Name: hemogenic reprogramming of human fibroblasts by enforced expression of transcription factors
Uploaded: 2019-11-04T13:00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors at JoVE.com

הקרן של קנוט ואליס ולנברג, הפקולטה לרפואה באוניברסיטת לונד ואזור סיינה מודעים לתמיכה כספית נדיבה. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק Olle Engkvists Stiftelse (194-0694 כדי פיליפה פריירה) ו PhD מלגות מ-Fundação פארה a Ciência e Tecnoלוגיה (לפטין/בים-מד/0075/2014 לפיליפה פריירה, ו SFRH/BD/135725/2018 ו SFRH/BD/51968/2012 לריטה אלבס ואנדראיה גומז). מחקר זה היה נתמך גם על ידי כספים מ NIH ו NYSTEM (1R01HL119404 ו C32597GG לקאטרי א. מור).

<ol>
	<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+potent+human+hematopoietic+stem+cells+first+emerge+in+the+intraembryonic+aorta-gonad-mesonephros+region.">Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).</li><li>Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., P&#233;ault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+human+hematopoiesis.">Embryonic origin of human hematopoiesis.</a> International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).</li><li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system:+advances+and+questions.">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138, 1017-1031 (2011).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell.">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).</li><li>Vo, L., Daley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+generation+of+HSCs+from+somatic+and+pluripotent+stem+cell+sources.">De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources.</a> Blood. 125, 2641-2648 (2015).</li><li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition.">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121, 770-781 (2013).</li><li>Ebina, W., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+reprogramming+toward+hematopoietic+stem+cells.">Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells.</a> EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+Hemogenic+Program+in+Mouse+Fibroblasts.">Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+Reprogramming+In+vitro+Informs+In+Vivo+Identification+of+Hemogenic+Precursors+to+Definitive+Hematopoietic+Stem+Cells.">Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Single+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+Capable+of+Long-Term+Multilineage+Engraftment.">Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment.</a> Science. 333, 218-221 (2011).</li><li>Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., P&#233;ault, B., Tavian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+(CD143)+specifies+emerging+lympho-hematopoietic+progenitors+in+the+human+embryo.">Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo.</a> Blood. 119, 3712-3724 (2012).</li><li>Gomes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Transcription+Factor+Induction+Mediates+Hemogenic+Reprogramming.">Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming.</a> Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).</li><li>Karlsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+The+Tetraspanin+CD9+Affords+High-Purity+Capture+of+All+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells.">Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Reports. 4, 642-648 (2013).</li><li>Leung, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetraspanin+CD9+regulates+migration,+adhesion,+and+homing+of+human+cord+blood+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 117, 1840-1851 (2011).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency.">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).</li><li>Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors.">Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).</li><li>Suzuki, Y. S., Suzuki, Y., Ke, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulatable+Lentiviral+Vector+System.">Gene Regulatable Lentiviral Vector System.</a> Viral Gene Therapy. , (2011).</li><li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors.">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157, 549-564 (2014).</li><li>Lis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+endothelium+to+immunocompetent+haematopoietic+stem+cells.">Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells.</a> Nature. 545, 439-445 (2017).</li><li>Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+blood+to+blood&#8217;:+de-differentiation+of+hematopoietic+progenitors+to+stem+cells.">From blood to blood&#8217;: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells.</a> EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Signatures+of+Tissue-Specific+Microvascular+Endothelial+Cell+Heterogeneity+in+Organ+Maintenance+and+Regeneration.">Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration.</a> Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Murine+Fibroblasts+to+Hematopoietic+Progenitor+Cells.">Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells.</a> Cell Reports. 9, 1871 (2014).</li><li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mouse+fibroblasts+into+engraftable+myeloerythroid+and+lymphoid+progenitors.">Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors.</a> Nature Communications. 7, 1-15 (2016).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

במאמר זה, שיטה מתוארת כדי ליצור תאים מחולל קדמון ישירות מן הפיברוהטיות האנושית, אשר עוברים דרך תא HP ביניים, בדומה HSCs14הסופי.
