Name: hemogenic reprogramming of human fibroblasts by enforced expression of transcription factors
Uploaded: 2019-11-04T13:00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors at JoVE.com

ويعترف بالدعم المالي السخي لمؤسسه كنوت واليس فالينبرغ ، وكليه الطب في جامعه لوند ومنطقه سكاين. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من يول انجكفيستس ستيفتيلسي (194-0694 إلى فيليبي بيريرا) ومنح دراسية للدكتوراه من Fundação الفقرة a Ciência e Tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 إلى فيليبي بيريرا ، و SFRH/BD/135725/2018 و SFRH/BD/51968/2012 إلى ريتا ألفيس و اندرييا غوميز). وقد دعمت هذه الدراسة أيضا بأموال من المعاهد القومية للصحة ونظام NYSTEM (1R01HL119404 و C32597GG إلى Kateri A. مور).

<ol>
	<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+potent+human+hematopoietic+stem+cells+first+emerge+in+the+intraembryonic+aorta-gonad-mesonephros+region.">Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).</li><li>Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., P&#233;ault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+human+hematopoiesis.">Embryonic origin of human hematopoiesis.</a> International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).</li><li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system:+advances+and+questions.">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138, 1017-1031 (2011).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell.">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).</li><li>Vo, L., Daley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+generation+of+HSCs+from+somatic+and+pluripotent+stem+cell+sources.">De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources.</a> Blood. 125, 2641-2648 (2015).</li><li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition.">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121, 770-781 (2013).</li><li>Ebina, W., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+reprogramming+toward+hematopoietic+stem+cells.">Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells.</a> EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+Hemogenic+Program+in+Mouse+Fibroblasts.">Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+Reprogramming+In+vitro+Informs+In+Vivo+Identification+of+Hemogenic+Precursors+to+Definitive+Hematopoietic+Stem+Cells.">Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Single+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+Capable+of+Long-Term+Multilineage+Engraftment.">Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment.</a> Science. 333, 218-221 (2011).</li><li>Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., P&#233;ault, B., Tavian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+(CD143)+specifies+emerging+lympho-hematopoietic+progenitors+in+the+human+embryo.">Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo.</a> Blood. 119, 3712-3724 (2012).</li><li>Gomes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Transcription+Factor+Induction+Mediates+Hemogenic+Reprogramming.">Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming.</a> Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).</li><li>Karlsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+The+Tetraspanin+CD9+Affords+High-Purity+Capture+of+All+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells.">Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Reports. 4, 642-648 (2013).</li><li>Leung, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetraspanin+CD9+regulates+migration,+adhesion,+and+homing+of+human+cord+blood+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 117, 1840-1851 (2011).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency.">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).</li><li>Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors.">Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).</li><li>Suzuki, Y. S., Suzuki, Y., Ke, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulatable+Lentiviral+Vector+System.">Gene Regulatable Lentiviral Vector System.</a> Viral Gene Therapy. , (2011).</li><li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors.">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157, 549-564 (2014).</li><li>Lis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+endothelium+to+immunocompetent+haematopoietic+stem+cells.">Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells.</a> Nature. 545, 439-445 (2017).</li><li>Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+blood+to+blood&#8217;:+de-differentiation+of+hematopoietic+progenitors+to+stem+cells.">From blood to blood&#8217;: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells.</a> EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Signatures+of+Tissue-Specific+Microvascular+Endothelial+Cell+Heterogeneity+in+Organ+Maintenance+and+Regeneration.">Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration.</a> Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Murine+Fibroblasts+to+Hematopoietic+Progenitor+Cells.">Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells.</a> Cell Reports. 9, 1871 (2014).</li><li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mouse+fibroblasts+into+engraftable+myeloerythroid+and+lymphoid+progenitors.">Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors.</a> Nature Communications. 7, 1-15 (2016).</li></ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

