Name: sumo-binding entities (subes) as tools for the enrichment, isolation, identification, and characterization of the sumo proteome in liver cancer
Uploaded: 2019-11-01T13:00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van het Institut National du Cancer, Frankrijk, INCa Grant PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (Mexico) Grant 0280365 en het REPERE programma van Occitanie, Frankrijk (M.S.R.). Ook, NIH (US Department of Health and Human Services)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (naar M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en El plan Estatal de Onderzoeksbureau Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (Baskische Stichting voor innovatie en gezondheidsonderzoek): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III: PIE14/00031, integrado en El plan Estatal de Onderzoeksación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (to M.L.M.-C), Asociación Española Contra el cáncer (T. C. D, M. L. M-C), Daniel Alagille Award van EASL (naar T. C. D), Fundación científica de la Asociación Española Contra el kanker (AECC Scientific Foundation) zeldzame tumor noemt 2017 (naar M. L. M), La Caixa Foundation programma (naar M. L. M). Wij danken MINECO voor de Severo Ochoa Excellence accreditatie aan CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).

Alle experimenten werden goedgekeurd door de CIC bioGUNE institutionele comités voor dierenverzorging en-behandeling. Alle inspanningen werden gedaan om dierenleed te minimaliseren en het aantal gebruikte dieren te verminderen. 3 maanden oud mannelijk Glycine N-methyltransferase (GNMT) deficiënte (GNMT−/−) en zijn wilde type littermates (GNMT+/+) werden gebruikt.
1. voorbereiding van de cel en Lysis
Opmerking: hierin werden huh-7 (humane hepatoma cellijn) en THLE2 (humane hepatische cellijn) gebruikt.
<ol><li>Houd cellen in P100 platen in standaard groeimedia bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2-95% luchtvochtigheid.</li>
	<li>Kweekcellen in P100 platen met een dichtheid van 1,2 – 1,5 × 106 cellen per schotel door de cellen te tellen met behulp van een Neubauer hemocytometrie telkamer.<ol>
<li>Cultuur huh-7 in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicillaire-streptomycine-amfotericine B (PSA) en 1% glutamine.</li>
		<li>Cultuur THLE2 cellen in cultuur gerechten voorgecoat met 0,01 mg/mL fibronectin, 0,01 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) en 0,03 mg/mL collageen type I opgelost in groeimedium dat bestaat uit bronchiale epitheliale celgroei basale medium (BEGM) aangevuld met groeifactoren (0,4% BPE, 0,1% insuline, 0,1% hydrocortison, 0,1% retinoïnezuur, 0,1% transferrin, 0,1% trijodothyronine, evenals 10% FBS, 1% PSA, 5 ng/mL epidermale groeifactor (EGF) en 70 ng/mL foshoethanolamine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op het eindpunt van het experiment, aspireren de media van de platen en Wash cellen met 5 mL steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Lyse cellen direct op de plaat geplaatst op ijs met behulp van 500 μL lysisbuffer (50 mM tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), aangevuld met volledige EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en 50 μM PR-619 voor elke P100 gerecht. Met behulp van een celscraper, schrapen voorzichtig de cellen van de bodem van de plaat in het lysis medium. Opmerking: Controleer of alle cellen van de plaat zijn losgemaakt door de plaat basis visueel te inspecteren na de behandeling.</li>
	<li>Als alternatief, oogst cellen door trypsinisatie door aspirerende celmedia en voeg 1 mL 1x (0,05%) trypsine-EDTA aan de plaat, voldoende om de cellen te bedekken en de plaat in de broedplaats te plaatsen bij 37 °C, 5% CO2en 95% vochtigheid gedurende ~ 5 minuten, zodat alle cellen van de plaat zijn losgemaakt. Voeg 2 mL voorverwarmde groeimedium toe om trypsinoisatie te stoppen. Centrifugeer bij 150 g gedurende 10 minuten en zuig het supernatant op. Was met 1x PBS en centrifugeer bij 150 x g gedurende 10 minuten. Na het opzuigen van het supernatant, voeg 500 μL lysisbuffer (50 mM tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, aangevuld met volledige EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en 50 μM PR-619 voor elke P100 schotel. Opmerking: de toevoeging van de PR-619 is van cruciaal belang.</li>
	<li>Centrifugeer bij 15.500 x g en 4 °c gedurende 10 min. Breng de supernatant over naar een andere buis en gooi de pellet weg. Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd en samples opgeslagen bij-80 °C tot verdere analyse.</li>
</ol>2. weefsel preparaat en Lysis
<ol><li>Bij dieren offer, verzamelen muis levers, wassen met koude PBS, en snap bevriezen onmiddellijk in vloeibare stikstof. Bewaar de monsters − 80 °C tot verdere analyse.</li>
	<li>Homogeniseren 75 mg fragmenten uit snap-Frozen/of Fresh levers in 1 ml ijskoude lysisbuffer (50 mm tris pH 8,5, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1% NP40, aangevuld met volledige EDTA-vrije cocktail van proteaseremmer en 50 μM PR-619). Voer de homogenisator uit op 6500 x rpm, 2 x 60 s per stuk, met een 30 s pauze (Zie tabel met materialen).</li>
	<li>Centrifugeer de monsters in een microfugebuis bij 15, 500 x g en 4 °c gedurende 10 min. Breng de supernatant over naar een andere buis en gooi de pellet weg.</li>
	<li>Alternatief, wrijf 75 mg bevroren weefsels in vloeibare stikstof. Vervolgens herstelt u het weefsel in 1 mL lysisbuffer.</li>
	<li>Centrifugeer het monster in een microfugebuis bij 15, 500 x g en 4 °c gedurende 10 min. Breng het supernatant over naar een andere buis en gooi de pellet weg. Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd en samples opgeslagen bij-80 °C tot verdere analyse.</li>
</ol>3. binding van GST-SUBEs of GST Control aan glutathion-agarose kralen
Opmerking: de synthese van de GST-SUBEs of GST-controle valt buiten het bestek van dit manuscript en kan worden bekeken in eerder gepubliceerde literatuur20. Als alternatief zijn GST-en Control SUBEs commercieel beschikbaar (bijv. SignalChem).