הבריכה-ייצור של חלקיקים לGATA2, GFI1B ו-FOS היה מועדף על הייצור הפרטי, מאז בידינו זה התוצאות ביעילות גבוהה יותר לתיכנות מחדש (נתונים שלא פורסמו). לאנטי וירוסים, כחברים של המשפחה הרטרוריתיים , בדרך כלל מכילים שני עותקים של ה-RNA החיובי חד-הורית19. יעילות התכנות מוגברת עשוי להיות עקב אריזה של שני שונים transgenes באותו חלקיק ויראלי זהה, וכתוצאה מכך מספר גדל של תאים שיתוף התמרה עם שלושה גורמים שעתוק. כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה, יש צורך לשנות HDFs עם כמות נאותה של וירוס בהתאם למעבר התא כדי לקבל איזון אופטימלי בין יעילות התיכנות מראש והכדאיות התא, כמומלץ בשלב 4.6. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בווירוסים לא מרוכזים טריים. מומלץ להתאים תאים עם 0.5-3 מ ל של בריכת 3TFs ו M2rtTA. כמו כן, צפיפות התא צריכה להיות מותאמת בהתאם ליישום. 150 000 HDFs לכל 6-באר צלחת (שלב 4.4) סיפק את הצפיפות האופטימלית לבצע FACS, השתלת וזרימה cy, לנסות ניתוח תאים מתוכנת. עבור ניסויים שבב-seq, תאים נוספים נדרשו מההתחלה (שלב 5.1). חשוב לבדוק את התאים באופן סדיר עבור שינויים מורפולוגיים ולהחליף מדיום המטבית פעמיים בשבוע כדי לתמוך הופעתה של תאים מזורפי המטטיים. הוספת ציטוקינים או שיתוף תרבות בשכבות ממזין עשויה להגביר את יעילות התיכנות מראש.
בשיטה זו, אנו יכולים לזהות סמנים המטפאות חדשים המובטאים באופן דינאמי במהלך תיכנות מחדש של הומוגניים. CD9, אשר הוכח להיות מוסדר בתאים מתוכנת מחדש ברמת ההמרה14, הוא מתבטא במהירות על פני השטח של התא בשלבים הראשוניים של התכנות יחד עם CD49F ו CD143, המשמש כסמן הרומן של האדם hsc הסמנים הקדם. כמו כן, אנו מראים כי ITGA6 ו- ACE הם יעדים ישירים של GATA2 במהלך השלבים הראשוניים של תכנות משנה, בנוסף CD9 ו- CD3414, מתן קשר ישיר מכניסטי בין הומוגניים האדם פניטיפים וGATA2.
אחד היתרונות של מערכת זו שוכן בשימוש בתרבויות הומוגניות יחסית. בעוד PSCs מורחבים בקלות ומתוחזק בתוך מבחנה, הפרוטוקולים בידול ליצור אוכלוסיות הטרוגנית הכוללים המטפיאה ושלתי, אשר חרט גרוע5,6,7. יתר על כן, יש סיכון של tumorigenesis כאשר שתילת הPSC הנגזרות HSPCs, מאז מובחן PSCs עשוי עדיין להישאר בתרבות גם לאחר שימוש בפרוטוקולים בידול. לחילופין, מתיכנות ישיר של HSCs הוחל על מחויבות דם ושלתי20 ותאי האנדותל21. עם זאת, החל בתאים מוגבלים בדם מעכבת את היישום הטיפולי של HSCs כתוצאה מכך, אם המטופל נושא מוטציות המשפיעות על האוכלוסייה המטטית גזע/מחולל קדמון22. במקרה של תאי האנדותל, קשה יותר להשיג זאת בהשוואה לפיברומופיצוצים, ומהווים אוכלוסיית תאים הטרוגנית מאוד במונחים של פנוטיפים, תפקוד ומבנה, התלויים באיברים23. מחקרים אחרים הצליחו לתיכנות מראש של עכברים לתוך המטפיאה ושלתי24,25 עדיין, עד כה, אין פרוטוקול אחר מתאר את הדור של תאים hspc-כמו מתוך פיברופיצוצים אנושיים.
גישה זו, ביחד עם עיכוב תרופתי, גן נוק אאוט, או להפיל היתרים להגדיר בודדים או שילוב של גורמים הנדרשים ישירות לגרום לאדם HSCs. העסקת יעילות גבוהה ההקרנה מתודולוגיות מבוסס על האחרונים CRISPR-Cas9 טכנולוגיות HDFs לפני תכנות מחדש, מייצגת מאמץ מלהיב להגדרת הרגולטורים הרומן של המטפיאה הסופית האנושית. בעתיד, מתיכנות מחודש של סוגי תאים אנושיים שאינם קשורים בדם כגון הפיברוביטים ישמשו כפלטפורמה להפקת תאים בריאים המותאמים לחולה בתאי מחולל ביישומים קליניים.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.