في هذه المقالة ، يتم وصف أسلوب لتوليد خلايا السلف التي تكون الدم مباشره من الورم الليفي البشري ، والتي تذهب من خلال خليه HP المتوسطة ، المثل لنهائي HSCs14.
بركه-إنتاج الجزيئات لينتيفيرال ترميز GATA2 ، GFI1B و FOS كان يفضل علي الإنتاج الفردي ، لأنه في ايدينا انه يؤدي إلى زيادة كفاءه أعاده برمجه (البيانات غير المنشورة). لينتيفيروسيس, كاعضاء من ال [ رتروفيريد ] أسره, عاده احتويت اثنان نسخ من ايجابيه [ان-رفرد] [رنا]19. قد تكون زيادة كفاءه أعاده برمجه بسبب التعبئة والتغليف من اثنين من الجينات المختلفة في نفس الجسيمات لينتيفيرال ، مما ادي إلى زيادة عدد الخلايا المشتركة محوله مع عوامل النسخ الثلاثة. لضمان نجاح هذا البروتوكول ، فمن الضروري ان transduce مع كميه كافيه من الفيروس اعتمادا علي مرور الخلية للحصول علي التوازن الأمثل بين أعاده برمجه الكفاءة وسلامه الخلية ، علي النحو الموصي به في الخطوة 4.6. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام الفيروسات الطازجة غير المركزة. فمن المستحسن ان transduce الخلايا مع 0.5-3 مل من تجمع 3TFs و M2rtTA. أيضا ، يجب تعديل كثافة الخلايا وفقا للتطبيق. 150 000 HDFs لكل لوحه 6-بئر (الخطوة 4.4) توفير الكثافة المثلي لأداء FACS ، وزرع وتحليل تدفق الخلايا الخلوية للخلايا المعاد برمجتها. بالنسبة لتجارب الرقاقات المتسلسلة ، كانت هناك حاجه إلى المزيد من الخلايا من البداية (الخطوة 5.1). من المهم التحقق من الخلايا بانتظام للتغييرات المورفولوجية واستبدال المتوسطة التي تكون الدم مرتين في الأسبوع لدعم ظهور الخلايا التي يسببها الدم. أضافه السايتوكينات التي تكون الدم أو الثقافة المشتركة في طبقات التغذية قد تزيد من كفاءه أعاده برمجه.
مع هذه الطريقة ، يمكننا تحديد علامات جديده للدم التي يتم التعبير عنها بشكل حيوي اثناء أعاده برمجه الأرقاء. ويعبر عن CD9 ، الذي ثبت انه منظم في الخلايا المعاد برمجتها في المستوي العابر14، بسرعة علي سطح الخلية في المراحل الاوليه لأعاده البرمجة مع CD49F و CD143 ، بمثابه علامة جديده لسلائف HSC الإنسان. ونحن نظهر أيضا ان ITGA6 والاس هي الأهداف المباشرة لGATA2 خلال المراحل الاوليه من أعاده برمجه الأرقاء ، بالاضافه إلى CD9 و CD3414، وتوفير صله ميكانيكيه مباشره بين الأرقاء الإنسان النمط الظاهري السلائف و GATA2.
ميزه واحده من هذا النظام تكمن في استخدام ثقافات الخلايا الليفية متجانسة نسبيا. في حين يتم توسيع pscs بسهوله والحفاظ عليها في المختبر, بروتوكولات التمايز توليد السكان غير المتجانسة التي تشمل السلف التي تكون الدم, التي الطعم سيئه5,6,7. وعلاوة علي ذلك ، هناك خطر الاصابه بالأورام عند زرع HSPCs المشتقة من PSC ، لان PSCs غير المتمايزة قد لا تزال في الثقافة حتى بعد استخدام بروتوكولات التمايز. بدلا من ذلك إلى الخلايا الليفية ، وقد تم تطبيق أعاده البرمجة المباشرة إلى HSCs إلى الدم الملتزمين الأسلاف20 والخلية البطانية21. ومع ذلك ، بدءا من خلايا السلف المقيدة بالدم يعوق التطبيق العلاجي لل hscs الناتجة إذا كان المريض يحمل الطفرات التي تؤثر علي الجذعية/سلف السكان الذين تكون الدمه22. في حاله الخلايا البطانية ، وهذه هي أكثر صعوبة في الحصول علي مقارنه الليفية ، وتشكل الخلايا غير المتجانسة للغاية من حيث النمط الظاهري ، وظيفة وهيكل ، والتي تعتمد علي الجهاز23. وقد نجحت الدراسات الأخرى في أعاده برمجه الخلايا الليفية الماوس إلى أسلاف الدم الغذائية24,25 حتى الآن, حتى الآن, لا يوجد بروتوكول آخر يصف جيل من hspc مثل الخلية من الانسجه الليفية البشرية.
هذا النهج ، إلى جانب تثبيط الدوائية ، والجينات الخروج ، أو إسقاط التصاريح لتحديد الفرد أو مجموعه من العوامل المطلوبة للحث مباشره HSCs الإنسان. توظيف منهجيات الفحص عاليه الكفاءة استنادا إلى الاخيره تقنيات CRISPR-كاس 9 في HDFs قبل أعاده برمجه ، ويمثل مسعى مثيره لتعريف منظمي الرواية من الإنسان نهائي الدم. في المستقبل ، وأعاده برمجه أنواع الخلايا البشرية غير المرتبطة بالدم مثل الخلايا الليفية ستكون بمثابه منصة لتوليد صحية المريض المعدة للخلايا السلف الدم للتطبيقات السريرية.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.
The second author affiliation was&#160;updated from:
2Wallenberg Center for Molecular, Lund University
to:
2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.

Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

الجذعية الدموية النهائية والخلايا سلف (hspcs) تظهر في الشريان الابهر-gonad-ميسونيفروس (AGM) والمشيمة من السلائف البطانية مع القدرة علي الأرقاء ، من خلال الانتقال من البطانة إلى الدم (eht)1، 2- السلائف الأرقاء (HPs) تعبر عن كل من علامات البطانة والدم ، ولكن تحديدها الدقيق لا يزال بعيد المنال ، وخاصه في النظام البشري. علي الرغم من كونها عمليه المحفوظة نسبيا في الثدييات ، الخلايا الجذعية التي تكون الدم (HSC) التنمية لا يزال يختلف بشكل كبير بين البشر ونماذج الفئران3،4. لذلك ، في المختبر النهج لتلخيص التنمية HSC البشرية مطلوبه.
التمايز من الخلايا الجذعية مستحث (PSCs) إلى HSCs ، علي الرغم من انها واعده ، وقد حققت نجاحا محدودا علي مدي السنوات ال 20 الماضية ، ويرجع ذلك في معظمه إلى بروتوكولات التمايز المتاحة ، والتي تؤدي إلى الأسلاف البدائية الدم مع الفقراء المطعمة القدرة5،6،7. بدلا من ذلك ، تم تطبيق منهجيات أعاده برمجه الخلايا المباشرة لتوليد خلايا شبيهه ب hspc من أنواع خلايا متعددة ، باستخدام عوامل النسخ (TFs)8،9. علي وجه الخصوص ، والإفراط في التعبير عن ثلاثه TFs ، Gata2 ، Gfi1b و cFos ، تحويل الخلايا الليفية الجنينية الماوس إلى HSPCs من خلال HP المتوسطة مع النمط الظاهري المحدد (Prom1 + Sca-1 + CD34 + CD45-)10. تشبه هذه العملية EHT التي تحدث في الجنين والمشيمة ، خلال تحديد الدم النهائي. هذا النمط الظاهري مكن تحديد وعزل السكان من HPs في المشيمة الماوس انه بعد الثقافة قصيرة الأجل والشق التنشيط ولدت بشكل متسلسل Hps11.
حتى الآن ، لم يتم إنشاء النمط الظاهري الذي يميز HSCs البشرية من السلائف الخاصة بهم ، ولكن من المعروف ان بعض الجزيئات التي أعرب عنها في HSCs الناشئة. انتيفين الفا 6 (ITGA6 أو CD49f) هو التعبير عنه بشكل كبير في المدى الطويل أعاده ملء HSCs ، الخلايا في المقصورة HSC12، وانزيم التحويل انجيوتنسين (ACE أو CD143) موجود في CD34 السلائف المكونة للدم السلبية في الانسجه الجنينية التي تشكل الدم13.
في الاونه الاخيره ، وقد أظهرنا ان الإصدارات البشرية من ثلاثه TFs ، GATA2 ، فوس و GFI1B أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية البشرية (hdfs) في hps مع القدرة علي المدى القصير14. في المراحل الاوليه من أعاده برمجه ، GATA2 يشرك الكروماتين المفتوحة والمجندين GFI1B و FOS لقمع الخلايا الليفية وتنشيط الجينات البطانية والدم. الخلايا المستحثة للغاية وأعرب CD49f و ACE ، والتي تحتوي علي نسبه مئوية صغيره من الخلايا التعبير عن علامة HSPC CD34. وقد تبين ان الجين CD9 ، الذي يعبر عنه في15 hscs وهو مهم بالنسبة لموجه HSC16، ان يكون هدفا مباشرا لGATA2 وبين الجينات الأكثر تنظيما في الخلايا المعاد برمجتها14. CD9 قد تشكل بالتالي علامة اضافيه لل HPs من الإنسان نهائيا تكون الدم.
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف جيل من الخلايا مثل hspc من الورم الليفي البشري من خلال التعبير القسري من GATA2 ، GFI1B و FOS ، فضلا عن طريقه تكييفها ل الكروماتين ايمونوبريسيبيتيشن (رقاقه)-التسلسل (seq) تحليل في بداية أعاده برمجه. تم ترميز TFs في الدوكسيسيكلين (دوكس)-المحرض لينتيفيرال (فوفو-tetO) الذي يحتوي علي عنصر الاستجابة الخاصة بالاختزال (TRE) ومروج CMV الحد الأدنى ، وكانت محوله مع ناقل التاسيسيه التي تحتوي علي الاتجاه المعاكس البروتين المتحول (pFUW-M2rtTA). عندما يتم أضافه دوكس (التناظرية من التالتيتير) بعد المحولة ، فانه يربط إلى البروتين rtTA الذي يتفاعل مع TRE السماح TF النسخ (نظام Tet علي). يتطلب الاجراء 25 يوما لإكمال. لتجارب رقاقه التسلسل ، تم محوله HDFs مع إصدارات الموسومة من GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) و GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B) ، بالاضافه إلى pFUW-تيالي-فوس و TF ربط المواقع تم تحليلها بعد يومين من مكملات الاكسده.
في نهاية المطاف ، وأعاده برمجه الأرقاء من الخلايا الليفية البشرية يوفر نظام عريكة في المختبر لدراسة أليات الكامنة وراء النمو البشري الدم ومصدرا محتملا من HSPCs المريض محدده للتطبيق السريري في المستقبل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#430625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>#343518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#14280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC903096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1X) no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate (DOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#25-0495-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUW-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from Porcine Skin Type A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematopoietic medium, MyeloCult H5100</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#05150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Fibroblasts (HDFs)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>#2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution (Pen/Strep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SH30256.01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>#312105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-FOS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-GATA2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-GFI1B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV-tetO-HA-GFI1B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic reprogramming of human fibroblasts by enforced expression of transcription factors

