Name: in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure
Uploaded: 2019-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

Denne studien er finansiert av Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award og NIEHS R01ES028829 (til K. M. G). Vi vil gjerne takke Dr. Dianne Walters (Department of fysiologi, ECU) for hennes hjelp med å skaffe representative bilder av alveolære makrofager.

Alle metoder ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av Øst Carolina universitet.
1. ozon (O3) og filtrert luft eksponering (dag 1)
<ol><li>Plasser maksimalt 12 kvinnelige C57BL/6J mus, 8-12 uker gamle, i et stål bur (med 12 separate rom) med netting lokk i en O3 eksponerings kammer.</li>
	<li>Plasser termometeret i eksponerings kammeret med buret for å nøyaktig registrere temperatur og fuktighet.</li>
	<li>Slå på oksygen og ul...

<ol>
	<li>Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+macrophages+as+the+guardians+of+tissue+repair+in+the+lung.">Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung.</a> Immunology and Cell Biology. , (2019).</li><li>Gregoire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+efferocytosis+and+neutrophil+extracellular+trap+clearance+by+macrophages+in+ARDS.">Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS.</a> European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).</li><li>Fan, E. K. Y., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alveolar+macrophage+death+in+acute+lung+inflammation.">Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation.</a> Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).</li><li>Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+dying+cells+and+autoimmunity.">Clearance of dying cells and autoimmunity.</a> Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).</li><li>Bhattacharya, J., Westphalen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-epithelial+interactions+in+pulmonary+alveoli.">Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli.</a> Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).</li><li>Donnelly, L. E., Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+in+airways+disease.">Defective phagocytosis in airways disease.</a> Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).</li><li>Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+efferocytosis+by+alveolar+macrophages+in+IPF+patients.">Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients.</a> Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).</li><li>Vandivier, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibits+phagocytosis+of+apoptotic+cells+with+proinflammatory+consequences.">Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).</li><li>Grabiec, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+airway+macrophage+expression+of+the+Axl+receptor+tyrosine+kinase+is+associated+with+defective+efferocytosis+in+asthma.">Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).</li><li>Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+released+by+apoptotic+T+cells+contributes+to+an+immunosuppressive+milieu.">TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu.</a> Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).</li><li>Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiinflammatory+effects+of+CD95+ligand+(FasL)-induced+apoptosis.">Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).</li><li>O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+beta-cells+is+reduced+in+neonatal+autoimmune+diabetes-prone+rats.">Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats.</a> Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).</li><li>Shen, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineralocorticoid+Receptor+Deficiency+in+Macrophages+Inhibits+Atherosclerosis+by+Affecting+Foam+Cell+Formation+and+Efferocytosis.">Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).</li><li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation,+Tissue+Repair,+and+Tolerance+to+Infection.">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).</li><li>Hamon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bushfire+smoke+is+pro-inflammatory+and+suppresses+macrophage+phagocytic+function.">Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function.</a> Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).</li><li>Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+as+a+regulator+of+macrophage+chemokine+receptor+expression+and+polarization.">Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization.</a> European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).</li><li>Karaji, N., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+of+Pathogen-Infected+Cells.">Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).</li><li>Brouckaert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+necrotic+cells+by+macrophages+is+phosphatidylserine+dependent+and+does+not+induce+inflammatory+cytokine+production.">Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).</li><li>Gonzalez-Guevara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+ozone+induces+a+systemic+inflammatory+response:+possible+source+of+the+neurological+alterations+induced+by+this+gas.">Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas.</a> Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).</li><li>Robertson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+mediates+endothelial+dysfunction+downstream+of+circulating+factors+induced+by+O3+exposure.">CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure.</a> Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).</li><li>Kilburg-Basnyat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+Pro-Resolving+Lipid+Mediators+Regulate+Ozone-Induced+Pulmonary+and+Systemic+Inflammation.">Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation.</a> Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).</li><li>Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ozone+on+immune+function.">The effects of ozone on immune function.</a> Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+In+Vitro+Culture+of+Murine+and+Human+Alveolar+Macrophages.">Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+SR-BI+mediates+efferocytosis+via+Src/PI3K/Rac1+signaling+and+reduces+atherosclerotic+lesion+necrosis.">Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis.</a> Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).</li><li>Coe, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+is+a+negative+regulator+of+prenatal+and+postnatal+erythropoiesis.">FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).</li><li>Yong, W. K., Abd Malek, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthohumol+induces+growth+inhibition+and+apoptosis+in+ca+ski+human+cervical+cancer+cells.">Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).</li><li>Van de Laar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+Sac+Macrophages,+Fetal+Liver,+and+Adult+Monocytes+Can+Colonize+an+Empty+Niche+and+Develop+into+Functional+Tissue-Resident+Macrophages.">Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages.</a> Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+resident+liver+macrophages+display+unique+transcriptomic+signatures+but+similar+biological+functions.">Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions.</a> Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. , (2019).</li><li>Crowther, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+surfactant+protein+a+inhibits+macrophage+reactive+oxygen+intermediate+production+in+response+to+stimuli+by+reducing+NADPH+oxidase+activity.">Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity.</a> Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).</li><li>Silveyra, P., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variant+associations+of+human+SP-A+and+SP-D+with+acute+and+chronic+lung+injury.">Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).</li><li>Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+protein+A+enhances+alveolar+macrophage+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils.">Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils.</a> Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).</li><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Nebbioso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+analysis+of+DNA-protein+interactions+in+living+cells+by+UV+laser+pulses.">Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).</li><li>Novak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+different+UV-emitting+light+sources+in+the+induction+of+T-cell+apoptosis.">Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis.</a> Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).</li><li>Park, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAI-1+inhibits+neutrophil+efferocytosis.">PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).</li><li>Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+ozone-induced+lung+hyperpermeability:+role+of+toll-like+receptor+4.">Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).</li><li>Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variability+in+the+development+of+pulmonary+tolerance+to+inhaled+pollutants+in+inbred+mice.">Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).</li></ol>