<ol><li>Bereiding van glutathion kralen<ol>
<li>Voeg 1 mL gedeïoniseerd water toe aan 70 mg gelyofiliseerde glutathion-agarose kralen. Reconstitueer de parels 's nachts bij 4 °C (of gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur).</li>
		<li>Was de kralen grondig na zwelling (om lactose en ethanol te verwijderen die meestal aanwezig zijn in de gelyofiliseerde poeder agarose kralen). Om dit te doen, moet u eerst wassen met 10 mL gedeïoniseerd water of PBS, gevolgd door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voer deze driemaal uit.</li>
		<li>Na 3 wast, resuspendeer de parels in 1 mL PBS om een 50% (v/v) slurry te verkrijgen. Opmerking: dit volume is geschikt voor de analyse van 10 samples.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg voor elk monster 100 μg GST-SUBEs of GST Control (zie referentie20) toe aan 100 μL van de glutathion kralen slurry en 500 μL PBS. Opmerking: de relatieve overvloed van de SUMOylated eiwitten van belang bepaalt de hoeveelheid GST-SUBEs gebruikt voor pull-downs. Analyseer voor elk nieuw experimenteel model de toestand voorafgaand aan het eigenlijke experiment door Western de input, Bound en flow-through (FT) materiaal met anti-SUMO2/3 antilichamen of tegen eiwitten van belang (lever kinase B1 (LKB1).</li>
	<li>Inbroed alle GST-SUBEs of GST Control met kralen bereid in 3,2., langzaam roteren in Rotator of mini roller (Zie tabel van de materialen) bij 4 °c gedurende ten minste 2 uur (langzame bindende reactie). Opmerking: het toevoegen van 1 mm dithiotreïtol (DTT) verbetert de gst binding aan de glutathion kralen.</li>
	<li>Herstel de agarose-parels door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde, resuspendeerde de parels in PBS om 50% (v/v) slurry te verkrijgen. Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd en samples opgeslagen bij-80 °C tot verdere analyse.</li>
</ol>4. GST pull down assay
<ol><li>Na stap 1,5, 2,3 of 2,5, neem 1/10 van het totale volume (bv. 50 μL) en Verdun in hetzelfde volume van 3x kook buffer (250 mm tris-HCl pH 6,8, 500 mm β-mercaptoethanol, 50% glycerol, 10% SDS, broomfenolblauw). Deze breuk wordt beschouwd als INPUT.</li>
	<li>Voeg 450 μL geklaarde lysaat toe uit de stappen 1,5, 2,3 of 2,5 tot 100 μL glutathion kralen slurry. Inbroed het lysaat met kralen, langzaam roteren bij 4 °C gedurende ten minste 2 uur. Opmerking: als alternatief kan 100-200 μg totaal eiwit uit stap 1,5, 2,3 of 2,5 (gekwantificeerd met de Bradford-test) in een totaal volume van 450 μL worden gebruikt.</li>
	<li>Spin de kralen in een micro Fuge op 300 x g gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant voor de analyse. Breng 1/10 van het totale volume (bijv. 50 μL) over in een aparte buis en Verdun in een gelijk volume van 3x kook buffer. Deze breuk is de doorstroom (ft) Fractie.</li>
	<li>Was het resterende monster driemaal met 1 mL ijskoude PBS, 0,05% Tween 20, spin naar beneden bij 4 °C en 300 x g gedurende 1 minuut. Zorg ervoor dat er geen vloeistof overblijft. De parels corresponderen met SUBEs gebonden (SB) breuk.</li>
	<li>Elute het monster met 15 μL 3x kook buffer en 15 μL lysisbuffer. Dit wordt de afhankelijke breuk genoemd.</li>
</ol>5. identificatie en karakterisering van SUMO-targets door Western Blot Analysis
<ol><li>Voer de analyse van Western Blot uit met een anti-SUMO2/3-antilichaam of een ander specifiek antilichaam van keuze zoals eerder beschreven22.</li>
</ol>6. identificatie en karakterisering van het SUMOylated proteome door massaspectrometrie
Opmerking: in het geval van massaspectrometrie (MS)-analyse werden monsters verwerkt met behulp van de door Wisniewski et al.23beschreven filter-aided monster Preparation (fasp) methode.