وتظل أليات الخلوية والجزيئية التي تقوم عليها مواصفات الخلايا الجذعية للدم البشرية (HSCs) بعيده المنال. استراتيجيات لتلخيص ظهور HSC الإنسان في المختبر مطلوبه للتغلب علي القيود في دراسة هذه العملية التنموية المعقدة. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتوليد الجذعية التي تكون الدم والخلايا الشبيهة بالسلف من الانسجه الليفية الجلدية البشرية التي تستخدم نهج أعاده برمجه الخلية المباشرة. هذه الخلايا العابرة من خلال نوع من الخلايا الوسيطة الأرقاء ، تشبه الانتقال من البطانة إلى الدم (EHT) سمه من مواصفات HSC. تمت أعاده برمجه الخلايا الليفية للخلايا الأرقاء عن طريق محول مع GATA2 ، GFI1B وعوامل النسخ فوس. هذا المزيج من ثلاثه عوامل الناجمة عن التغييرات المورفولوجية ، والتعبير عن الأرقاء والمكونات المكونة للدم والبرامج الديناميكية EHT المحولة. الخلايا المعاد برمجتها تولد ذريه الدم وأعاده ملء الفئران نقص المناعة لمده ثلاثه أشهر. ويمكن تكييف هذا البروتوكول نحو التشريح الألى لعمليه EHT البشرية كما هو مثال هنا من خلال تحديد أهداف GATA2 خلال المراحل المبكرة من أعاده البرمجة. وهكذا ، فان أعاده برمجه الأرقاء البشرية توفر نهجا بسيطا وعريكتا لتحديد العلامات الجديدة والمنظمين لظهور HSC الإنسان. في المستقبل ، قد يؤدي الحث المخلص لمصير الأرقاء في الخلايا الليفية إلى توليد HSCs خاصه بالمريض للزرع.