The second author affiliation was&#160;updated from:
2Wallenberg Center for Molecular, Lund University
to:
2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.

Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

מוחלט גזע ותאים מחולל קדמון (HSPCs) לצאת באזור אב העורקים-gonad-mesonephros (AGM) במחוז והשליה של אנדותל מקדים עם קיבולת הומוגניים, באמצעות מעבר אנדותל המטתית (EHT)1, 2. שתיים. מזהים הומוגניים (HPs) מבטאים את הסימונים האנדותל והמטבטיים, אך הזיהוי המדויק שלהם נשאר חמקמק, במיוחד במערכת האנושית. למרות היותו תהליך שימור יחסית ביונקים, תא גזע המטפאות (hsc) הפיתוח עדיין שונה באופן משמעותי בין האדם ומודלים העכבר3,4. לכן, בגישות מחוץ לתחום הפיתוח האנושי נדרשים התפתחות hsc.
הבידול של תאי גזע פלאוריטי (PSCs) כדי HSCs, למרות מבטיח, פגש הצלחה מוגבלת במהלך 20 השנים האחרונות, בעיקר בשל הפרוטוקולים בידול זמין, אשר התוצאה של המטפאות פרימיטיבי ושלתי עם התאום המסכן . יכולת5,6,7 לחילופין, מתודולוגיות מסוימות של תאים ישירים לתכנות הוחלו כדי ליצור תאים כמו hspc מסוגי תאים מרובים, באמצעות גורמי תמלול (tfs)8,9. במיוחד, ביטוי היתר של שלושה TFs, Gata2, Gfi1b ו-cFos, המרה מעובריים העכבר מתחלקים לתוך HSPCs באמצעות HP ביניים עם פניטיפ מוגדר (Prom1 + סקה -1 + CD34 + CD45-)10. תהליך זה דמה ל-EHT המתרחש העובר והשליה, במהלך המפרט של המטפיאה הסופית. פנוטיפ זה איפשר זיהוי ובידוד של אוכלוסיה של HPs ב השליה של העכבר כי לאחר התרבות לטווח קצר ו הפעלה חריץ שנוצר שתילת הHSCs הטבלה11.
עד כה, אין פנוטיפים הוקמה כי מבדיל בין האדם HSCs מן הסמנים שלהם, אבל כמה מולקולות ידועים להתבטא בHSCs המתעוררים. אינטגרציה אלפא 6 (ITGA6 או CD49f) מתבטאת במידה רבה באכלוס מחדש של HSCs, הילדותית ביותר תאים בתוך תא HSC12, ו אנגיוטנסין-המרת אנזים (ACE או CD143) קיים ב CD34 המטפאות שליליות מראש ברקמות העובאריות דם13.
לאחרונה, הדגמנו כי הגירסאות האנושיות של שלושה TFs, GATA2, FOS ו GFI1B מתכנת מראש את העור האנושי (HDFs) לתוך HPs עם קיבולת מקוצר לטווח קצר14. בשלבים הראשוניים של תכנות משוב, GATA2 עוסקת כרומטין פתוח ומגויסים GFI1B ו FOS לדכא גנים פיברובסט ולהפעיל את הגנים אנדותל והמטפאות. תאים המושרה מאוד מבוטא CD49f ו-ACE, והכיל אחוז קטן של תאים המבטאים את סמן HSPC CD34. הגן CD9, אשר מתבטא ב HSCs15 והוא חשוב עבור hsc ביות16, הוכח להיות מטרה ישירה של GATA2 ובקרב הגנים המווסתים ביותר בתאים מתוכנת-משנה14. CD9 עשוי אפוא להוות סמן נוסף עבור HPs של המטפיאה הסופית האנושית.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הדור של תאים ה-HSPC כמו הגידולים האנושיים באמצעות ביטוי נאכף של GATA2, GFI1B ו-FOS, כמו גם שיטה מותאמת כרומטין immunoprecipitation (שבב)-רצף (seq) ניתוח בתחילתה של תכנות. TFs היו מקודדים ב דוקסיציקלין (חמצון)-inducible וקטור (pFUW-tetO) המכיל את אלמנט התגובה טטרציקלין (TRE) ו מיזם CMV מינימלי, ו היו התמרה יחד עם וקטור מכונן המכיל טטרציקלין הפוכה transactivator חלבון (pFUW-M2rtTA). כאשר החמצון (אנלוגי של טטרציקלין) מתווסף לאחר התמרה, הוא נקשר לחלבון rtTA אשר מקיים אינטראקציה עם TRE המאפשר שעתוק TF (ט-On מערכת). ההליך דורש 25 ימים להשלמת. עבור ניסויים שבב-seq, HDFs הותמרה באמצעות גירסאות מתויגות של GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) ו GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), בתוספת pFUW-tetO-FOS ו-TF אתרים כריכה נותחו יומיים לאחר תוספי החמצון.