Efferocytosis er en anti-inflammatorisk prosess der makrofager Clear apoptotisk celler og rusk samt produsere flere anti-inflammatorisk meglere9,10,11,12,16 ,18. Flere modeller av efferocytosis har gitt innsikt i hvordan macrophage er en kritisk celle i oppløsningen av betennelse6,<sup cla...

Lunge er stadig utsatt for miljømessige fornærmelser, inkludert luft partikler, virus, bakterier, og oksiderende gasser som utløser lungebetennelse1,2,3. Disse fornærmelser kan kompromittere gassutveksling og indusere irreversible vevsskade4,5. Alveolære makrofager, som utgjør ca 95% av immunceller funnet i murine og menneskelige lunger ved homeostase, er kritiske regulatorer av lungebetennelse etter miljømessige fornærmelser1,2, 3,4,5. Alveolære makrofager er avgjørende i verts forsvaret ved å phagocytizing og eliminere patogener. Nylig, alveolære makrofager har vist å fremme vev homeostase og oppløsningen av betennelse gjennom efferocytosis6,7. Efferocytosis er en phagocytic prosess der makrofager sluker og eliminere apoptotisk celler8,9,10. Efferocytosis også resulterer i produksjon av meglere (dvs. Il-10, TGF-β, PGE2, og nitrogenoksid) som ytterligere utfylle prosessen, noe som resulterer i oppløsningen av betennelse9,10,11 ,12,16,18. Denne prosessen er nødvendig for å forebygge sekundær nekrose og fremme vev homeostase12,13,14. Flere studier har knyttet svekket efferocytosis med ulike kroniske lungesykdommer, inkludert astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, og idiopatisk pulmonal fibrose8,9,15, 16,17.
O3 er et kriterium luft forurensende som forverrer og øker forekomsten av kroniske lungesykdommer19,20,21. O3 induserer lungebetennelse og skade og er kjent for å svekke alveolære macrophage fagocytose av bakterielle patogener22,23. Det er imidlertid ukjent om O3 svekker alveolære macrophage efferocytosis. Gransker O3-indusert endringer i alveolære macrophage efferocytosis vil gi potensiell innsikt i hvordan eksponering kan føre til kroniske lungesykdom forekomst og forverring. Beskrevet nedenfor er en enkel metode for å evaluere alveolære macrophage efferocytosis i lungene av kvinnelige mus etter akutt O3 eksponering.
Den skisserte metoden disponerer flere fordeler fremfor andre efferocytosis protokoller som vanligvis brukes i feltet ved å eliminere bruken av kostbare fluorescerende fargestoffer, omfattende strømnings flowcytometri målinger og ex vivo-manipulering av alveolære makrofager24 ,25. I tillegg denne protokollen tiltak alveolære macrophage efferocytosis i sammenheng med lunge mikromiljøet, som kan påvirke macrophage funksjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4830-250-K&#160;</td>
			<td>The TACS&#160;Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2 Jurkat T Cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2899</td>
			<td>The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff&#160; Reagent 2, Eosin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990706</td>
			<td>Eosin staining that stains cytoplasm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 1, Fixative</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990705</td>
			<td>Fixes cells to be stained by H&#38;E.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990707</td>
			<td>Methylene Blue staining that stains the nucleus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td>RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker</td>
			<td>Cambridge Scientific&#160;</td>
			<td>16659</td>
			<td>The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T400 ultraviolet light photometer&#160;</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T400</td>
			<td>The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T703 Ozone calibrator</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T703</td>
			<td>Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure

Ozon (O3) er et kriterium luft forurensende som forverrer og øker forekomsten av kroniske lungesykdommer. O3 eksponering er kjent for å indusere lungebetennelse, men lite er kjent om hvordan eksponeringen endrer prosesser viktig for oppløsningen av betennelse. Efferocytosis er en oppløsning prosess, der makrofager phagocytize apoptotisk celler. Formålet med denne protokollen er å måle alveolære macrophage efferocytosis etter O3-indusert lungeskade og betennelse. Flere metoder har blitt beskrevet for å måle efferocytosis; men de fleste krever ex vivo manipulasjoner. Beskrevet i detalj her er en protokoll for å måle in vivo alveolære macrophage efferocytosis 24 timer etter O3 eksponering, noe som unngår ex vivo manipulering av makrofager og fungerer som en enkel teknikk som kan brukes til å nøyaktig representere forstyrrelser i Denne løsningsprosessen. Protokollen er en teknisk ikke-intensiv og relativt rimelig metode som involverer hele kroppen O3 inhalasjon etterfulgt av orofaryngeal aspirasjon av apoptotisk celler (dvs. Jurkat T celler) mens under narkose. Alveolære macrophage efferocytosis måles deretter ved lys mikroskopi evaluering av makrofager som er samlet inn fra lunges (BAL-tømming). Efferocytosis måles til slutt ved å beregne en efferocytic indeks. Kollektivt, de skisserte metodene kvantifisere efferocytic aktivitet i lungene in vivo samtidig tjene til å analysere negative helseeffekter av O3 eller andre inhalert fornærmelser.

O3 eksponering er kjent for å indusere lungebetennelse og skade, og efferocytosis er nødvendig for å opprettholde vev homeostase. C57BL/6J kvinnelige mus ble utsatt for filtrert luft (FA) eller 1 ppm O3 for 3 h og obduksjon 24 h post-eksponering for å undersøke lungebetennelse og skade. O3-eksponert mus vist en betydelig økning i makrofager og nøytrofile i luftrom i forhold til FA kontrollgruppen (figur 1a, B</s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å avgjøre om eksponering for ozon, et kriterium luftforurensning, svekker alveolære macrophage efferocytosis in vivo. Denne protokollen benytter ofte brukte reagenser og teknikker og kan tilpasses flere modeller av lungeskade for å bestemme effekter på alveolære macrophage efferocytosis.