ويوضح الشكل 1(ا) التمثيل التخطيطي لنهج أعاده البرمجة باستخدام hdfs. يتم الحصول علي الخلايا الليفية من مصادر تجاريه أو جمعها من المتبرعين البشريين وتوسعت في المختبر السابق لأعاده برمجه. بعد الطلاء ، يتم توصيل الخلايا مرتين مع GATA2 ، GFI1B و FOS (و M2rtTA) لينتيفيروسيس ، ودوكسيسيكلين يضاف في اليوم 0 من أعاده برمجه. في اليوم الثاني ، يتم تقسيم الخلايا وطلاءها في وسط الدم حتى اليوم 25 من الثقافة. قد يتم إنشاء الخلايا المعاد برمجتها في نقاط زمنيه مختلفه للتطبيقات متعددة بما في ذلك زرع في الفئران المناعية ، خليه واحده الحمض الريبي النيبالي-تسلسل (scRNA-seq) من السكان الخلايا المنقية (اليوم 2 غير مفروزه ، اليوم 15CD49f + CD34 و اليوم 25CD49f +CD34 + الخلايا) ، فضلا عن تحليل المجهر والتدفق الخلوي لعلامات سطح الخلية CD49F ، CD34 ، CD9 و CD143. تظهر المؤامرات الخلوية التمثيلية ~ 17 ٪ من الخلايا المعاد برمجتها التعبير عن كل من CD49f و CD9 (الشكل 1ب ، لوحه اليسار) ، بعد 25 يوما من أعاده برمجه. الغالبية العظمي من الخلايا الايجابيه المزدوجة التعبير عن CD143 (~ 86 ٪) ، والسكان الصغيرة التعبير عن CD34 (0.9 ٪) ، مما يشير إلى الاستقراء مصير الأرقاء ديناميكية. لا يتم تنشيط هذه العلامات في M2rtTA محوله HDFs مثقف لمده 25 يوما (الشكل 1ب ، لوحه اليمين). الصور المناعية تؤكد التعبير عن CD9 و CD143 في الخلايا الملتصقة والمستديرة ، المتميزة شكليا عن الأورام الليفية السلبية لهذه العلامات (الشكل 1ج). مستعمرات الأرقاء الإنسان أيضا التعبير عن CD49f و CD3414. التحليل المتسلسل لل HDFs ، اليوم 2 الخلايا غير المفروزة ، والخلايا التي تمت أعاده برمجتها المنقية في اليوم 15 (CD49f +CD34) واليوم25 (CD49f +CD34 +) تظهر زيادة تدريجيه في الCD49f والCD9 والتعبير الCD143 من اليوم 2 إلى اليوم 25. CD49f و CD9 تظهر الخلايا الموجبة أولا اثناء عمليه أعاده البرمجة ، بين اليوم 2 و 15 ، مما يشير إلى ان هذه الجزيئات قد تمثل علامات لنشاه الأرقاء البشرية المبكرة. يبدا الكشف عن CD143 في اليوم 15 و CD34 التعبير عن الخلايا التي يتم الكشف عنها فقط في وقت لاحق النقاط (اليوم 25). CD34 + واستخدمت خلايا دم الحبل السري (ucb) كمرجع (الشكل 1د).
ويصف الشكل 2(ا ) بروتوكولا معدلا لتوليد عدد كاف من الخلايا للتحليل المتسلسل بالرقاقات في المراحل الاوليه لأعاده برمجه الأرقاء (اليوم 2). أولا ، يتم طلاء HDFs في كثافة مرتين اعلي من البروتوكول القياسي (300,000 خلايا مقابل 150,000 خلايا لكل لوحه). بعد التوصيل ، يتم أعاده طلاء كل بئر في صحن 100 مم يسمح للخلايا بالتمدد لمده 6 أيام قبل تكميل الوسط مع دوكس. يتم تحليل الخلايا 2 أيام بعد أضافه الاختزال وما يترتب علي ذلك TF التعبير. يظهر الشكل 2ب الملفات الشخصية لمتصفح الجينوم لGATA2 الملزمة للمناطق التنظيمية الجينية لITGA6 والاس عندما تكون الخلايا مشتركه مع العوامل الثلاثة (3tfs) أو GATA2 بشكل فردي. GATA2 أيضا يربط ان يفتح [كروماتين] مناطق من CD9 و CD34 مورثات14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig1a.jpg"> الشكل 1: استقراء مصير الأرقاء في الخلايا الليفية الجلدية البشرية. (ا) استراتيجية تجريبية لأعاده برمجه الاصبغه الدموية البشرية الليفية الجلدية (hdfs). يتم جمع الخلايا الليفية من الخزعات لكمه الجلد من الجهات المانحة ، وتوسيع ومحوله مع GATA2 ، GFI1B ، فوس و M2rtTA لينتيفيروسيس. يتم أضافه دوكسيسيكلين (دوكس) إلى الثقافة في اليوم 0 من أعاده برمجه ويتم تحليل الخلايا في عده نقاط زمنيه حتى اليوم 25. [سكرنا-تلي], خليه وحيد [رنا]-تسلسل. FACS ، الفرز الخلية المنشطة الفلورية. (ب) استراتيجية الصب المستخدمة لتقييم التعبير عن علامات الاصبغه