<ol><li>Ontzout de peptiden met behulp van stage-Tip C18 microcolumns en verwerk ze in 0,1% mierenzuur (FA) voorafgaand aan MS-analyse.</li>
	<li>Laad de monsters op een LC-MS-systeem (Zie tabel met materialen) en analyseer ze in drievat (technische duplo's) (Figuur 2b).</li>
	<li>Doorgaan met de eiwit identificatie en abundantie berekening met behulp van een bijbehorende software.</li>
	<li>Voor statistische analyses en het genereren van Heatmap laadt u de gegevens op het Perseus-platform (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Breng een permutatie gebaseerde valse Discovery rate (FDR)-gecorrigeerde t-test voor de vergelijking van de Abundances. Eiwitten met een q < 0,05 en een SUBEs/GST-ratio groter dan 2 werden beschouwd als verrijkte24. Opmerking: eiwitten die met ten minste twee verschillende peptiden worden geïdentificeerd, worden in de uiteindelijke analyse meegenomen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 379 (9822), 1245-1255 (2012).</li><li>Gerbes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+roundtable+meeting+paper:+selected+recent+advances+in+hepatocellular+carcinoma.">Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma.</a> Gut. , (2017).</li><li>Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+therapies+for+hepatocellular+carcinoma.">New therapies for hepatocellular carcinoma.</a> Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).</li><li>Grotenbreg, G., Ploegh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology:+dressed-up+proteins.">Chemical biology: dressed-up proteins.</a> Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).</li><li>Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+compilation+of+SUMO+proteomics.">A comprehensive compilation of SUMO proteomics.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).</li><li>Seeler, J. S., Dejean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+the+robustness+of+cancer.">SUMO and the robustness of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (3), 184-197 (2017).</li><li>Tomasi, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-adenosyl+methionine+regulates+ubiquitin-conjugating+enzyme+9+protein+expression+and+sumoylation+in+murine+liver+and+human+cancers.">S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers.</a> Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cbx4+governs+HIF-1alpha+to+potentiate+angiogenesis+of+hepatocellular+carcinoma+by+its+SUMO+E3+ligase+activity.">Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity.</a> Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).</li><li>Zubiete-Franco, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+regulates+LKB1+localization+and+its+oncogenic+activity+in+liver+cancer.">SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer.</a> EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).</li><li>Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+its+role+in+human+diseases.">SUMO and its role in human diseases.</a> Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).</li><li>Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+Identify+Recognition+Signals+and+Targets+of+SUMOylation.">Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation.</a> Biochemical Research International. , 875148 (2012).</li><li>Liang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO5,+a+Novel+Poly-SUMO+Isoform,+Regulates+PML+Nuclear+Bodies.">SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies.</a> Science Reports. 6, 26509 (2016).</li><li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+ubiquitin-related+modifier+(SUMO)-specific+proteases:+profiling+the+specificities+and+activities+of+human+SENPs.">Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs.</a> Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).</li><li>Hilgarth, R. S., Sarge, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sumoylated+proteins.">Detection of sumoylated proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 301, 329-338 (2005).</li><li>Vertegaal, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+study+of+SUMO-2+target+proteins.">A proteomic study of SUMO-2 target proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).</li><li>Bruderer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+identification+of+endogenous+polySUMO+conjugates.">Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates.</a> EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).</li><li>Becker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+endogenous+SUMO+targets+in+mammalian+cells+and+tissues.">Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues.</a> Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).</li><li>Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+endogenous+SUMO1+and+SUMO2/3+targets+in+mammalian+cells+and+tissues+using+monoclonal+antibodies.">Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies.</a> Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).</li><li>Hendriks, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+characterization+of+endogenous+SUMOylation+across+species+and+organs.">Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs.</a> Nature Communications. 9 (1), 2456 (2018).</li><li>Da Silva-Ferrada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+SUMOylated+proteins+using+SUMO-traps.">Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps.</a> Science Reports. 3, 1690 (2013).</li><li>Hjerpe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+protection+and+isolation+of+ubiquitylated+proteins+using+tandem+ubiquitin-binding+entities.">Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities.</a> EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).</li><li>Embade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+double+minute+2+regulates+Hu+antigen+R+stability+in+human+liver+and+colon+cancer+through+NEDDylation.">Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation.</a> Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+Parallel+Accumulation-Serial+Fragmentation+(PASEF)+with+a+Novel+Trapped+Ion+Mobility+Mass+Spectrometer.">Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+SUMO1+Modification+of+LKB1+Regulates+AMPK+Activity+during+Energy+Stress.">A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress.</a> Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).</li><li>Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biotinylated+SUMO-Traps+to+Analyze+SUMOylated+Proteins.">Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).</li><li>Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Surface+Plasmon+Resonance+(SPR)+for+the+Analysis+of+Interactions+Between+SUMO+Traps+and+Mono-+or+PolySUMO+Moieties.">Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties.</a> Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).</li></ol>

Dr. Martínez-chantar adviseert voor Mitotherapeutix LLC.

Hierin hebben we een volledige en gedetailleerde beschrijving gegeven van de methodologie die het gebruik van SUBEs meldt voor de verrijking, isolatie en identificatie en karakterisering van de SUMOylated eiwitten in in vivo modellen van leverkanker. Zowel in muizen lever tumoren en menselijke hepatoma cellen, we waren in staat om te isoleren en te identificeren sumoylated eiwitten van belang en voor het uitvoeren van een hoge doorvoer karakterisering van de sumoylated Proteoom en interactome. Hoewel de synthese van SUBEs buiten het bestek van dit manuscript valt, moeten voor verdere informatie de volgende verwijzingen naar26worden bekeken. Het beschreven protocol is snel en zeer gevoelig en de kritieke stap van het protocol omvat het gebruik van SENPs-remmers (PR-619). In het alternatief kunnen chemische isopeptidase remmers zoals NEM (N-Ethylmaleimide) en IAA (2-Iodoacetamide) in de lysisbuffer worden gebruikt, maar uit eerdere rapporten is gebleken dat het gebruik van PR-619 voor het subes-protocol voordelig is als de andere remmers interfereren met GST binding aan de glutathion kralen20.
