Name: hemogenic reprogramming of human fibroblasts by enforced expression of transcription factors
Uploaded: 2019-11-04T13:00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors at JoVE.com

너트와 앨리스 발렌버그 재단, 룬드 대학과 지역 스코네의 의료 학부는 관대 한 재정 지원을 인정합니다. 이 작품은 올레 엥크비스트 스티펠스(194-0694~필리핀 페레이라)의 보조금과 Fundação para a Ciência e Tecnologia(PTDC/BIM-MED/0075/2014/2014)의 박사 장학금으로 지원되었습니다. 및 SFRH/BD/135725/2018 및 SFRH/BD/51968/2012- 리타 알베스 안드레이아 고메스). 이 연구는 또한 NIH와 NYSTEM (1R01HL119404 및 카테리 A. 무어에 C32597GG)에서 자금에 의해 지원되었다.

이 프로토콜은 룬드 대학의 인간 연구 윤리위원회 지침에 따라 수행되었으며 개별 기관 지침에 따라 수행되어야합니다.
1. 시약 준비
<ol><li>덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)/20% 태아 소 혈청(FBS)의 경우, 20% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(펜/스트렙), 1% L-글루타민, 1% 비필수 아미노산 및 10%의 필수 아미노산을함유하고 있는 고혈당 DMEM을 혼합하십시오. 메르카포에탄올.</li>
	<li>완전한 DMEM을 원하세요, 피루베이 나트륨을 함유한 고혈당 DMEM을 10% FBS, 1% 펜/스트렙, 1% L-글루타민과 섞으세요.</li>
	<li>조혈 매체의 경우 조혈 매체(재료 표)를10-6 M 하이드로 코르티손과 1 % 펜 / 스트렙과 섞습니다.</li>
	<li>칼슘이나 마그네슘없이 인산염 완충식염수(PBS)를 사용하십시오.</li>
</ol>2. 인간 진피 섬유아세포 분리
참고: HDF는 인증 된 공급 업체(재료 표)에서구입할 수 있습니다. 이 경우 섬유 아아를 확장하고 재프로그래밍 실험에 직접 사용합니다 (섹션 4). 또는, HDF는 기증자로부터 격리될 수 있다. 섬유아세포가 상이한 공여자로부터 분리되는 경우, 프로토콜의 모든 단계에서 샘플을 서로 분리된 상태로 유지한다. 각 기증자의 식별 번호가 있는 플레이트/우물 및 수집 튜브에 라벨을 붙입니다.
<ol><li>자격을 갖춘 의사가 수행한 3mm 라운드 피부 펀치 생검에서 HDF를 획득하십시오.</li>
	<li>0.1% 젤라틴의 500 μL로 처리된 조직 배양 6웰 플레이트의 3개의 웰을 코팅하고 37°C에서 20분 동안 배양하였다.</li>
	<li>나머지 젤라틴 용액을 흡인하고 각각의 우물에 750 μL의 DMEM/20% FBS를 추가합니다. 우물의 전체 표면은 매체로 덮여있어야합니다.</li>
	<li>멸균 된 100mm 페트리 접시 뚜껑의 내부 표면에 1.5 mL의 DMEM / 20 % FBS를 추가하고 5 mL 의 혈청학적 파이펫을 사용하여 방울을 확산시다.</li>
	<li>살균 된 집게로 뚜껑의 배지에 피부 생검을 놓습니다.</li>
	<li>피부 생검을 9개의 동일한 섹션으로 해부하고, 한 개의 멸균된 메스를 사용하여 생검을 제자리에 고정시키고 두 번째 메스를 잘라냅니다.</li>
	<li>뾰족한 집게를 사용하여 잘 당 3개의 생검 조각을 놓습니다. 조각이 우물의 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>조각 위에 22mm 커버 슬립을 놓고 약간의 압력을 가합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C, 5%CO2에서1주일 동안 배양합니다. 매일 세포를 확인하고 증발 된 매체를 대체하기 위해 2 일마다 200 μL의 DMEM / 20 % FBS를 추가하십시오.</li>
	<li>1주일 후, DMEM/20% FBS 의 2mL까지 추가하고 2-3일마다 배지를 교체하십시오.</li>
	<li>
우물이 수렴 될 때 1 :4 비율에서 통로 세포 (약 4-8 주).