الدموية/التي تكون الدم عن طريق قياس التدفق الخلوي في اليوم 25 بعد التوصيل بعوامل النسخ الثلاثة (3tfs). المؤامرات الخلوية تظهر النسبة المئوية للخلايا الايجابيه المزدوجة لCD49f و CD9 ، بوابات في السكان الخلية الحية (DAPI-سلبي). ضمن السكان ايجابيه مزدوجة ، يتم عرض التعبير عن CD143 و CD34. يتم استخدام HDFs فقط مع فيروس M2rtTA تحت نفس الظروف الثقافية كعنصر تحكم. (ج) الصور المناعية لمستعمرات اليوم 25 المعاد برمجتها والتي تؤكد التعبير عن CD9 (اللوحة العليا) و CD143 (اللوحة السفلي). كانت ملطخه الخلايا مع الأجسامالمضادة (جدول المواد) المخفف 1:100 في المكتب التلفزيوني/2 ٪ مع مصل الفار ، حضن 20 دقيقه في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، غسلها ثلاث مرات والذين يعانون من الإيدز في الاذاعه التلفزيونية/2 ٪. المرحلة ، المرحلة الانحدار التباين. قضبان المقياس = 50 μm. (د) التحليل المتسلسل للخلايا التي تبلغ 253 خليه في نقاط زمنيه مختلفه. يتم تنشيط التعبير عن الITGA6 والCD9 والاس والCD34 اثناء أعاده البرمجة. يتم جمع الخلايا في اليوم الثاني (غير مفروز) ، اليوم 15 (CD49f +CD34) واليوم25 (CD49f +CD34 +). يتم استخدام الخلايا HDFs وCD34 + دم الحبل السري (34 + ucb) كمراجع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig1alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig02.jpg"> الشكل 2: توسيع الخلايا الليفية الجلدية البشرية لتحليل الرقاقات المتسلسلة. (ا) استراتيجية تجريبية تصور بروتوكولا معدلا لتوليد اعداد كبيره من الخلايا الليفية البشرية المحولة للجلد (hdfs) لرقاقه المتسلسلة في اليوم 2 من أعاده البرمجة. 300,000 يتم طلاء الخلايا في 6-حسنا لوحات ومحوله مرتين مع العوامل الفردية (pFUW-تيالي-فوس ، pLV-TETO أو pFUW--GATA2--3xFLAG) أو مزيج من العوامل الثلاثة (زائد M2rtTA). بعد أزاله الفيروسات ، يتم توسيع الخلايا الليفية لمده سته أيام في 100 مم الاطباق. يتم أضافه دوكسيسيكلين (دوكس) في اليوم 0 ويتم جمع الخلايا بعد يومين من أضافه الاختزال. (ب) ملامح متصفح الجينوم تسليط الضوء علي مواقع GATA2 (صناديق رمادية) في ITGA6 و ACE مكاني بعد يومين من المحول مع عوامل النسخ الثلاثة (3tfs) أو مع GATA2 وحدها. يتم تمثيل العدد الإجمالي للقراءة المعينة علي المحور ص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1.jpg"> الشكل التكميلي 1: تحديد حجم لينتيفيرال محسن لأعاده برمجه الأرقاء بكفاءة. وتستخدم كميات متزايدة من الجزيئات اللينتيفيراله المركزة (10 إلى 100 μL) (3TFs: GATA2, GFI1B و FOS) لنقل الخلايا الليفية الجلدية البشرية (HDFs) ، بالاضافه إلى M2rtTA بنسبه 1:1 ، بعد الخطوات 4.5 − 4-12 من البروتوكول. يتم تحليل الخلايا المعاد برمجتها في اليوم 25 لتحديد حجم الأمثل لمحوله لأعاده برمجه الأرقاء ، نظرا لنسبهCD49f +CD9 + الخلايا بوابات في الخلايا الحية (dapi-سلبي). ويمكن تقييم سلامه الخلايا عن طريق تحديد العدد المطلق للخلايا الحية في اليوم 25. يتم استخدام HDFs محوله مع M2rtTA (100 μL) كعنصر تحكم سالب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2.jpg"> الشكل التكميلي 2: التغيرات المورفولوجية اثناء أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية البشرية. الإنسان الخلايا الليفية الجلدية (HDF) الثقافات التي يتم تصويرها في اليوم من المحول الأول (يوم-2) ، عندما يتم أضافه دوكس إلى الثقافات (يوم 0) ، يومين (اليوم 2) وخمسه عشر يوما (اليوم 15) بعد مكملات الاكسده ، وعند نقطه نهاية التجربة (اليوم 25). ويسلط الضوء علي مستعمرات الأرقاء في الأيام 15 و 25. قضبان المقياس = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors at JoVE.com

