Name: in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure
Uploaded: 2019-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

Este estudo é financiado pelo Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award e NIEHS R01ES028829 (para K. M. G). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Dianne Walters (departamento de Fisiologia, ECU) por sua assistência com a obtenção de imagens representativas de macrófagos alveolares.

Todos os métodos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade da Carolina do leste.
1. ozônio (O3) e exposições filtradas do ar (dia 1)
<ol><li>Coloque um máximo de 12 camundongos C57BL/6J fêmeas, 8-12 semanas de idade, em uma gaiola de aço (com 12 compartimentos separados) com tampas de malha de arame em uma câmara de exposição O3 .</li>
	<li>Coloque o termômetro na câmara de exposição com a gaiola para g...

<ol>
	<li>Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+macrophages+as+the+guardians+of+tissue+repair+in+the+lung.">Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung.</a> Immunology and Cell Biology. , (2019).</li><li>Gregoire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+efferocytosis+and+neutrophil+extracellular+trap+clearance+by+macrophages+in+ARDS.">Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS.</a> European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).</li><li>Fan, E. K. Y., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alveolar+macrophage+death+in+acute+lung+inflammation.">Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation.</a> Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).</li><li>Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+dying+cells+and+autoimmunity.">Clearance of dying cells and autoimmunity.</a> Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).</li><li>Bhattacharya, J., Westphalen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-epithelial+interactions+in+pulmonary+alveoli.">Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli.</a> Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).</li><li>Donnelly, L. E., Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+in+airways+disease.">Defective phagocytosis in airways disease.</a> Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).</li><li>Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+efferocytosis+by+alveolar+macrophages+in+IPF+patients.">Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients.</a> Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).</li><li>Vandivier, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibits+phagocytosis+of+apoptotic+cells+with+proinflammatory+consequences.">Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).</li><li>Grabiec, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+airway+macrophage+expression+of+the+Axl+receptor+tyrosine+kinase+is+associated+with+defective+efferocytosis+in+asthma.">Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).</li><li>Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+released+by+apoptotic+T+cells+contributes+to+an+immunosuppressive+milieu.">TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu.</a> Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).</li><li>Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiinflammatory+effects+of+CD95+ligand+(FasL)-induced+apoptosis.">Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).</li><li>O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+beta-cells+is+reduced+in+neonatal+autoimmune+diabetes-prone+rats.">Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats.</a> Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).</li><li>Shen, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineralocorticoid+Receptor+Deficiency+in+Macrophages+Inhibits+Atherosclerosis+by+Affecting+Foam+Cell+Formation+and+Efferocytosis.">Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).</li><li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation,+Tissue+Repair,+and+Tolerance+to+Infection.">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).</li><li>Hamon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bushfire+smoke+is+pro-inflammatory+and+suppresses+macrophage+phagocytic+function.">Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function.</a> Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).</li><li>Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+as+a+regulator+of+macrophage+chemokine+receptor+expression+and+polarization.">Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization.</a> European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).</li><li>Karaji, N., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+of+Pathogen-Infected+Cells.">Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).</li><li>Brouckaert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+necrotic+cells+by+macrophages+is+phosphatidylserine+dependent+and+does+not+induce+inflammatory+cytokine+production.">Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).</li><li>Gonzalez-Guevara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+ozone+induces+a+systemic+inflammatory+response:+possible+source+of+the+neurological+alterations+induced+by+this+gas.">Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas.</a> Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).</li><li>Robertson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+mediates+endothelial+dysfunction+downstream+of+circulating+factors+induced+by+O3+exposure.">CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure.</a> Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).</li><li>Kilburg-Basnyat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+Pro-Resolving+Lipid+Mediators+Regulate+Ozone-Induced+Pulmonary+and+Systemic+Inflammation.">Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation.</a> Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).</li><li>Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ozone+on+immune+function.">The effects of ozone on immune function.</a> Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+In+Vitro+Culture+of+Murine+and+Human+Alveolar+Macrophages.">Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+SR-BI+mediates+efferocytosis+via+Src/PI3K/Rac1+signaling+and+reduces+atherosclerotic+lesion+necrosis.">Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis.</a> Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).</li><li>Coe, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+is+a+negative+regulator+of+prenatal+and+postnatal+erythropoiesis.">FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).</li><li>Yong, W. K., Abd Malek, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthohumol+induces+growth+inhibition+and+apoptosis+in+ca+ski+human+cervical+cancer+cells.">Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).</li><li>Van de Laar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+Sac+Macrophages,+Fetal+Liver,+and+Adult+Monocytes+Can+Colonize+an+Empty+Niche+and+Develop+into+Functional+Tissue-Resident+Macrophages.">Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages.</a> Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+resident+liver+macrophages+display+unique+transcriptomic+signatures+but+similar+biological+functions.">Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions.</a> Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. , (2019).</li><li>Crowther, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+surfactant+protein+a+inhibits+macrophage+reactive+oxygen+intermediate+production+in+response+to+stimuli+by+reducing+NADPH+oxidase+activity.">Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity.</a> Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).</li><li>Silveyra, P., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variant+associations+of+human+SP-A+and+SP-D+with+acute+and+chronic+lung+injury.">Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).</li><li>Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+protein+A+enhances+alveolar+macrophage+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils.">Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils.</a> Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).</li><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Nebbioso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+analysis+of+DNA-protein+interactions+in+living+cells+by+UV+laser+pulses.">Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).</li><li>Novak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+different+UV-emitting+light+sources+in+the+induction+of+T-cell+apoptosis.">Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis.</a> Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).</li><li>Park, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAI-1+inhibits+neutrophil+efferocytosis.">PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).</li><li>Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+ozone-induced+lung+hyperpermeability:+role+of+toll-like+receptor+4.">Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).</li><li>Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variability+in+the+development+of+pulmonary+tolerance+to+inhaled+pollutants+in+inbred+mice.">Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).</li></ol>