בסופו של דבר, הומוגניים מתיכנות מחודש של הגידולים האנושיים מספק מערכת צייתן מבחנה ללמוד את המנגנונים הבסיסיים התפתחותית המין האנושי מקור פוטנציאלי של hspcs ספציפי לחולה עבור יישום קליני עתידי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#430625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>#343518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#14280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC903096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1X) no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate (DOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#25-0495-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUW-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from Porcine Skin Type A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematopoietic medium, MyeloCult H5100</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#05150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Fibroblasts (HDFs)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>#2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution (Pen/Strep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SH30256.01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>#312105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-FOS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-GATA2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-GFI1B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV-tetO-HA-GFI1B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic reprogramming of human fibroblasts by enforced expression of transcription factors

המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים שבבסיס תאי הגזע האנושיים (HSCs) נותרים חמקמקים. אסטרטגיות כדי ללכוד הופעתה האנושית HSC בתוך מבחנה נדרשים כדי להתגבר על מגבלות לימוד זה תהליך התפתחותי מורכב. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לייצר גזע המטפאות ותאים כמו מחולל קדמון מתאי הפנים האנושיים העסקת הגישה הישירה של התא התכנות. תאים אלה עוברים דרך תא ביניים מסוג הומוגניים, הדומה למעבר האנדותל-למטפי (EHT) האופייני למפרט HSC. פיברובטוס מתוכנת לתאי הומוגניים באמצעות התמרה של GATA2, GFI1B ו-FOS שעתוק. שילוב זה של שלושה גורמים המושרה שינויים מורפולוגיים, ביטוי של המטוגניים סמנים המטבטיים ו-EHT דינמי תוכניות הטרנססקריפט. ועכברים מתאכלס מעצמם. במשך שלושה חודשים פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לקראת הניתוח המכונה של תהליך EHT האדם כפי שניתן לGATA2 על ידי הגדרת מטרות במהלך השלבים המוקדמים של תכנות מחודש. כך, מחדש האדם הומוגניים מספק גישה פשוטה ומעקב כדי לזהות סמנים הרומן הרגולטורים של הופעתה האנושית HSC. בעתיד, אינדוקציה נאמנה של הגורל המוגניים בפיברופיצוצים עלול להוביל לדור של HSCs ספציפי למטופל להשתלה.