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

هذا البروتوكول يدل علي التحريض من برنامج الأرقاء في الخلايا الليفية الجلدية البشرية عن طريق التعبير القسري من عوامل النسخ GATA2 ، GFI1B و FOS لتوليد الخلايا الجذعية التي تكون الدم و سلف.

الأرقاء أعاده برمجه الخلايا الليفية البشرية عن طريق التعبير القسري من عوامل النسخ

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

يساعد هذا الأسلوب على التغلب على القيود في دراسة تطور الدم البشري من خلال توفير منصة بسيطة وقابلة للمسح في المختبر على أساس إعادة برمجة الخلايا المباشرة. سوف العرض المرئي لهذه الطريقة توفير التوجيه المثالي في الخطوات الأساسية لتوليد الخلايا الهيموجينية البشرية أي أثناء إنتاج العدس، والتناقلي الخلايا الليفية والخلايا. عن طريق تحويل الخلايا الليفية الجلدية إلى السلائف الهيموجينية، ونحن نأمل في توليد الجذعية البشرية محددة المريض والخلايا السلف بأعداد كافية لزرع الخلايا الجذعية.تبدأ من خلال نمو خلايا HEK293T في 100 ملليمتر معالجة زراعة الأنسجة طبق مع 10 ملليلتر من DMEM كاملة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى التقاء. في اليوم السابق لTransfection، بعد التعرق المتوسطة، وغسل الطبق بعناية مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا مع 1.5 ملليلتر من محلول الانفصام. بعد احتضان لمدة خمس إلى 10 دقائق في 37 درجة مئوية، تعطيل الحل مع ثلاثة ملليلتر من DMEM كاملة ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.اغسل الطبق بـ 5 ملليلترات من DMEM كاملة لإزالة أي خلايا متصلة متبقية وسحب الغسيل مع محلول الخلية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وpirate المابير و resuspend بيليه في ستة ملليلتر من DMEM كاملة. ثم، تقسيم التعليق بالتساوي بين ستة 100 ملليمتر ثقافة الأنسجة الأطباق المعالجة في حجم النهائي من 10 ملليلتر من DMEM كاملة لكل طبق.في اليوم التالي، إضافة 10 ميكروغرام مجموع كتلة من البلازميدات نقل الثلاثة معا إلى أنبوب جديد مخروطي 15 ملليلتر. بعد ذلك ، إضافة 10 ميكروغرام من الجيل الثاني من ناقلات التعبئة والتغليف psPAX2 ترميز هفوة ، بول ، تات وrev الجينات تليها إضافة خمسة ميكروغرام من pMD2. G مُتجه الغلاف يُرِكّر جين VSV-G إلى الأنبوب.وأخيرا، إضافة الماء لتحقيق حجم النهائي إلى 500 ميكرولترات. في اثنين من أنابيب المخروطية 15 ملليلتر جديدة، إضافة 10 ميكروغرام من FUW-M2rtTA plasmid، 10 ميكروغرام من ناقلات التعبئة والتغليف، وخمسة ميكروغرام من متجه المغلف إلى كل أنبوب. ثم، إضافة الماء إلى حجم النهائي من 500 ميكرولترات لكل أنبوب.بعد ذلك، إضافة 62.5 ميكرولترات من اثنين من كلوريد الكالسيوم الضرس إلى كل من الأنابيب الثلاثة واستخدام وحدة تحكم ماصة مجهزة Pipette باستور لإطلاق فقاعات في كل خليط. في حين أن فقاعات تتشكل، إضافة 500 ميكرولترات من BES المخزنة سالكية قطرة ضد Pipette باستور وعلى الخليط. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى تظهر الخلطات غائمة قليلا.أثناء الحضانة، بعناية استبدال ناظر من الثقافات خلية HEK293T مع 10 ملليلتر من DMEM كاملة دون المضادات الحيوية. توزيع مجمعات الحمض النووي قطرة على الفردية HEK293T أطباق ثقافة الخلية واحتضان لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدل المُنبتات بأربعة ملليلترات من DMEM كاملة لكل ثقافة، ثم أعد الأطباق إلى حاضنة ثقافة ثاني أكسيد الكربون 5٪ خلية الكربون بين عشية وضحاها.في صباح اليوم التالي، وجمع سراويل في أنبوب واحد 50 ملليلتر في الطبق الواحد وإضافة أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى كل طبق. بعد ثماني ساعات أخرى من الثقافة، تجمع سوبرنات في كل طبق مع supernatant حصادها سابقا وإضافة أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة. العودة أطباق إلى خلية ثقافة الحاضنة بين عشية وضحاها وجمع ااثقاف مرة واحدة في نهاية المطاف.عندما تم جمع كل من الفيروس، تصفية كل عظمى العدسي الفيروسي من خلال 0.45 ميكرومتر منخفضة البروتين ملزمة فلتر في أنابيب الفردية وإضافة حد أقصى 15 ملليلتر من السوبر مصفى لوحدات تصفية الطرد المركزي الفردية للطرد المركزي. تجاهل التدفق من خلال. سيبقى فيروس العدس اللزوج الذي يحتوي على سائل في وحدة الفلتر.عندما تم تصفية كل من عظمى العدسي الفيروسية aliquot 50 إلى 200 ميكرولترات من فيروسات العدسية المركزة للتخزين البارد. قبل البدء في إجراء إعادة البرمجة، رمز ستة ثقافة الأنسجة جيدا معالجة لوحة مع 500 ميكروليترس من 0.1٪ الجيلاتين في البئر واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، التعرق الحل الجيلاتين المتبقية.