SUBEs zijn recombinant eiwitten die tandem herhalingen van SIMs bevatten, waardoor SUMO-moleculen op gemodificeerde eiwitten worden herkend met een toename van de algehele affiniteit voor SUMO-substraten. Vanwege de hoge specificiteit en gevoeligheid is het gebruik van Suben voor de isolatie van het sumoylated Proteoom voordelig in vergelijking met andere benaderingen in de literatuur, zoals de detectie door Western-Blot van specifieke sumoylated eiwitten met antilichamen tegen het eiwit van belang of de nikkel-chromatografie met behulp van de verschillende histidine-gelabelde versies van SUMO-moleculen. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat als het SUBEs-protocol wordt uitgevoerd onder niet-denaturerende omstandigheden, de interactie tussen SUMOylated eiwitten en andere werkende eiwitten wordt gehandhaafd. Daarom verkrijgen we informatie over de SUMO interactome in plaats van alleen een lijst van SUMOylated doel eiwitten. Daarom zijn verdere experimenten nodig om te bevestigen of het geïdentificeerde eiwit een SUMO-doelwit of een interactie factor is. Andere beperking van de SUBEs is het feit dat controle GST traps gebruikt zijn in staat om veel achtergrond eiwitten die verband houden met oxidatieve stress vast te leggen. Dit probleem is vooral relevant tijdens de MS-analyse vanwege de hoge gevoeligheid van de techniek. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn biotinyleerd Sumo-traps (biosubes) ontwikkeld26. Een andere beperking van SUBEs woont in het feit dat we alleen kunnen vangen eiwitten gemodificeerd door SUMO 2 en SUMO 3 terwijl SUMO 1-gemodificeerde eiwitten niet kunnen worden geïsoleerd.
Andere bezorgdheid over het gebruik van SUBEs is gerelateerd aan de hoeveelheid uitgangsmateriaal die nodig is voor de procedure. Het uitgangsmateriaal dat wordt gebruikt om SUMOylated eiwitten vast te leggen, moet rekening houden met de verschillende experimentele omstandigheden. Terwijl basale SUMOylation is gemeld in verschillende cellulaire contexten, SUMOylation is een proces dat sterk wordt geïnduceerd na meerdere stress voorwaarden/stimuli. Bij het vergelijken van onbehandelde versus behandelde monsters moet men er zeker van zijn dat de kolom niet verzadigd is en er verschillen tussen die omstandigheden kunnen worden waargenomen. In het geval van de muis fenotypes die we analyseren, zijn er geen behandelingen gebruikt en zijn de basale Sumoylatie niveaus laag. Om deze reden werden grote hoeveelheden eiwitten gebruikt. Het achtergrondniveau moet worden bepaald met behulp van GST en als de niet-specifieke binding hoog is, moet de hoeveelheid begin materiaal of de bindingstijd worden verlaagd. De analyse van de FT-fractie kan indicatief zijn voor de opname-efficiëntie, zelfs als deze vallen de voorkeur geven aan poly-SUMOylated eiwitten en een totale depletie niet mag worden verwacht, is een reductie van de totale Sumoylering in het algemeen goed waargenomen wanneer de vangst efficiëntie Optimale.
Tot slot, andere toepassing van de SUBEs-technologie omvat de combinatie van SUBEs-technologie met real-time Surface Plasmon Resonance (SPR) waardoor de real-time interacties met SUMOylated eiwitten uit celextracten27. Ook, meer recentelijk, biotinyleerd Sumo-traps (biosubes) zijn ontwikkeld met het voordeel om de achtergrond van grotere Tags te verminderen, bijvoorbeeld tijdens massaspectrometrie analyse26. Bovendien kan de bioSUBE-versie worden gebruikt om SUMOylated eiwitten in levende cellen te detecteren door fluorescentie door het gebruik van streptavidine-gelabeld met duidelijke fluorescerende kleurstoffen die profiteren van de streptavidine binding aan biotine. Ook kunnen methoden voor de detectie en kwantificering van SUMOylated eiwitten worden overwogen met zowel GST-als bioSUBEs-versies, zoals het werd gedaan met de tandem ubiquitine bindings entiteiten (TUBEs)21.
Over het algemeen is het gebruik van Suben voor de isolatie en karakterisering van het sumoylated Proteoom dat relevant is voor leverkanker een snelle en gevoelige methode die enorme informatie verschaft over de nog steeds eerder onbekende rol van het sumoylatiepad in leverkanker.

Leverkanker is de zesde meest voorkomende kanker wereldwijd en de tweede oorzaak van de kanker-geassocieerde sterfgevallen1. Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de meest heersende vorm van primaire leverkanker. In het verleden waren de gemeenschappelijke risicofactoren voor de ontwikkeling van HCC chronische hepatitis B-of C-infectie en misbruik van alcoholgebruik. In de laatste decennia, het metabool syndroom, type 2 diabetes niet-alcoholische vette leverziekte (NAFLD) is ontstaan als risicofactoren voor de ontwikkeling van HCC2. HCC is zeer heterogeen, zowel fenotypisch als genetisch, waarbij een complex netwerk van signalerings trajecten verstoord wordt. In de afgelopen jaren, ook al is er een toename van onze kennis over de moleculaire trajecten die betrokken zijn bij de pathogenese van HCC, er zijn nog steeds geen effectieve therapeutische benaderingen voor HCC management. Veel trajecten worden geactiveerd in HCC en remmen een over het algemeen drijft de compensatie door andere trajecten3. Dit was een van de grootste moeilijkheden bij de behandeling van HCC. Een meer globale aanpak kan dus een potentiële therapeutische aanpak bieden voor het klinisch beheer van leverkanker, bijvoorbeeld gericht op post-translationele modificaties (Ptm's), omdat meerdere signalering trajecten gelijktijdig kunnen worden gereguleerd door Ptm's van eiwitten.