I vivo vurdering av Alveolære macrophage Efferocytosis etter ozon eksponering

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Protokollen som er beskrevet her måler lungemakrofag efferocytose etter eksponering for et kriterium luftforurensende ozon. Disse dataene indikerer at ozoneksponering reduserer alveolær makrofag efferocytose og dermed kan være en mekanisme for hvorfor forhøyede nivåer av ozon øker forekomsten av lungesykdommer. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater en in vivo vurdering av alveolær makrofag efferocytose uten noen ex vivo manipulasjoner av makrofagene som kan endre deres fenotype eller funksjon.Denne teknikken har avdekket en ny mekanisme der lungene ikke kan reparere seg selv etter eksponering for luftforurensning. I tillegg kan denne teknikken avsløre nye veier til mål som endrer efferocytose i lungene. Denne metoden kan brukes på en hvilken som helst modell av lungeskade eller betennelse.Brukeren må imidlertid optimalisere når det er best å vurdere efferocytose etter lungeskade. Å utføre orofaryngeal aspirasjon kan være teknisk utfordrende. Jeg vil råde til å jobbe med veterinærstaben for å sikre at du har optimalisert teknikken din for å utføre denne prosedyren.Begynn med å dyrke Jurkat T-celler i basalcellekulturmediet supplert i henhold til manuskriptets retninger ved 37 grader Celsius og 5%karbondioksid. Jurkat T-celler er en suspensjoncellelinje som kan opprettholdes gjennom passaging til pre-varmet kulterende medier hver tredje dag. Forbered apoptotiske celler ved å vokse dem til 90% samløpet som tar tre til fire dager etter passaging.Vokse celler i fem T75 flasker for å få et tilstrekkelig antall celler for denne protokollen. Når cellene er klare, aspirerer kolbeinnholdet ca 24 milliliter og overfører dem til et 50 milliliter konisk rør. Telle cellene ved hjelp av Trypan Blå flekker og et hemocytometer.Pellet cellene ved sentrifugering på 271 ganger g i fem minutter og kast supernatanten. Deretter bruker cellene i media på å få tre millioner celler per milliliter. Aliquot cellene i 100 av 20 millimeter vev kultur retter ved å overføre fem milliliter celler per tallerken.Forbered omtrent ni kulturretter. Sett en tallerken til side som en ueksponert kontroll og utsett de resterende rettene for UV. Sett UV-krysskoblingen til riktig energinivå ved å trykke på energiknappen og angi 600 med nummernummeret. Bestråle alle retter med cellene, bortsett fra kontrollen, og sørg for å fjerne toppdekselet på vevskulturfatet under UV-eksponering.Deretter inkubere alle rettene i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i fire timer. Etter inkubasjonen, kombinere alle bestrålte celler i en 50 milliliter konisk rør og pellet dem ved sentrifugering på 271 ganger g i fem minutter. Kast de overnaturante og resuspend cellene i 24 milliliter steril PBS.Sentrifuger røret igjen og fjern supernatanten. Forbered cellene for å kaste mus ved å gjenopplive dem i PBS ved riktig konsentrasjon. Når musen er riktig bedøvet, plasser den i en semi-liggende liggende liggende stilling.Bruk kirurgisk streng bundet mellom plugger på et skråstilt akrylplate for å suspendere musen ved de maksillære fortærene. Bruk et par stumpe, ikke-rillede tang til å gripe lett og trekke musetungen og innpode de apoptotiske cellene i munnhulen med en P200-pipette. Dosering er vellykket når mus lager en knitrende støy ett til to sekunder etter å ha mottatt dosen.Med en hanskefinger dekker du forsiktig nesen på musen til den inhalerer mens tungen trekkes tilbake. Hold nesen dekket til ingen væske er synlig i munnhulen og musen har tatt to eller flere innåndinger. Fjern musen fra inokulasjonsbrettet og returner den til buret for å tillate det å gjenopprette fra anestesi, og sørg for å plassere musen på ryggen for å forhindre rusk fra å blokkere narene.Etter at alle musene har våknet fra anestesi, vent 90 minutter for å tillate alveoliske makrofager å sluke tilstrømningen av apoptotiske celler. For