A eferocitose é um processo anti-inflamatório no qual macrófagos Desobstruem células e detritos apoptóticos, bem como produzem múltiplos mediadores anti-inflamatórios9,10,11,12,16 ,18. Vários modelos de eferocitose forneceram uma visão de como o macrófago é uma célula crítica na resolução da inflamação<sup c...

O pulmão está constantemente exposto a insultos ambientais, incluindo partículas de ar, vírus, bactérias e gases oxidantes que desencadeiam a inflamaçãopulmonar 1,2,3. Esses insultos podem comprometer a troca gasosa e induzir lesão tecidual irreversível4,5. Macrófagos alveolares, queconstituem aproximadamente 95% das células imunes encontradas em pulmões murino e humano na homeostase, são reguladores críticos da inflamação pulmonar após insultos ambientais1,2, 3,4,5. Os macrófagos alveolares são essenciais durante a defesa do hospedeiro por fagocitizar e eliminar patógenos. Recentemente, os macrófagos alveolares têm demonstrado promover a homeostase tecidual e a resolução da inflamação através da efferocitose6,7. A eferocitose é um processo fagocitítico no qual os macrófagos engolem e eliminam as células apoptóticas8,9,10. A eferocitose também resulta na produção de mediadores (i.e., IL-10, TGF-β, PGE2e óxido nítrico) que aumentam ainda mais o processo, resultando na resolução da inflamação9,10,11 ,12,16,18. Esse processo é necessário para prevenir a necrose secundária e promover a homeostase tecidual12,13,14. Vários estudos têm ligado a efferocitose prejudicada com várias doenças pulmonares crônicas, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, e fibrose pulmonar idiopática8,9,15, 16,17.
O3 é um critério poluente aéreo que exacerba e aumenta a incidência de doenças pulmonares crônicas19,20,21. O3 induz inflamação e lesão pulmonar e é conhecido por prejudicar a fagocitose alveolar de macrófagos de patógenos bacterianos22,23. No entanto, não se sabe se O3 prejudica a efferocitose alveolar do macrófago. Investigar as alterações induzidas pelo3na efferocitose de macrófago alveolar fornecerá uma visão potencial de como a exposição pode levar à incidência e exacerbação da doença pulmonar crônica. Descrito abaixo é um método simples para avaliar a efferocitose alveolar de macrófago nos pulmões de camundongos fêmeas após a exposição aguda O3 .
O método delineado possui várias vantagens sobre outros protocolos de eferocitose comumente utilizados no campo, eliminando o uso de corantes fluorescentes dispendiosos, medições extensas de citometria de fluxo e manipulação ex vivo de macrófagos alveolares24 ,25. Adicionalmente, este protocolo mede a efferocitose alveolar do macrófago no contexto do microambiente do pulmão, que pode influenciar a função do macrófago.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4830-250-K&#160;</td>
			<td>The TACS&#160;Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2 Jurkat T Cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2899</td>
			<td>The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff&#160; Reagent 2, Eosin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990706</td>
			<td>Eosin staining that stains cytoplasm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 1, Fixative</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990705</td>
			<td>Fixes cells to be stained by H&#38;E.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990707</td>
			<td>Methylene Blue staining that stains the nucleus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td>RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker</td>
			<td>Cambridge Scientific&#160;</td>
			<td>16659</td>
			<td>The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T400 ultraviolet light photometer&#160;</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T400</td>
			<td>The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T703 Ozone calibrator</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T703</td>
			<td>Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure

O ozônio (O3) é um critério poluente aéreo que exacerba e aumenta a incidência de doenças pulmonares crônicas. O3 exposição é conhecida por induzir a inflamação pulmonar, mas pouco se sabe sobre como a exposição altera os processos importantes para a resolução da inflamação. A eferocitose é um processo de resolução, pelo qual os macrófagos fagocitizam células apoptóticas. A finalidade deste protocolo é medir o macrófagos alveolar do macrófago que segue ferimento e inflamação do pulmão de O3-induced. Vários métodos foram descritos para medir a eferocitose; no entanto, a maioria exige manipulações ex vivo. Descrito em detalhes aqui é um protocolo para medir a efferocitose alveolar in vivo do macrófago 24 h após a exposição O3 , que evita a manipulação ex vivo de macrófagos e serve como uma técnica simples que pode ser usada para representar com precisão as perturbações em Este processo de resolução. O protocolo é um método tecnicamente não intensivo e relativamente barato que envolve O corpo inteiro O3 inalação seguido por aspiração orofaríngea de células apoptóticas (i.e., células de Jurkat T) enquanto anestesia geral. A efferocitose do macrófago alveolar é então medida pela avaliação da microscopia de luz dos macrófagos coletados do lavado broncoalveolar (BAL). A eferocitose é finalmente medida calculando-se um índice eferocítico. Coletivamente, os métodos delineados quantificam a atividade efferocítica no pulmão in vivo ao mesmo tempo que servem para analisar os efeitos negativos da saúde de O3 ou outros insultos inalados.

O3 a exposição é conhecida por induzir inflamação e lesão pulmonar, e a eferocitose é necessária para manter a homeostase tecidual. Camundongos fêmeas C57BL/6J foram expostos ao ar filtrado (FA) ou 1 ppm O3 para 3 h e necropsiados 24 h pós-exposição para examinar a inflamação e lesão pulmonar. O camundongos expostos a3exibiu um aumento significativo nos macrófagos e neutrófilos no espaço aéreo em relação ao grupo controle FA (<strong c...

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In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Este manuscrito descreve um protocolo para determinar se a exposição ao ozônio, um critério poluente aéreo, prejudica a efferocitose alveolar do macrófago in vivo. Este protocolo utiliza reagentes e técnicas comumente usados e pode ser adaptado a vários modelos de lesão pulmonar para determinar os efeitos sobre a efferocitose do macrófago alveolar.