ייצוג סכמטי של גישת התיכנות משנה באמצעות HDFs מומחש באיור 1א. פיברוהכדורים נרכשים ממקורות מסחריים או נאספים מתורמים אנושיים והרחיבו בתוך מבחנה בעבר כדי לתיכנות מוקדם יותר. לאחר הציפוי, תאים מתתמרים פעמיים עם GATA2, GFI1B ו-FOS (ו M2rtTA) מווירוסים, ו דוקסיציקלין מתווסף ביום 0 של תיכנות מראש. ביום 2, התאים מפוצלים ומצופים במדיום המטכיפת עד יום 25 של תרבות. תאים מתוכנת מחדש עשוי להיווצר בנקודות זמן שונות עבור יישומים מרובים כולל השתלת עכברים בסיכון חיסוני, תא יחיד RNA-רצפי (scRNA-seq) של אוכלוסיות תאים מטוהרים (יום 2 unsorted יון, יום 15 CD49f+ CD34 ו יום 25 CD49f+CD34+ תאים), כמו גם מיקרוסקופ וזרימה cy try ניתוח עבור סמני פני השטח של התא CD49F, CD34, CD9 ו CD143. מגרשים הנציג cy, להראות ~ 17% של תאים תיכנתו המבטא הן CD49f ו CD9 (איור 1B, הפאנל השמאלי), לאחר 25 ימים של תכנות משנה. רוב התאים החיוביים הכפולים express CD143 (~ 86%), ואוכלוסייה קטנה express CD34 (0.9%), מרמזת על שדרוג הגורל הדינאמי. סמנים אלה אינם מופעלים ב-HDFs M2rtTA ed במשך 25 ימים (איור 1B, הלוח הימני). התמונות immunofluorescence לאשר ביטוי של CD9 ו CD143 בתאים חסיד ועגול, נבדל מורפולוגית מפני פיברופיצוצים כי הם שליליים עבור סמנים אלה (איור 1ג). גם מושבות הומוגניים של האדם מבטאות CD49f ו-CD3414. ScRNA-seq ניתוח של HDFs, יום 2 תאים ממוינים, ו מטוהרים תאים מתוכנת ביום 15 (CD49f+CD34-) ו-day 25 (CD49f+CD34+) להראות עלייה מתונה ב CD49f, CD9 ו CD143 ביטוי מיום 2 עד יום 25. CD49f ו CD9 תאים חיוביים מופיעים הראשון במהלך תהליך תיכנות מחודש, בין יום 2 ו 15, המציין כי מולקולות אלה עשויים לייצג סמנים של הומוגנזה האנושית הקדומה. CD143 ביטוי מתחיל להתגלות ביום 15 ו CD34 המבטא תאים מזוהים רק בנקודות זמן מאוחרות יותר (יום 25). CD34+ דם טבורי (ucb) תאים שימשו כהפניה (איור 1ד).
איור 2A מתאר פרוטוקול שהשתנה להפקת מספר מספיק של תאים עבור ניתוח שבבים-seq בשלבים ההתחלתיים של תכנות מחודש (יום 2). ראשון, HDFs מצופים בצפיפות פי שניים גבוה יותר מאשר בפרוטוקול רגיל (300,000 תאים לעומת 150,000 תאים לצלחת). לאחר התמרה, כל באר הוא מצופה מחדש לתוך צלחת 100 מ"מ המאפשר לתאים להתרחב למשך 6 ימים לפני להשלים בינוני עם החמצון. תאים מנתחים 2 ימים לאחר הוספת חמצון ביטוי הסוגר. איור 2B מציג את פרופילי דפדפן הגנום של איגוד GATA2 לאזורים הרגולציה גנומית של ITGA6 ו- ACE כאשר התאים הם שיתוף התמרה עם שלושת הגורמים (3tfs) או GATA2 בנפרד. GATA2 מאגד גם לפתוח אזורי כרומטין של CD9 וCD34 גנים14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig1a.jpg"> איור 1: אינדוקציה של הגורל המוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות. (א) אסטרטגיה ניסויית עבור הומוגניים מתכנות מחודש של הגוף האנושי (hdfs). פיברותקיעות מתוך ביופסיות ניקוב העור נאספים מתורמים, המורחבת והתמרה עם GATA2, GFI1B, FOS ו M2rtTA לוירוסים. דוקסיציקלין (חמצון) מתווסף לתרבות ביום 0 של תכנות מראש ותאים מנותח במספר נקודות זמן עד יום 25. scRNA-seq, תא יחיד לרצפי רנ א. FACS, מיון התא המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית. (ב) האסטרטגיה המשמשת להערכת הביטוי של סמנים המטגניים/מטוניים על ידי זרימה cy, try ביום 25 לאחר התמרה עם שלושת גורמי התמלול (3TFs). מגרשים cy, מראה אחוז מתאים חיוביים כפולים עבור CD49f ו-CD9, מגודרת באוכלוסיית התאים החיים (DAPI-שלילי). בתוך האוכלוסיה החיובית הכפולה, הביטוי של CD143 ו-CD34 מוצג. HDFs השתנה רק עם M2rtTA וירוס תחת אותם תנאים התרבות משמשים כשליטה. (ג) immunofluorescence תמונות של היום 25 מושבות מתוכנת מאשרת את הביטוי של CD9 (הפאנל העליון) ו CD143 (הפאנל התחתון). תאים היו מוכתמים בנוגדנים (טבלה של חומרים) מדולל 1:100 ב PBS/2% fbs עם סרום לעכבר, מודבטים 20 דקות ב 37 ° צ', 5% CO2, שטף שלוש פעמים והתמונה ב-PBS/2% fbs. שלב, ניגוד