å samle toalettvæske, forberede euthanized musen i henhold til manuskriptet retninger. Skyv PBS langsomt inn i lungene slik at de kan blåses opp, og trekk deretter det samme volumet ut igjen og pass på at PBS ikke går ut av neseborene.Samle den samlede lavage fra hver mus i en 15 milliliter tube. Sentrifuge bronkoalveolar lavage eller BAL på 610 ganger g i seks minutter ved fire grader Celsius, samle supernatant i en 1,5 milliliter tube, og fryse den på minus 80 grader Celsius. Pellet representerer cellene fra bronkoalveolerrommet.Tilsett en milliliter ACK røde blodlegemer lysis buffer til pellet for å fjerne de gjenværende røde blodlegemer. Vortex og lyse i ett minutt på is, og legg deretter til fire milliliter PBS for å stoppe lysisreaksjonen. Sentrifuger cellene ved 610 ganger g i seks minutter ved fire grader Celsius og aspirer overnatanten med en vakuumaspirator.Deretter bruker cellene på nytt i en milliliter PBS med 10% FBS og teller cellene på et hemocytometer uten Trypan Blue. Sentrifuge 120 mikroliter av hver prøve på lysbilder på 12 ganger g i tre minutter ved hjelp av middels akselerasjon og en cytocentrifuge. La lysbildene tørke over natten.Neste dag, flekk lysbildene med hematoksylin og eosin for å beregne både efferocytic og differensialcelletellinger. Deretter viser du lysbilder under en Brightfield-innstilling på et biologisk mikroskop ved hjelp av et mål på 20X eller 40X. Beregn den efferocytiske indeksen basert på forholdet mellom alveoler makrofager som fagocytosed apoptotiske Jurkat T-celler til alveolr makrofager uten apoptotisk celleopptak, og sørg for å telle minst 200 celler fra hvert lysbilde.Denne protokollen ble brukt til å undersøke effekten av ozoneksponering på lungebetennelse. Ozoneksponerte mus viste en økning i makrofager og nøytrofiler i luftrommet sammenlignet med den filtrerte luftkontrollgruppen og hadde en økning i BAL-protein, en markør for alveolær epiteldysfunksjon. Før de tok musene ble apoptose i Jurkat T-celler bekreftet med strømningscytometri.Den 60 milli joule UV eksponeringsnivå og fire timers inkubasjonstid resulterte i repeterende resultater av ca 75% apoptotiske celler. Efferocytiske makrofager ble identifisert som makrofager som hadde oppslukt en Jurkat T-celle sammenlignet med vanlige alveoliske makrofager. Det var en signifikant reduksjon i den efferocytiske indeksen for ozon eksponert gruppe sammenlignet med de filtrerte luftkontrollene som indikerer at ozon indusert lungebetennelse er forbundet med redusert clearance av apoptotiske celler.Oppmerksomhet på detaljer og skriving av eventuelle observerte forskjeller er avgjørende under denne prosedyren. Det anbefales også å blinde prøvene for analyse og få to forskjellige personer til å telle makrofagene. Etter isolasjon kan BAL-cellene brukes til mRNA-analyse, farget for flere markører ved immunofluorescence, og / eller kjøre på et strømningscytometer for å skille fenotypiske endringer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Bruk av Fluorescent måloppstill for Vurdering av Cell Responses T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Høy gjennomstrømning Fluorometrisk Teknikk for Vurdering av Macrophage Fagocytose og Actin Polymerisering

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intramikroskopi Imaging av leveren følgende<em&gt; Leishmania</em&gt; Infeksjon: An Assessment of Lever hemodynamikken

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

I Vivo Vurdering av gnagere Plasmodium parasitemia og merozoit invasjon av flowcytometrisystemer

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flowcytometrisk analyse av partikkelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetisk rører metode for påvisning av<em&gt; trikiner</em&gt; Larver i Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Vurdering av antistoff-baserte narkotika effekter på Murine benmargen og Peritoneal Macrophage aktivisering

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...