Post-translationele modificaties worden beschouwd als belangrijke mechanismen reguleren van eiwit homeostase en functies4. Structurele en functionele veranderingen worden geïntroduceerd door ptm's, waardoor de Proteoom diversiteit toeneemt. De meest voorkomende Ptm's omvatten fosforylering, methylering, acetylering, glycosylatie, alomtegenwoordige en conjugatie van ubiquitin-achtige eiwitten (Ubl's). Onder alle Ubl's, eiwit modificatie door SUMO (kleine Ubiquitin MOdifier) heeft aandacht getrokken in verband met zijn cruciale rol in een verscheidenheid van cellulaire processen, met inbegrip van transcriptie, cellulaire lokalisatie, DNA-herstel, en celcyclus progressie 5. onlangs bleek sumoylatie te worden gewijzigd in leverkanker6,7,8,9, en veranderingen in de sumoylatie van specifieke eiwitten is beschreven om een rol te spelen in de progressie van kanker-gerelateerde ziekten9.
Bij zoogdieren zijn er vijf SUMO paralogues, SUMO-1 tot SUMO-5. Tot op heden is er geen experimenteel bewijs beschikbaar over het bestaan van endogene SUMO-4 en endogene SUMO-5 conjugatie reacties op het eiwit niveau10,11,12. Sumoylatie in zoogdieren wordt uitgevoerd door een enzymatische thiol-Ester Cascade met drie enzymen, het heterodimeric SUMO activerende enzym (SAE1/SAE2) of E1, het SUMO-conjugerende enzym (Ubc9) of E2 en een SUMO-E3-ligase specifiek voor elk doeleiwit. De actie van verschillende families van SUMO E3s lijkt te zijn in een dynamisch evenwicht met SUMO-specifieke proteasen (SUSPs of SENPs)13 waardoor de SUMOylation reactie zeer omkeerbaar. Bovendien is slechts een kleine fractie van het SUMOylated eiwit versus niet-SUMOylated totaal eiwit aanwezig. Daardoor is het isoleren van endogene SUMOylated eiwitten in vivo nogal uitdagend13.
Sumoylatie in vivo werd aanvankelijk bestudeerd door Western Blot met antilichamen tegen het eiwit van belang14. Immunoprecipitatie van het eiwit werd uitgevoerd met specifieke antilichamen en vervolgens werd PAGE-Western Blot uitgevoerd met anti-SUMO antilichamen. Het belangrijkste probleem met deze strategie is dat antilichamen die zijn gegenereerd tegen een niet-gemodificeerd recombinant eiwit niet altijd in staat zijn om de SUMOylated vorm van een eiwit te immunoprecipiteren. Als alternatief, nikkel chromatografie na de voorbijgaande uitdrukking van histidine Tagged (His6) versies van SUMO moleculen en het eiwit van belang is gebruikt voor het bestuderen van Sumoylering in cellen. Op deze basis, het zal handiger zijn om te detecteren SUMO gewijzigde formulieren van cellen stabiel uitdrukken His6-SUMO15. Voor in vivo studies, tandem-SUMO-interactie motieven (SIM) gebaseerde verrijking werd aangetoond voor de zuivering van polySUMO conjugaten16. Andere groepen zijn met behulp van epitope-Tagged antilichaam Sumo benaderingen bieden een haalbaar instrument om te onderzoeken van endogene sumoylatie in primaire cellen, weefsels, en organen17,18. En meer recentelijk hebben Nielsen en collega's gebruik gemaakt van op antilichamen gebaseerde verrijking om endogene en sitespecifieke SUMO in cellen en weefsels19te identificeren.