لوحة الدم البشري الليفية في كثافة 1.5 مرات عشر إلى الخلايا الخامسة لكل لوحة في مليلترين من DMEM كاملة في بئر واحتضان بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، استبدال المتوسطة في كل بئر مع مليلترين من DMEM كاملة تكملها ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر البوليبرين وإضافة واحد إلى مزيج واحد من تجمع ينتج النسخ عامل العدسي وM2rtTA في أنبوب جديد microcentrifuge. ثم، transduce الخلايا الليفية مع حجم الأمثل من خليط العدسي، بين 10 إلى 100 ميكرولترات لكل بئر.بعد 16 ساعة من الحضانة، استبدال اعمابير مع DMEM كاملة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ست إلى ثماني ساعات. بعد الانتعاش، استبدال superants مع مليلتر اثنين من DMEM كاملة تكمل مع البوليبرين وتنفيذ عملية نقل ثانية كما أظهرت للتو. في نهاية الحضانة الثانية، استبدال supernatants مع DMEM كاملة تكمل مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الدوكسيسيكلين والعودة إلى لوحة الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة.في نهاية الحضانة، وتقسيم كل بئر في نسبة واحد إلى اثنين والخلايا replate في مليلتر اثنين في بئر من متوسطة الدم تكملها دوكسيسيكلين في الجيلاتين المغلفة جديدة ستة لوحة جيدا. للحصول على عدد كاف من الخلايا لتحليل تسلسل chromatin المناعية، لوحة ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الليفية الخامسة في الجيلاتين المغلفة ستة لوحة جيدا واحتضان بين عشية وضحاها. في نهاية الحضانة، transduce الخلايا مرتين في يومين متتاليين مع 10 إلى 20 ميكرولترات من فيروس العدس التي تحتوي على العوامل الفردية من الفائدة أو مجموعة من العوامل الثلاثة بالإضافة إلى FUW-M2rtTA بنسبة واحد إلى واحد.بعد 16 ساعة من عملية النقل الثانية، قم بإزالة الفيروس الذي يحتوي على افراً واحتضان الخلايا في DMEM كاملة لمدة 24 ساعة. في نهاية الحضانة، وإرجاع محتويات كل بئر في الجيلاتين المغلفة 100 ملليمتر الأطباق معالجة زراعة الأنسجة مع DMEM كاملة إلى حجم النهائي من 10 ملليلتر المتوسطة لكل طبق، والعودة إلى الخلايا الحاضنة ثقافة الخلية. بعد ستة أيام، استبدال ناظر مع DMEM كاملة تكمل مع الدوكسيسيكلين.إعادة الثقافات إلى الحاضنة لمدة يومين إضافيين. كما تثبت هذه المؤامرات علم الخلايا تمثيلية، ما يقرب من 17٪ من الخلايا التي أعيد برمجتها التعبير عن كل CD49f و CD9 بعد 25 يوما من إعادة البرمجة. غالبية الخلايا الإيجابية المزدوجة تعبر عن CD143 ويعبر عدد قليل من السكان عن CD34 ، مما يشير إلى تحريض مصير الهيموجينيك الديناميكي.لا يتم تنشيط هذه العلامات في M2rtTA الخلايا الليفية الجلدية المستحثة البشرية المستزرعة لمدة 25 يوما. ويؤكد التصوير المناعي للفلوريس التعبير عن CD9 وD143 في الخلايا المتصّفة والمستديرة التي تتميز بشكل مورفولوجي عن الخلايا الليفية، والتي تكون سلبية بالنسبة لهذه العلامات. يتم تنفيذ التصوير Brightfeild لتصور التقاء الخلية، مورفولوجيا، وتشكيل مستعمرة في جميع أنحاء عملية إعادة البرمجة.تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية للخلايا التي أعيد برمجتها يكشف عن زيادة تدريجية في التعبير CD49f و CD9 و CD143 من يومين إلى 25. بعد تسلسل chromatin المناعية، يعرض لمحات متصفح الجينوم جاتا2 ملزمة للمناطق التنظيمية الجينومية من ITGA6 و ACE عندما يتم cotransations الليفية مع العوامل الثلاثة أو جاتا 2 بشكل فردي. وينبغي تحسين حجم الجسيمات المضادة للفيروسات المضافة إلى الثقافة لإعادة البرمجة بنجاح دون المساس بقابلية الخلية.يمكن أن تقترن هذه المنصة مع التثبيط الدوائي وتقنيات الفحص على نطاق الجينوم ، مثل CRISPR -Cas9 ، لتحديد المنظمين رواية لدم الدم النهائي البشري. وهذا النهج إعادة برمجة مباشرة تسمح للباحثين لاستكشاف أسئلة جديدة في مجال الدم الإنسان التنموي وفك الآليات الكامنة في تحديد الخلايا الجذعية الإنسان. ومن المهم القيام بمجموعات مضادة للفيروسات وتحويلها في غطاء للتدفق المغفل مخصص للعمل في علم فيروسات الدسين والتخلص من النفايات الملوثة فيروسية في حاوية مناسبة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة وبناء التنموي سمية فحوصات للسلامة الكيميائية الفحص وبيولوجيا الأنظمة توليد البيانات

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

الحث المباشر للمكون للدم البطانة Endothelium والدم عن طريق overexpression من العوامل المحفزة النسخ في الإنسان الخلايا الجذعية

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

إنشاء خلايا التكاثري رباعي الصيغة الصبغية من Nontransformed الخلايا الليفية الإنسان

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

إعادة برمجة خلايا المشروطة للأطفال الإنسان المريء طلائي للاستخدام في هندسة الأنسجة وأمراض التحقيق

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

قمع الإشارات برو تليفية يقوي التي تعالج بوساطة معامل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الماوس في Cardiomyocytes المستحث

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...