SUMO i leverkræft, som kan give en potentiel terapeutisk mekanisme.