Om aanvullende informatie te verstrekken over de rol van Sumoylering in vivo, werden SUMO-bindende entiteiten (SUBEs), ook bekend als SUMO-traps, ontwikkeld20. Van relevantie, tandem ubiquitine bindende entiteiten (buizen) worden beschouwd als de conceptuele voorlopers van SUBEs en zijn commercieel beschikbare instrumenten voor de opsporing en isolatie van polyubiquityated eiwitten21. SUBEs zijn recombinant eiwitten die tandem herhalingen van SIMs bevatten, waardoor SUMO-moleculen op gemodificeerde eiwitten worden herkend met een toename van de algehele affiniteit voor SUMO-substraten. Sumo-traps werden ontworpen door de introductie van een E3 ubiquitin-eiwit ligase RNF4-afgeleide SIM2 en SIM3 motieven in tandem, in een vector met glutathion S-transferase (GST), een heterologe dragerproteïne20. Hoewel SUBEs niet goed kunnen worden gebruikt om mono-SUMOylated doel eiwitten te identificeren, biedt deze methode een hulpmiddel om de zuivering en identificatie van poly-SUMO-doel eiwitten in vivo te vergemakkelijken. Hierin beschrijven we de toepassing van SUBEs om SUMOylated eiwitten te isoleren, zowel in humane hepatoma cellen als bij muizen lever biopsieën, een belangrijk hulpmiddel voor de studie van leverkanker. Een totaal schema van het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, wordt weergegeven in Figuur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Gnmt&#8722;/&#8722;)/ (Gnmt+/+) mice</td>
			<td>CIC bioGUNE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEBM</td>
			<td>Lonza/Clonetics Corporation</td>
			<td>cc-3171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEGM Bullet Kit</td>
			<td>Lonza/Clonetics Corporation</td>
			<td>CC3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 microcolumns</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z720070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-136157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete tablets EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14431-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>e9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-Control</td>
			<td>SignalChem</td>
			<td>G52-30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-SUBEs</td>
			<td>SignalChem</td>
			<td>S291-340G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>CLS (Cell Lines Service)</td>
			<td>300156</td>
			<td>https://clsgmbh.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA (2-Iodoacetamide)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L58046844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LKB1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini LabRoller Rotator</td>
			<td>LABNET</td>
			<td>H5500</td>
			<td>https://www.labnetinternational.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoElute</td>
			<td>BRUKER</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bruker.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM (N-Ethylmaleimide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peaks software</td>
			<td>Bioinformatics Solutions Inc.</td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinfor.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoetanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR-619</td>
			<td>Merck</td>
			<td>662141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td>P000669-PR240-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab3742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THLE-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2706</td>
			<td>http://www.lgcstandards-atcc.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer</td>
			<td>BRUKER</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bruker.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sumo-binding entities (subes) as tools for the enrichment, isolation, identification, and characterization of the sumo proteome in liver cancer

Post-translationele modificatie is een belangrijk mechanisme reguleren van eiwit homeostase en functie in eukaryotische cellen. Onder alle ubiquitin-achtige eiwitten in leverkanker heeft de modificatie door SUMO (kleine Ubiquitin-MOdifier) de meeste aandacht gekregen. Isolatie van endogene SUMOylated eiwitten in vivo is uitdagend vanwege de aanwezigheid van actieve SUMO-specifieke proteasen. De initiële onderzoeken naar Sumoylatie in vivo waren gebaseerd op de moleculaire detectie van specifieke SUMOylated eiwitten (bijv. door Western Blot). Echter, in veel gevallen, antilichamen, over het algemeen gemaakt met niet-gemodificeerde recombinant eiwit, niet immunoprecipitate SUMOylated vormen van het eiwit van belang. Nikkel chromatografie is de andere benadering geweest om Sumoylatie te bestuderen door het vastleggen van histidine-gelabelde versies van SUMO-moleculen. Deze aanpak wordt voornamelijk gebruikt in cellen die stabiel of transitief met zijn-SUMO moleculen worden getransffecteerd. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) ontwikkeld om endogene SUMOylated eiwitten te isoleren. Hierin beschrijven we alle stappen die nodig zijn voor de verrijking, isolatie en identificatie van SUMOylated substraten van humane hepatoma cellen en hepatische weefsels uit een leverkanker muismodel met behulp van SUBEs. Ten eerste beschrijven we methoden die betrokken zijn bij de voorbereiding en Lysis van de humane hepatoma cellen en lever tumorweefsel monsters. Dan, een grondige uitleg van de voorbereiding van SUBEs en controles wordt gedetailleerd samen met het protocol voor de eiwit pull-down assays. Ten slotte worden enkele voorbeelden gegeven met betrekking tot de beschikbare opties voor de identificatie en karakterisering van het SUMOylated proteome, namelijk het gebruik van de analyse van de Western-Blot voor de detectie van een specifiek Sumoylleerd substraat van lever tumoren of het gebruik van proteomica door massaspectrometrie voor de karakterisering van hoge doorvoer van het sumoylated Proteoom en interactome in hepatoma cellen.

Identificatie van een specifiek SUMOylation substraat in lever tumor biopsies door Western Blot analyse
Lever kinase B1 (LKB1) sumoylation is onlangs aangetoond dat een belangrijke oncogene bestuurder in leverkanker9,25. Muizen met een tekort aan Glycine N-methyltransferase (GNMT), vaak aangeduid als GNMT−/−, is een model dat spontaan hepatocellulaire carcinoom (HCC) ontwikkelt, de meest voorkomende vorm van primaire leverkanker. Subes werden gebruikt om de sumoylated eiwitten te verrijken en te isoleren, zowel in GNMT−/− muizen met leverkanker muizen als in het wild type littermates (GNMT+/+). In Fig. 2azijn Ponceau S kleuring van de drie verschillende fracties (input, ft en Bound) verkregen in de subes pull-down assay inbegrepen. Een Ponceau S Stain is nuttig om een mogelijk schadelijk effect op het laden van uitgebloefde eiwitten te controleren door westerse blots te beoordelen. In Figuur 2b wordt een Western Blot-analyse van LKB1 met behulp van subes voor het vastleggen van endogene SUMOylated LKB1 weergegeven. De niveaus van LKB1 SUMOylation worden verhoogd in lever tumoren. In het geval van de analyse van Western Blot werden gelijke belastingen en overgedragen eiwitten waargenomen door Ponceau kleuring van de ingangs Fractie en werden niet significant veranderd na wassen (doorstroming door breuk). De hoeveelheid eiwit gevangen met SUBEs was aanzienlijk hoger, met name in de tumoren. Als alternatief kan de kleuring van een duplicaat gel met Coomassie Blue soortgelijke informatie bieden. Kleverige eiwitten zoals p53 of SUMOylated vormen van sommige eiwitten kunnen aan de GST-controle binden. Om de achtergrond te verwijderen, agarose-kralen met lage dichtheid te gebruiken, een coating met BSA uit te voeren of extra wasmiddel in te nemen. Echter, dit kan invloed hebben op toepassingen zoals massaspectrometrie en kan leiden tot verlies van lage affiniteit interactie eiwitten.