מעבר פאזה. קנה מידה ברים = 50 μm. (ד) ScRNA-הניתוח seq של 253 תאים בנקודות זמן שונות. ביטוי של ITGA6, CD9, ACE ו- CD34 מופעל במהלך תיכנות משנה. התאים נאספים ביום 2 (לא ממוינים), יום 15 (CD49f+CD34-) ויום 25 (CD49f+CD34+). HDFs ו CD34+ דם טבורי (34 + ucb) תאים משמשים כהפניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig02.jpg"> איור 2: התרחבות של פיברוהכדורים של הגוף האנושי לניתוח שבבים-seq. (א) האסטרטגיה הניסיונית המתארת פרוטוקול שונה כדי לייצר מספר גבוה של התמרה בעלי העורי הגוף האנושי (hdfs) עבור שבב-seq ביום 2 של תכנות מחודש. 300,000 תאים מצופים 6-היטב לוחות והתמרה פעמיים עם גורמים בודדים (pFUW-tetO-, pLV-tetO-HA-הGFI1B או pFUW-teto-3xFLAG-GATA2) או שילוב של שלושה גורמים (בנוסף M2rtTA). לאחר הסרת וירוסים, מרחיבים פיברותקיעות במשך שישה ימים במנות 100 מ"מ. דוקסיציקלין (חמצון) מתווסף ביום 0 ותאים נאספים יומיים לאחר התוספת חמצון. (ב) הגנום פרופילים המדגיש אתרים GATA2-כריכה (קופסאות אפורות) ב ITGA6 ו אס הבית יומיים לאחר התמרה עם שלושת גורמי התמלול (3TFS) או עם GATA2 לבד. המספר הכולל של קריאות ממופות מיוצג בציר ה-y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1.jpg"> איור משלים 1: הגדרת אמצעי אחסון ממוטב עבור תכנות הומוגניים יעיל. הגדלת כרכים של מרוכז (10 עד 100 μL) מאגר המיוצר חלקיקים ויראליים (3TFs: GATA2, GFI1B ו-FOS) משמשים כדי לשנות את הגידול האנושי העורי (HDFs), יחד עם M2rtTA ביחס של 1:1, בעקבות שלבים 4.5-4.12 של הפרוטוקול. התאים הניתנים לתכנות מנותח ביום 25 כדי להגדיר נפח אופטימלי של התמרה מראש הומוגניים, הניתנים על ידי אחוז CD49f+CD9+ תאים מגודרת בתאים חיים (dapi-שלילי). הכדאיות של התא יכולה להיות מוערך על ידי כימות המספר המוחלט של תאים חיים ביום 25. HDFs התמרה עם M2rtTA (100 μL) משמשים כפקד שלילי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2.jpg"> איור משלים 2: מורפולוגיה שינויים במהלך תכנות משנה של הומוגניים בעלי העורי. תרבויות הגוף (HDF) האדם מותמרים ביום של התמרה הראשונה (יום-2), כאשר החמצון מתווסף לתרבויות (יום 0), יומיים (יום 2) וחמישה עשר ימים (יום 15) לאחר תוספת החמצון, ובנקודת הסיום של הניסוי (יום 25). מושבות הומוגניים בימים 15 ו -25 מודגשות. קנה מידה ברים = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors at JoVE.com

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

פרוטוקול זה ממחיש את האינדוקציה של תוכנית המטוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות על ידי ביטוי נאכף של הגורמים שעתוק GATA2, GFI1B ו-FOS כדי ליצור גזע המטפאות ובתאי קדמון.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

שיטה זו מסייעת להתגבר על מגבלות בחקר ההתפתחות ההמוטופיטית האנושית על ידי מתן פלטפורמת במבחנה פשוטה ומתוחה המבוססת על תכנות מחדש של תאים ישירים. הדגמה חזותית של שיטה זו תספק הדרכה אידיאלית בצעדים בסיסיים כדי ליצור תאים hemogenic אנושי כלומר במהלך ייצור lentiviral, ההעתקה fibroblast ותרבות התא. על ידי המרת פיברובלסטים בעור למבשרי המוגנית, אנו מקווים ליצור תאי גזע ומאגניים ספציפיים למטופל במספרים מספיקים להשתלת תאי גזע.