	<ol>
<li>0.1% 젤라틴 코팅 조직 배양 처리 된 6 웰 플레이트를 준비합니다.</li>
		<li>80 % 동률에서 우물에서 배지를 흡인하고 PBS의 1 mL로 한 번 씻어.</li>
		<li>멸균 집게로 커버슬립을 제거하고 커버슬립을 티슈 쪽을 위로 올려 놓고 6웰 플레이트의 새로운 우물에 넣습니다. 참고: 커버 슬립에 부착 된 남아있는 세포도 수확됩니다.</li>
		<li>500 μL의 해리 액을 추가(재료의 표)웰 당 (커버 립 우물 포함) 및 37 °C에서 배양, 5 %CO2 에 대한 5-10 분. 세포가 우물의 바닥에서 상승하기 시작하고 해리 솔루션을 비활성화 할 때 확인 각 우물에 500 μL의 DMEM/20% FBS를 추가합니다.</li>
		<li>모든 우물에서 섬유아아아를 15 mL 원엽 튜브로 수집합니다. 우물에 여분의 매체를 추가하여 나머지 셀을 수집합니다. 튜브를 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
		<li>그 동안, 이전에 젤라틴 코팅 플레이트의 각 웰에 500 μL의 DMEM/20% FBS를 추가합니다.</li>
		<li>흡인 배지 및 DMEM/20% FBS의 6 mL에서 섬유아세포를 재중단.</li>
		<li>각 우물에 500 μL의 섬유아세포 현탁액을 추가합니다(총 샘플/공여자 당 6웰 플레이트 2개). 37°C, 5%CO2에서밤새 세포를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 날, 각 우물에 DMEM/20% FBS 1mL를 추가합니다. 우물이 80% 더 잘 될 때까지 매 2-3일마다 2mL의 DMEM/20% FBS로 중간을 교체하십시오.</li>
	<li>세 번째 통로에 도달 할 때까지 세 개의 동시 우물에 대한 섹션 2.11을 반복합니다.</li>
	<li>
수렴 웰 (구절 1 및 3)에서 섬유 아세포를 동결.
	<ol>
<li>우물에서 배지를 흡인하고 PBS 1 mL로 한 번 씻으하십시오.</li>
		<li>단계 2.11.4 및 2.11.5에 기재된 바와 같이 섬유아세포를 해리하고 수집한다.</li>
		<li>혈세포계로 세포를 카운트하고 튜브를 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
		<li>원심 분리 후, 배지를 흡인하고 5 x 105 세포 / mL의 밀도로 10 % DMSO로 FBS에서 섬유 아세포를 재중단합니다.</li>
		<li>냉동 용기를 사용하여 -80°C에서 밤새 저온 및 동결 세포당 1 mL의 셀 현탁액을 추가합니다. 바이알을 -150°C(액체 질소)로 이동하여 장기간 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 렌티바이러스 생산
<ol><li>HEK293T 세포를 완전한 DMEM 10 mL로 100 mm 조직 배양 처리 접시에 37°C, 5%CO2에서,합류가 될 때까지 성장시다.</li>
	<li>형질전환 전날, 배지를 흡인하고 PBS 5 mL로 조심스럽게 접시를 씻습니다.</li>
	<li>PBS를 제거한 후, 1.5 mL의 해리액을 추가하고 37°C에서 배양하고, 5%의CO2를 5-10분 동안 배양하여 접시에서 세포를 해리한다. 참고: 사용하기 전에 PBS와 해리 액을 모두 따뜻하게하여 세포가 열 충격을 받지 않도록하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>완전한 DMEM의 3 mL로 해리 솔루션을 비활성화하고 셀 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 전달합니다. 5 mL의 완전한 DMEM으로 접시를 씻어 남은 부착 된 세포를 제거하고이 볼륨을 15 mL 원엽 튜브로 옮김하십시오.</li>
	<li>원심분리기 세포 현탁액을 350 x g에서 5 분 동안.</li>
	<li>흡위판 및 세포 펠릿을 접시당 10 mL의 최종 부피에서 6개의 100 mm 조직 배양 처리 된 접시 사이에 고르게 분할한다. 세포는 형질전환시 약 60%가 동률이어야 한다.</li>
	<li>다음 날, 플라스미드와 함께 트랜스펙트 세포는 다음과 같이 혼합한다: 참고: 이 프로토콜의 부분은 플라스미드 믹스당 100 mm 조직 배양 처리 된 접시에서 렌티 바이러스의 생산을 설명합니다. 농도에 대한 렌티 바이러스 상판의 더 높은 볼륨을 얻으려면, 혼합 당 적어도 4 개의 100 mm HEK293T 세포 배양 접시를 사용하십시오.<ol>