Karakterisering van de SUMO interactome in humane hepatoma cellen door massaspectrometrie analyse
Om te onderzoeken van de capaciteit van de SUMO-trap om te communiceren met natuurlijke SUMOylated eiwitten, huh-7 (menselijke hepatoma) en niet-getransformeerde lever epitheliale menselijke THLE2 cellijnen werden gebruikt. De eerste stap is de visualisatie van het totale materiaal dat is vastgelegd met SUBEs en het gebruik van GST als een negatieve controle. Hiervoor kunnen we conventionele eiwit kleurings protocollen gebruiken zoals weergegeven in Figuur 3a. Vervolgens, we voerden massaspectrometrie analyse. Een gemiddelde van 2268 eiwitten werden geïdentificeerd in de Huh7 GST-monsters (2339, 2297 en 2168 voor elke belasting), terwijl 2812-eiwitten gemiddeld werden geïdentificeerd in het Huh7-monster van SUBEs (2815, 2817 en 2806). Na het aftrekken werden 742 eiwitten verrijkt in de SUBEs. Aan de andere kant, een gemiddelde van 2497 eiwitten werden geïdentificeerd in de THLE2 GST monsters (2476, 2520 en 2495, respectievelijk) en 2763 in de SUBEs (2823, 2783 en 2684). Van deze, 577 werden beschouwd als verrijkt in de SUBEs monsters. Analyse van technische replicaten haalt de heatmap op die wordt weergegeven in Figuur 3b, die werd berekend aan de hand van de beschikbare standaardinstellingen (Euclidische afstand, gemiddelde koppeling en voorbewerkt met k-middelen). De heatmap toont de verdeling van de 100 meest significante en uitsluitend verrijkte eiwitten in elke cellijn.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch diagram van het protocol stroomschema dat wordt gebruikt voor de verrijking, isolatie en identificatie en de karakterisering van het sumoylated Proteoom in vivo voor de studie van leverkanker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig02.jpg"> Figuur 2: modificatie van LKB1 door SUMO-2 in muismodellen van hepatocellulaire carcinoom. a) Ponceau S kleuring van de drie verschillende fracties (input, flow through (ft) en Bound) verkregen in de subes pull-down test. b) analyse van Western Blot van LKB1 door het gebruik van Sumo-bindende entiteiten (subes) om endogene SUMOylated LKB1 vast te leggen; GAPDH wordt gebruikt als laadregelaar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig03.jpg"> Figuur 3: verschillen tussen de sumoylated Proteoom tussen de tumor huh-7 en niet-getransformeerde lever epitheel THLE2 menselijke cellijnen. a) sypro-kleuring van opgenomen proteïne-materiaal, met gst (negatieve controle) en subes. c) heatmap met de differentieel verrijkte eiwitten in huh-7-en THLE2-sube-samples. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer at JoVE.com

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Hier presenteren we een protocol om te verrijken, isoleren, identificeren en karakteriseren van eiwitten die zijn gewijzigd door SUMO in vivo zowel van menselijke hepatoma cellen en lever tumoren verkregen uit muizen modellen van hepatocellulaire carcinoom met behulp van SUMO-bindende entiteiten (SUBEs).

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

SUMO-bindende entiteiten maken het mogelijk om endogene SUMOylated eiwitten in vivo te isoleren. Dit is nogal uitdagend vanwege de aanwezigheid van actieve SUMO-specifieke protease en de lage fracties van sumoylated eiwitten in vivo. De isolatie van het sommoylated proteoom door het gebruik van SUMO-bindende entiteiten is voordelig omdat het een toename van de algehele affiniteit voor SUMO substraten uitstelt.Dit is te wijten aan het feit dat SUBEs komen vaak voor in eiwitten die bestaan uit tandem herhalingen van SSI's waardoor specifiek SUMO moleculen op gemodificeerde eiwitten te herkennen. Het gebruik van SUMO-bindende entiteiten voor de isolatie en karakterisering van het sommoylace bij leverkanker is een snelle en gevoelige methode. Het biedt informatie uit het verleden over de vrij onbekende rol van de SUMOylation-route bij leverkanker in een potentiële therapeutische benadering.SUMO-bindende entiteiten kunnen worden gebruikt om het sumoylated proteoom in andere weefsels naast de lever te isoleren en te karakteriseren, zowel van menselijke specimens als dierlijke modellen, evenals in verschillende cellulaire modellen. Hoewel deze techniek is gemakkelijk uit te voeren, zorg moet worden genomen bij het analyseren van verschillende monsters op hetzelfde type. koeler kubus aan de verschillende stappen betrokken.Daarom raden we aan om de buizen zorgvuldig af te nivelleren voordat u dit experiment start. De visuele demonstratie van het gebruik van SUMO-bindende entiteiten vergemakkelijkt de revolutie van dit protocol, vooral vanwege de moeilijkheden bij het hanteren van de bits en het verlies van materiaal tijdens het protocol. Menselijke hepatoma cellen zijn eerder bereid door plating cellen in P100 platen op een dichtheid van 1,2 tot 1,5 miljoen cellen per schotel en handhaven ze in standaard groeimedia op 37 graden Celsius.Wanneer u klaar bent om de cellen te gebruiken, de media van de platen aanzuigen en ze wassen met vijf millimeter steriele PBS. Zet de plaat op ijs en voeg 500 microliters lyse buffer aangevuld volgens het manuscript richtingen. Gebruik vervolgens een celschraper om de cellen