התחל על ידי גידול תאי HEK293T בצלחת רקמות 100 מילימטר מטופל עם 10 מיליליטר של DMEM מלא ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד confluency. ביום שלפני ההטמנה, לאחר שאיפה של המדיום, לשטוף את המנה בזהירות עם חמישה מיליליטר של PBS ולנתק את התאים עם 1.5 מיליליטר של פתרון דיסוציאציה. לאחר הדגירה במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להשבית את הפתרון עם שלושה מיליליטר של DMEM מלא ולהעביר את ההשעיה התא צינור חרוט 15 מיליליטר.לשטוף את המנה עם 5 מיליליטר של DMEM מלא כדי להסיר את כל התאים המצורפים הנותרים ולמשוך את הכביסה עם פתרון התא. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, לשאוף את supernatant ולתלות את גלולה בשישה מיליליטר של DMEM מלא. לאחר מכן, לפצל את ההשעיה באופן שווה בין שישה 100 מילימטר רקמת רקמות טופלו מנות בנפח סופי של 10 מיליליטר של DMEM מלא לכל מנה.למחרת, להוסיף 10 מיקרוגרם המסה הכוללת של שלוש פלסמידים העברה יחד לצינור חרוט חדש 15 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 10 מיקרוגרם של הדור השני של וקטור אריזה psPAX2 קידוד איסור פרסום, pol, tat וגנים rev ואחריו תוספת של חמישה מיקרוגרם של pMD2. וקטור מעטפת G קידוד הגן VSV-G לצינור.לבסוף, להוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי ל 500 microliters. בשני צינורות חרוטיים חדשים של 15 מיליליטר, הוסיפו 10 מיקרוגרם של פלסמיד FUW-M2rtTA, 10 מיקרוגרם של וקטור האריזה, וחמישה מיקרוגרם של וקטור המעטפה לכל צינור. לאחר מכן, להוסיף מים עד נפח סופי של 500 microliters לכל צינור.לאחר מכן, להוסיף 62.5 microliters של שני כלוריד סידן טוחן לכל אחד משלושת הצינורות ולהשתמש בקר פיפטה מצויד פיפט פסטר לשחרר בועות לתוך כל תערובת. בזמן שהבועות נוצרות, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תמיסת מלח במאגר BES נגד פיפית פסטר ועל התערובת. הדגירה את הצינורות בטמפרטורת החדר לפחות 15 דקות עד תערובות להיראות מעונן מעט.במהלך הדגירה, בזהירות להחליף את supernatant של תרבות התא HEK293T עם 10 מיליליטר של DMEM מלא ללא אנטיביוטיקה. להפיץ את קומפלקסים DNA dropwise על מנות בודדות HEK293T תאים תרבות דגירה במשך 24 שעות. למחרת, להחליף את supernatants עם ארבעה מיליליטר של DMEM מלא לכל תרבות ולהחזיר את הכלים 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני תא תרבות החממה לילה.למחרת בבוקר, לאסוף את supernatants לתוך צינור אחד 50 מיליליטר לכל מנה ולהוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום טרי לכל מנה. לאחר שמונה שעות נוספות של תרבות, בריכת supernatant בכל מנה עם על טבעי שנקטפו בעבר ולהוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום טרי. מחזירים את הכלים לאנקובטור תרבות התאים בן לילה ואוסף את העל-טבעיים בפעם האחרונה.כאשר כל הנגיף נאסף, לסנן כל lentiviral על טבעי באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר חלבון נמוך מחייב לתוך צינורות בודדים ולהוסיף מקסימום של 15 מיליליטר של על טבעי מסונן ליחידות סינון צנטריפוגלי בודדות עבור צנטריפוגה. השלך את הזרימה. lentivirus צמיג המכיל נוזל יישאר ביחידת הסינון.כאשר כל על-טבעי lentiviral כבר מסונן aliquot 50 כדי 200 microliters של lentiviruses מרוכז לאחסון קר. לפני תחילת הליך התכנות מחדש, קוד צלחת שש גם רקמה מטופלת עם 500 microliters של 0.1% ג'לטין ל הבאר דגירה את הצלחת במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שאפו את תוסף הג'לטין הנותר.