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

O protocolo aqui descrito mede a eferócitose do macrófago pulmonar após a exposição a um critério de ozônio poluente atmosférico. Esses dados indicam que a exposição ao ozônio diminui a eferócitose do macrófago alveolar e, portanto, pode ser um mecanismo para que os níveis elevados de ozônio aumentem a incidência de doenças pulmonares. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma avaliação in vivo da eferócitose do macrófago alveolar sem qualquer manipulação ex vivo dos macrófagos que possam alterar seu fenótipo ou função.Esta técnica revelou um novo mecanismo pelo qual o pulmão não pode se reparar após a exposição à poluição do ar. Além disso, essa técnica pode revelar novos caminhos para alvos que alteram a eferocisose no pulmão. Este método pode ser aplicado a qualquer modelo de lesão pulmonar ou inflamação.No entanto, o usuário precisará otimizar quando for melhor avaliar a eferocitose após lesão pulmonar. Realizar a aspiração orofaríngea pode ser tecnicamente desafiador. Eu aconselharia trabalhar com sua equipe veterinária para ter certeza de que você otimize sua técnica para realizar este procedimento.Comece por cultivar células Jurkat T em cultura celular basal meio complementado de acordo com as direções do manuscrito a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. As células Jurkat T são uma linha de célula suspensa que pode ser mantida através da passagem para a mídia de cultivo pré-aquecida a cada três dias. Prepare as células apoptóticas, aumentando-as para 90% de confluência, o que leva de três a quatro dias após a passagem.Cultivar células em cinco frascos T75 para obter um número suficiente de células para este protocolo. Uma vez que as células estejam prontas, aspire o conteúdo do frasco em cerca de 24 mililitros e transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros. Conte as células usando manchas trypan blue e um hemócito.Pelotar as células por centrifugação a 271 vezes g por cinco minutos e descartar o supernasce. Então, resuspende as células na mídia para obter três milhões de células por mililitro. Alíquotar as células em 100 por 20 milímetros pratos de cultura tecidual transferindo cinco mililitros de células por prato.Prepare aproximadamente nove pratos de cultura. Coloque um prato de lado como um controle não exposto e exponha os pratos restantes ao UV. Defina o crosslinker UV para o nível de energia correto pressionando o botão de energia e digitando 600 com a almofada numégrafa. Irradie todos os pratos com as células, exceto o controle, certificando-se de remover a tampa superior do prato de cultura tecidual durante a exposição uv.Em seguida, incubar todos os pratos em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas. Após a incubação, misture todas as células irradiadas em um tubo cônico de 50 mililitros e pelota-as por centrifugação a 271 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células em 24 mililitros de PBS estéreis.Centrifugar o tubo novamente e remover o supernaspeso. Prepare as células para dosagem de camundongos, reutilizando-as na PBS na concentração apropriada. Uma vez que o mouse esteja devidamente anestesiado, coloque-o em uma posição supina semi-reclinável.Use corda cirúrgica amarrada entre pinos em uma placa de acrílico inclinada para suspender o rato pelos incisivos maxilares. Use um par de fórceps sem cristais para agarrar levemente e puxar a língua do rato e incutir as células apoptóticas na cavidade oral com uma pipeta P200. A dosagem é bem sucedida quando os ratos fazem um barulho de estalo de um a dois segundos depois de receber a dose.Com um dedo enluvado, cubra delicadamente o nariz do mouse até que inale enquanto a língua estiver retraída. Mantenha o nariz coberto até que nenhum líquido seja visível na cavidade oral e o rato tenha tomado duas ou mais inalações. Remova o rato da placa de inoculação e devolva-o à gaiola para permitir que ele se recupere da anestesia, certificando-se de colocar o rato nas costas para evitar que os detritos bloqueiem as nares.Depois de todos os camundongos terem acordado da anestesia, espere 90 minutos para permitir que macrófagos alveolares engulam o fluxo de células apoptóticas. Para coletar fluido de lavage, prepare o rato eutanizado de acordo com as instruções do manuscrito. Empurre lentamente o PBS para os pulmões permitindo que eles inflem, em seguida, puxe o mesmo volume de volta certificando-se de que o PBS não está saindo das narinas.Colete o lavage agrupado de cada rato em um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a lavagem broncoalveolar ou BAL a 610 vezes g por seis minutos a quatro graus Celsius, coletar o supernatante em um tubo de 1,5 mililitro, e congelá-lo a menos 80 graus Celsius. A pelota representa as células do espaço broncoalveolar.Adicione um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos ACK à pelota para remover os glóbulos vermelhos residuais. Vórtice e lise por um minuto no gelo, em seguida, adicione quatro mililitros de PBS para parar a reação de lise. Centrifugar as células a 610 vezes g por seis minutos a quatro graus Celsius e aspirar o supernaente com um aspirador de vácuo.Em seguida, resuspende as células em um mililitro de PBS com 10% de FBS e conte as células em um hemótmetro sem Trypan Blue. Centrifugar 120 microliters de cada amostra em slides a 12 vezes g por três minutos usando aceleração média e um cytocentrifuge. Deixe os slides secarem durante a noite.No dia seguinte, manche os slides com hematoxilina e eosina, a fim de calcular tanto a contagem de células eferocíticas quanto diferenciais. Em seguida, veja slides sob uma configuração Brightfield em um microscópio biológico usando um objetivo 20X ou 40X. Calcule o índice eferocítico com base na razão de macrófagos alveolares que phagocytosed células Jurkat T apoptóticas para macrófagos alveolares sem absorção celular apoptótica certificando-se de contar pelo menos 200 células de cada slide.Este protocolo foi usado para investigar o efeito da exposição ao ozônio na inflamação pulmonar. Os camundongos expostos ao ozônio apresentaram um aumento de macrófagos e neutrófilos no espaço aéreo em comparação com o grupo de controle de ar filtrado e tiveram um aumento na proteína BAL, um marcador de disfunção epitelial alveolar. Antes da dosagem dos camundongos, a apoptose nas células Jurkat T foi confirmada com citometria de fluxo.O nível de exposição UV de 60 mili joule e o tempo de incubação de quatro horas resultaram em resultados repetitivos de aproximadamente 75% das células apoptóticas. Macrófagos eferóticos foram identificados como macrófagos que haviam engolido uma célula Jurkat T em comparação com macrófagos alveolares regulares. Houve uma diminuição significativa no índice eferocítico do grupo exposto ao ozônio em comparação com os controles de ar filtrados, o que indica que a inflamação pulmonar induzida pelo ozônio está associada à diminuição do despejo de células apoptóticas.Atenção aos detalhes e a anotação de quaisquer diferenças observadas é fundamental durante este procedimento. Também é recomendado cegar as amostras para análise e ter duas pessoas diferentes que contam os macrófagos. Após o isolamento, as células BAL podem ser usadas para análise de mRNA, manchadas para marcadores adicionais por imunofluorescência e/ou executadas em um citômetro de fluxo para distinguir alterações fenotípicas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Imunologia e Infecção

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Método agitador magnético para Detecção de<em&gt; Trichinella</em&gt; As larvas em amostras de músculo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...