voorzichtig van de bodem van de plaat in het lysemedium te schrapen.U de cellen ook oogsten door trypsinisatie en voeg een milliliter trypsine-EDTA toe aan de plaat om ervoor te zorgen dat de cellen bedekt zijn. Zet de plaat in een 37 graden Celsius incubator gedurende vijf minuten om hen los te maken van de plaat, voeg dan twee milliliter van voorverwarmde groeimedium om de trypsinisatie te stoppen. Centrifugeer de cellen op 150 keer G gedurende 10 minuten en aspirate de supernatant.Was vervolgens de cellen met PBS en centrifuge voor nog eens 10 minuten. Aspirate de supernatant en voeg 500 microliters van lyse buffer. Centrifugeren de lyse cellen op 15000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten, breng de supernatants naar een verse buis en gooi de pellet.Wanneer klaar om de geoogste muislevers te gebruiken, homogenize 75 milligram verse of gebroken bevroren fragmenten in een milliliter van ijskoude lysis buffer. Voer de homogenisator volgens de handschrift aanwijzingen. Na weefselhomogenisatie, centrifugeren de monsters op 15000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Breng de supernatant naar een verse buis en gooi de pellet weg. Bereid glutathion kralen door het toevoegen van een milliliter gedeïoniseerd water tot 70 milligram kralen en reconstituting ze 's nachts bij vier degress Celsius. Na zwelling, was de kralen drie keer met 10 milliliter gedeïoniseerd water of PBS, centrifugeren op 300 keer G gedurende vijf minuten na elke wasbeurt.Na de wasbeurten, resuspend de kralen in een milliliter PBS om een 50% drijfmest voor elk monster te verkrijgen op 100 microgram GST-SUBEs of GST controle tot 100 microliter van de glutathion kraal drijfmest en 500 microliter van PBS. Incubeer het mengsel op vier graden Celsius gedurende ten minste twee uur tijdens het draaien, dan herstellen van de kralen door centrifugatie op 300 keer G gedurende vijf minuten en resuspend ze in PBS. Neem 10% van het eerder bereide cellysaat en verdun het in een gelijk volume van 3X kokende buffer.Voeg 450 microliter van het geklaarde lysaat toe aan 100 microliter van de glutathion kraaldrijfmest. Broed het lysaat met de kralen op vier graden Celsius gedurende ten minste twee uur, terwijl langzaam draaien. Na de incubatie, spin de kralen op 300 keer G gedurende vijf minuten en het verzamelen van de supernatant voor analyse.Breng 10% van het totale volume over naar een aparte buis en voeg een gelijk volume van 3X kookbuffer toe. Was het resterende monster drie keer door het toevoegen van een milliliter ijskoude PBS met 05% Tween 20 en spinnen het naar beneden op 300 keer G en vier graden Celsius gedurende een minuut. Zorgvuldig aspirate de supernatant ervoor te zorgen dat er geen vloeistof blijft.Dan elute het monster met 15 microliters van 3x koken buffer en 15 microliter lyse buffer. Voer een westelijke vlekanalyse uit volgens de aanwijzingen van het manuscript. Als het uitvoeren van Mass-Spectrometrie, desalt de peptiden met behulp van stage-tip C18 microcolumns en resuspend ze in 0,1%mierenzuur voorafgaand aan de analyse.Laad de monsters op een LC-MS-systeem en analyseer ze in drievoud. Ga verder met eiwitidentificatie en overvloedberekening met behulp van de bijbehorende software. Statistische analyse uitvoeren volgens de aanwijzingen van het manuscript.Dit protocol is gebruikt om sumoylated eiwitten te isoleren in muizen met glycine N-methyltransferase deficiëntie die spontane ontwikkeling van leverkanker en hun wilde type littermates veroorzaakt. Ponceau S kleuring werd uitgevoerd op de input, flow-through, en BOUND Breuken van de SUBEs pull-down test. Westerse vlekanalyse van LKB1 gevangen met SUBEs toont aan dat de niveaus van LKB1 SUMOylation worden verhoogd in levertumoren.Menselijke hepatomacellen en niet-getransformeerde leverepepitheelcellen werden gebruikt om de capaciteit van de SUMO-val te onderzoeken om te interageren met natuurlijk SUMOylated eiwitten. Ten eerste werd conventionele eiwitvlekken gebruikt om het totale materiaal dat met SUBEs werd gevangen, te visualiseren. Toen bleek uit massaspectrometrie dat 742 eiwitten werden verrijkt in het hepatomacel SUBE's monster en 577 werden verrijkt in het levereppitheel niet-getransformeerde celSUBE monster.Bij het uitvoeren van experimenten met SUBE's is het belangrijk om cellen en weefsels op ijs te houden en specifieke milliliters toe te voegen aan de lysebuffer om de zuiverheid van sumoylated te behouden. Na visualisatie van het sommoylaatproteoom met SUBEs, kunnen we de karakterisering vinden met behulp van een westerse vlekanalyse of massaspectrometrie. De toepassing van de SUBE's om het sumoylated proteoom in leverkankerweefsels en hepatomacellen te isoleren en te karakteriseren, maakt de weg vrij om de rol van de post translationele wijzigingen van SUMO bij leverkanker te onderzoeken, die een potentieel therapeutisch mechanisme kunnen bieden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering van eiwitten door grootte-uitsluiting chromatografie gekoppeld aan multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Verrijking van zoogdierweefsels en Xenopus-eicyten met cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...