<li>15 mL 원추형 튜브에, 함께 세 전송 플라스미드의 10 μg를 추가 : pFUW-tetO-GATA2 (아드진 플라스미드 #125028)14,3.33 μg의 pFUW-tetO-GFI1B (아제네#125597)14 및 3.33μg의 pFUW-teO-#125598 10 μg의2세대 psPAX2 패키징 벡터는 VSV-G 유전자를 인코딩하는 개그, 폴, 타트 및 레브 유전자(Addgene #12260) 및 5 μg의 pMD2.G 봉투 벡터를 인코딩(Addgene #12259). 최대 500 μL까지 물을 추가합니다.</li>
		<li>2개의 새로운 15 mL 원추형 튜브에서 FUW-M2rtTA 플라스미드(Addgene #20342)17,psPAX2 포장 벡터 10 μg 및 각 튜브에 pMD2.G 봉투 벡터 5 μg를 추가합니다. 최대 500 μL까지 물을 추가합니다. 하나의 튜브는 대조군으로 사용될 것입니다.</li>
		<li>각 튜브에 2 M CaCl2의62.5 μL을 추가합니다. 다음으로, 파이펫 컨트롤러에 삽입된 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 혼합물에 기포를 방출합니다. 기포가 형성되는 동안, 피펫 500 μL의 N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-아미노에탄설포닉산 (BES) 완충식염수 (pH 7.1, 25 °C), P1000 파이펫, 파스퇴르 피펫에 대한 드롭 와이즈 및 혼합물에.</li>
		<li>적어도 15 분 동안 실온에서 튜브를 인큐베이트. 혼합물은 약간의 시간이 지나면 약간 흐린 것처럼 보입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>한편, HEK293T 세포 접시(전날 통과)에서 배지를 흡인하고 항생제 없이 완전한 DMEM 10 mL을 첨가한다. HEK293T 세포가 반부착이기 때문에 주의하고 천천히 매체를 추가하십시오.</li>
	<li>각 개별 혼합물(약 1 mL)을 골고루 분배하고 드롭 와이즈를 별도의 접시에 넣고 37°C, 5%CO2에서밤새 배양한다.</li>
	<li>배지를 완전한 DMEM 4 mL로 교체하고, 배양 후 24시간 동안 교체하십시오. 37 °C, 5%CO2에서밤새 배양한다. 가능한 경우, 32°C, 5%CO2에서대신 배양하고, 감소된 온도는 렌티바이러스 입자의 반감기를 증가시킬 것이다.</li>
	<li>50 mL 원엽 튜브에 렌티 바이러스 입자와 상류를 세 번 수집합니다. 이 시점에서 다른 렌티 바이러스 입자를 혼합하지 마십시오. 각 요리는 렌티 바이러스 상피의 12 mL귀착됩니다. 동일한 바이러스 제제의 네 가지 요리는 하나의 50 mL 원뿔 튜브에 맞습니다. 주의: 렌티바이러스 작업 전용 의 생물 안전 수준-2 실험실에서 렌티바이러스 수집을 수행하고 생체 유해 물질에 적합한 용기에 바이러스 성 오염 폐기물 (튜브, 팁, 접시)을 놓습니다.<ol>
<li>마지막 배양 후 첫 번째 컬렉션 16 h를 수행 하 고 전체 DMEM의 4 mL를 추가 합니다. 37 °C, 5 %CO2에서배양.</li>
		<li>동일한 튜브에 제1 후 8시간 후 제2 수집을 하고, 완전한 DMEM 4 mL을 추가하고 37°C, 5%CO2에서배양한다.</li>
		<li>세 번째 컬렉션 16 h 같은 튜브에 두 번째 후 수행 하 고 접시를 폐기. 참고: 렌티바이러스 초월제를 각 수집 후 4°C에서 저장한다.</li>
	</ol></li>
	<li>셀룰로오스 아세테이트 멤브레인(Tableof Materials)을사용하여 0.45 μm의 저단백 결합 필터를 사용하여 각 렌티바이러스 상류자를 깨끗한 튜브에 걸러.</li>
	<li>재생된 셀룰로오스 멤브레인(재료표)이있는 원심 필터 장치에 최대 15mL의 여과 된 상구를 추가하고 4 °C에서 25 분 동안 4,000 x g에서 회전하십시오. 흐름을 통해 폐기합니다. 렌티바이러스를 함유한 점성 액체는 필터 장치에 남아 있습니다.</li>
	<li>필터 유닛 위에 15 mL의 상판을 추가하여 3.13 단계를 반복하고, 더 이상 렌티바이러스 상류가 남지 않습니다. 참고: 농축하는 상급의 몇 밀리리터가있을 때, 10 분회전 시간을 줄입니다. 필터에 여분의 액체(점도가 없는)가 있으면 원심분리기를 10분 간 추가로 사용하십시오.</li>
	<li>농축 렌티바이러스의 각 유형의 aliquots (초기 상층 부피에 따라 50-200 μL)를 만들고 장기 보관을 위해 -80 °C (1-2 년) 또는 단기 저장 (1-2 주)에 4 °C에서 보관하십시오. 참고: 농축 또는 비 농축 렌티바이러스는 또한 신선한 사용할 수 있습니다. 다시 동결 및 해동하지 마십시오 이 감소 된 티터로 결과로.</li>
</ol>4. 혈생 리프로그래밍
참고: 3개(P3) 이상의 통로 번호가 있는 HDF를 사용하여 다시 프로그래밍 실험을 수행합니다.
<ol><li>100 mm 조직 배양 처리 접시를 0.1% 젤라틴 5 mL로 코팅하고 37°C에서 20분 동안 배양한다.</li>