צלחת פיברובלסטים עוריים אנושיים בצפיפות של 1.5 פעמים עשר לתאים החמישיים לכל צלחת בשני מיליליטר של DMEM שלם לבא ודגירה בן לילה. למחרת בבוקר, להחליף את המדיום בכל באר עם שני מיליליטר של DMEM שלם בתוספת שמונה מיקרוגרם לכל פוליברן מיליליטר ולהוסיף תערובת אחת לאחד של הבריכה המיוצר גורם שעתוק lentiviruses ו M2rtTA בצינור microcentrifuge חדש. לאחר מכן, לשנות את fibroblast עם נפח אופטימלי של תערובת lentiviral, בין 10 ל 100 microliters לבא.לאחר 16 שעות של דגירה, להחליף את supernatants עם DMEM מלא ולהחזיר את התאים אינקובטור תרבות התא במשך שש עד שמונה שעות. לאחר ההתאוששות, להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של DMEM מלא בתוספת פוליברין ולבצע התברציה שנייה כפי שהוכח רק. בסוף דגירה ההמרה השנייה, להחליף את supernatants עם DMEM שלם בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין ולהחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא במשך 48 שעות.בסוף הדגירה, לפצל כל באר ביחס של אחד עד שניים ולהצטייד בשני מיליליטר לגם של מדיום hematopoietic בתוספת דוקסיציקלין בג'לטין חדש מצופה שישה צלחת היטב. כדי להשיג מספר מספיק של תאים לניתוח רצף immunoprecipitation כרומטין, צלחת שלוש פעמים 10 כדי fibroblasts החמישי בג'לטין מצופה שש צלחת היטב דגירה לילה. בסוף הדגירה, להתמר תאים פעמיים ביומיים רצופים עם 10 עד 20 microliters של lentivirus המכיל את הגורמים הבודדים של עניין או מאגר של שלושת הגורמים בתוספת FUW-M2rtTA ביחס אחד לאחד.16 שעות לאחר ההתמרה השנייה, להסיר את הווירוס המכיל על טבעי דגירה התאים DMEM מלא במשך 24 שעות. בסוף האינקובציה, מחדש את התוכן של כל באר לתוך ג'לטין בודד מצופה 100 מילימטר רקמת רקמות טופלו מנות עם DMEM מלא לנפח סופי של 10 מיליליטר של מדיום לכל מנה, ולהחזיר את התאים אינקובטור תרבות התא. לאחר שישה ימים, החלף את העל-טבעי ב- DMEM מלא בתוספת דוקסיציקלין.החזירו את התרבויות לאנקובטור ליומיים נוספים. כפי שמדגימים חלקות ציטומטריה מייצגות אלה, כ-17% מהתאים שעברו תכנות מחדש מבטאים הן CD49f והן CD9 לאחר 25 ימי תיכנות מחדש. רוב התאים החיוביים הכפולים מבטאים CD143 ואוכלוסייה קטנה מבטאת CD34, מה שמרמז על אינדוקציה דינמית של גורל ההמוגני.סמנים אלה אינם מופעלים M2rtTA מתמרים פיברובלסטים עוריים אנושיים מתורבתים במשך 25 ימים. דימות Immunofluorescence מאשר את הביטוי של CD9 ו- CD143 בתאים חסידים ועגולים הנבדלים מורפולוגית מ fibroblasts, אשר שליליים עבור סמנים אלה. הדמיה בהירה מתבצעת כדי לדמיין את קונפליונציית התא, מורפולוגיה, היווצרות המושבה לאורך כל תהליך התכנות מחדש.ניתוח רצף RNA חד-תאי של תאים מתוכנתים מחדש חושף עלייה צעד-צעד בביטוי CD49f, CD9 ו- CD143 מיום 2 עד 25. לאחר רצף immunoprecipitation כרומטין, פרופילי דפדפן הגנום מראה GATA2 מחייב לאזורים רגולטוריים גנומיים של ITGA6 ו- ACE כאשר fibroblasts הם cotransduced עם שלושת הגורמים או GATA2 בנפרד. נפח החלקיקים האנטי-ויראליים שנוספו לתרבות צריך להיות מותאם במיוחד לתכנות מחדש מוצלח מבלי להתפשר על הכדאיות של התאים.פלטפורמה זו יכולה להיות יחד עם עיכוב תרופתי וטכנולוגיות סינון בקנה מידה גנום, כגון CRISPR-Cas9, כדי להגדיר רגולטורים חדשניים של hematopoiesis מוחלט אנושי. גישה זו של תכנות מחדש ישיר תאפשר לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתחום המטופויז ההתפתחותי האנושי ולפענח מנגנונים שבבסיס המפרט של תאי גזע ההמוטופיטיים האנושיים. חשוב לבצע אוספים ותנופים אנטי ויראליים במכסה המנוע לזרימה למינארית המוקדש לעבודה lentiviral ולהשליך פסולת מזוהמת ויראלית לתוך מיכל מתאים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...