	<li>0.1% 젤라틴 코팅 접시에 섬유아세포 바이알 및 플레이트 세포를 해동시켰다. 37 °C, 5%CO2에서밤새 배양한다. 필요한 경우, 원하는 통과와 합류에 도달 할 때까지 더 긴 기간 동안 섬유 아아를 확장하십시오.</li>
	<li>0.1% 젤라틴 용액의 500 μL로 6웰 조직 배양 처리 플레이트를 코팅하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>플레이트 HDF는 플레이트당 150,000개의 셀(웰당 25,000셀)의 밀도로 2 mL의 웰당 완전한 DMEM을 제공합니다. 37°C, 5%CO2에서밤새 배양하여 세포 부착을 허용합니다.</li>
	<li>중간 을 완전한 DMEM 2 mL와 8 μg / mL 폴리브렌으로 교체하십시오. 풀 생산 TF 렌티바이러스와 M2rtTA의 1:1 비율 혼합을 새로운 미세원심분리튜브에 준비한다. 참고: 이 프로토콜에서는 세 개의 TF에 대한 렌티바이러스풀 생산이 수행되어 저자의 손에 더 높은 리프로그래밍 효율을 초래합니다. 대안적으로, 표준 세포주 상에서 qPCR18에의한 개별 렌티바이러스 입자의 적정을 수행하는 것이 제안된다. 이는 동시 형질전환 및 혈생 재프로그래밍에 최적 감염(MOI)의 복합성을 충족하는 데 필요한 개별 바이러스의 부피를 정의하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>잘 당 렌티 바이러스 혼합물의 10 ~ 100 μL을 배포, HDF를 변환합니다. 이것은 리프로그래밍의 일 -2입니다. 참고: 효율적인 리프로그래밍을 위해 렌티바이러스 혼합물의 최적 부피를 정의하려면 세포 생존력을 저하시키지 않으면서 최적화가 필요합니다(자세한 내용은 추가 그림 1 참조). 7개 이상의 대구를 가진 HDF는 더 낮은 통로를 가진 세포 보다는 바이러스의 더 높은 양을 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>16 시간 의 배양 후 바이러스를 제거하고 완전한 DMEM을 추가하십시오. 세포가 6-8 시간 동안 회복되도록 하십시오.</li>
	<li>회복 후 배지를 흡인하고 8 μg/ mL 폴리브렌으로 완전한 DMEM 2 mL을 추가하십시오.</li>
	<li>단계 4.6에 기재된 바와 같이 제2 트랜스덕션을 하고 16시간 동안 37°C, 5%CO2에서 배양한다. 이것은 리프로그래밍의 날 -1입니다. 렌티바이러스 혼합물은 두 환원 모두에 대해 -2일째에 제조될 수 있고 4°C에서 유지될 수 있다.</li>
	<li>다음 날, 바이러스를 제거하고 1 μg/mL DOX로 보충된 완전한 DMEM을 추가하십시오. 이것은 리프로그래밍의 날 0입니다. 37°C에서 배양, 5%CO2대 48시간.</li>
	<li>
리프로그래밍 의 2 일째에, 1:2 비율로 각 잘 분할.
	<ol>
<li>PBS의 1 mL로 배지 및 세척 세포를 흡인한다.</li>
		<li>PBS를 흡인하고 500 μL의 해리 용액으로 세포를 해리한다. 37 °C에서 5-10 분, 5 %CO2에서배양하십시오.</li>
		<li>완전한 DMEM 의 1 mL로 해리 솔루션을 비활성화하고 원점 튜브로 세포를 수집합니다. 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>펠릿을 조혈 배지(1.3단계 참조)에 다시 중단하고, 1 μg/mL DOX로 보충하고, 플레이트 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 새로운 조직 배양 처리된 6웰 플레이트에 웰당 2 mL의 최종 부피를 보충하였다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재프로그래밍 배양기간(25일)의 기간 동안 주 2회 배지(조혈 배지+DOX)를 변경한다.</li>
	<li>브라이트필드 또는 형광 현미경검사법으로 서로 다른 시점에서 재프로그래밍된 세포를 분석(보충 세포분석, 대량 및 단세포 RNA 시퀀싱, 및 이식 분석법) 획득을 위한 분석 조혈 형태학, 내피 및 조혈 마커의 존재, 내피 /조혈 유전자 발현 프로필 및 재생 용량의 취득14.</li>
</ol>5. 혈우병 재프로그래밍 의 개시시 ChIP-seq 분석을 위한 섬유아세포 확장의 최적화
<ol><li>플레이트 300,000 HDFs (&P8)는 0.1% 젤라틴 코팅 조직 배양 처리된 6웰 플레이트에 완전한 DMEM을 사용하여 웰당 2 mL의 최종 부피를 갖는다. 37 °C, 5%CO2에서밤새 배양한다.</li>
	<li>다음 날, 배지를 8 μg/mL 폴리브렌으로 보충한 완전한 DMEM으로 교체하십시오.</li>
	<li>개별 적인 요인을 가진 세포를 변환합니다: pFUW-tetO-FOS14,pLV-tetO-HA-GFI1B (addgene #125599)14 및 pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 또는 1:1 비율의 FUW-M2rtTA를 더한 세 가지 요인의 풀. 10-20 μL 총 바이러스 (개별 TF + M2rtTA 또는 3 개의 TF + M2rtTA)를 사용하십시오. 37°C, 5%CO2에서밤새 세포를 배양한다. 참고: 조건당 12개의 6웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다(각 개별 TF와 3개의 TF가 결합된 경우).</li>
	<li>렌티바이러스를 제거하고 첫 번째 전환 후 완전한 DMEM 16h를 추가합니다. 세포가 6-8 시간 동안 회복시키십시오.</li>
	<li>조건당 동일한 양의 바이러스로 세포를 두 번째로 트랜스듀싱하고 37°C, 5%CO2에서배양한다.</li>
	<li>다음 날에 바이러스를 제거하고 완전한 DMEM을 추가합니다. 37°C에서 배양하고, 24시간 동안 5%CO2를 배양한다.</li>
	<li>각 웰을 0.1% 젤라틴 코팅 조직 배양-처리된 100 mm 접시에 완전한 DMEM을 접시당 최종 부피 10 mL로 재플레이트한다. 이것은 대략 1:6 구절을 나타냅니다.</li>
	<li>세포가 37 °C, 5 %CO2에서6 일 동안 자랄 수 있게하십시오.</li>
	<li>재도금 후 6일째에 배지를 흡인하고 1 μg/mL DOX로 완전한 DMEM을 추가합니다. 37°C에서 세포를 배양하고, 5%CO2를 2일 동안 배양한다.</li>
	<li>섬유아세포를 수집하고 DOX 보충제14일후 ChIP-seq에 의해 개별적으로 또는 조합하여 변환된 3개의 TFs의 게놈 결합 부위를 분석한다. 참고: 최종 72 개의 100mm 요리는 ChIP-seq 실험을 수행하고 복제하기에 충분한 20-50 x 106 셀을 포함합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+potent+human+hematopoietic+stem+cells+first+emerge+in+the+intraembryonic+aorta-gonad-mesonephros+region.">Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).</li><li>Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., P&#233;ault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+human+hematopoiesis.">Embryonic origin of human hematopoiesis.</a> International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).</li><li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system:+advances+and+questions.">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138, 1017-1031 (2011).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Daniel, M. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+Reprogramming+In+vitro+Informs+In+Vivo+Identification+of+Hemogenic+Precursors+to+Definitive+Hematopoietic+Stem+Cells.">Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Single+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+Capable+of+Long-Term+Multilineage+Engraftment.">Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment.</a> Science. 333, 218-221 (2011).</li><li>Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., P&#233;ault, B., Tavian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+(CD143)+specifies+emerging+lympho-hematopoietic+progenitors+in+the+human+embryo.">Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo.</a> Blood. 119, 3712-3724 (2012).</li><li>Gomes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Transcription+Factor+Induction+Mediates+Hemogenic+Reprogramming.">Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming.</a> Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).</li><li>Karlsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+The+Tetraspanin+CD9+Affords+High-Purity+Capture+of+All+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells.">Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Reports. 4, 642-648 (2013).</li><li>Leung, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetraspanin+CD9+regulates+migration,+adhesion,+and+homing+of+human+cord+blood+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 117, 1840-1851 (2011).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency.">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).</li><li>Kutner, R. 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S., Suzuki, Y., Ke, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulatable+Lentiviral+Vector+System.">Gene Regulatable Lentiviral Vector System.</a> Viral Gene Therapy. , (2011).</li><li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors.">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157, 549-564 (2014).</li><li>Lis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+endothelium+to+immunocompetent+haematopoietic+stem+cells.">Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells.</a> Nature. 545, 439-445 (2017).</li><li>Pereira, C., Lemischka, I. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Signatures+of+Tissue-Specific+Microvascular+Endothelial+Cell+Heterogeneity+in+Organ+Maintenance+and+Regeneration.">Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration.</a> Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Murine+Fibroblasts+to+Hematopoietic+Progenitor+Cells.">Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells.</a> Cell Reports. 9, 1871 (2014).</li><li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mouse+fibroblasts+into+engraftable+myeloerythroid+and+lymphoid+progenitors.">Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors.</a> Nature Communications. 7, 1-15 (2016).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본 문서에서, 방법은 HP 세포 중간체를 통과하는 인간 섬유아세포로부터 직접 조혈 전구 세포를 생성하는 방법, 유사하게 최종 HSCs14와유사하게 기술된다.
GATA2, GFI1B 및 FOS를 인코딩하는 렌티바이러스 입자의 풀 생산은 개별 생산보다 선호되었으며, 이는 우리의 손에서 더 높은 재프로그래밍 효율성(미공개 데이터)을 초래하기 때문에 개별 생산보다 선호되었습니다. 렌티바이러스는 레트로비리대 가족의 일원으로서 일반적으로 양성 단일 가닥 RNA19의2개의 사본을 포함합니다. 증가된 재프로그래밍 효율은 동일한 렌티바이러스 입자에서 2개의 상이한 트랜스유전자의 패키징으로 인해 3개의 전사 인자와 병용화되는 세포의 수가 증가하기 때문일 수 있다. 이 프로토콜의 성공을 보장하기 위해, 4.6 단계에서 권장되는 바와 같이, 재프로그래밍 효율과 세포 생존 사이의 최적의 균형을 얻기 위해 세포 통로에 따라 바이러스의 적절한 양으로 HDF를 변환할 필요가있다. 또한 신선한 비 농축 바이러스를 사용할 수 있습니다. 3Fs 풀 및 M2rtTA의 0.5-3 mL로 셀을 변환하는 것이 좋습니다. 또한, 세포 밀도는 응용 프로그램에 따라 조정되어야한다. 6웰 플레이트당 150 000 의 HDFs(단계 4.4)는 재프로그래밍된 세포의 FACS, 이식 및 유동 세포 분석 분석을 수행하기 위한 최적의 밀도를 제공하였다. ChIP-seq 실험의 경우, 처음부터 더 많은 세포가 필요하였다(5.1단계). 형태학적 변화를 위해 정기적으로 세포를 확인하고 유도 된 조혈 세포의 출현을 지원하기 위해 일주일에 두 번 조혈 배지를 대체하는 것이 중요합니다. 피더 층에 조혈 사이토카인 또는 공동 배양을 첨가하여 재프로그래밍 효율을 높일 수 있다.
이 방법을 사용하면 조혈 재프로그래밍 중에 동적으로 표현되는 새로운 조혈 마커를 식별 할 수 있습니다. CD9는 전사 수준14에서재프로그래밍된 세포에서 업 조절되는 것으로 나타났으며, CD49f 및 CD143과 함께 재프로그래밍의 초기 단계에서 세포 표면에서 빠르게 발현되며, 인간 HSC 전구체의 새로운 마커역할을 한다. 또한 ITGA6와 ACE는 CD9 및 CD3414외에도 혈혈 재프로그래밍의 초기 단계에서 GATA2의 직접적인 표적임을 보여주며 인간 혈혈성 간의 직접적인 기계적 연결을 제공합니다. 전구체 표현형 및 GATA2.
이 시스템의 한 가지 장점은 상대적으로 균일 한 섬유 아세포 배양물의 사용에 있습니다. PSC가 시험관 내에서쉽게 확장되고 유지되는 동안, 분화 프로토콜은 조혈 전구를 포함하는 이질적인 집단을 생성하며,이는5,6,7을제대로 이식한다. 더욱이, PSC 유래 HSPC를 이식할 때 종양발생의 위험이 있습니다, 미분화 PSCs는 분화 프로토콜을 채택한 후에도 문화에 아직도 남아 있을 수 있기 때문에. 대안적으로 섬유아세포에, HSC에 직접 재프로그래밍하는 것은혈액-전구(20) 및 내피세포(21)에적용되었다. 그러나, 혈액 제한 전구 세포로 시작하여 환자가 줄기/전구 조혈 집단22에영향을 미치는 돌연변이를 운반하는 경우 생성된 HSC의 치료 적용을 방해한다. 내피 세포의 경우, 이들은 섬유아세포에 비해 수득하기가 더 어렵고, 장기 의존성23인표현형, 기능 및 구조면에서 매우 이질적인 세포 집단을 구성한다. 다른 연구는 생착식 조혈 전구체24,25로 마우스 섬유아세포를 재프로그래밍하는 데 성공했지만, 지금까지 인간 섬유아세포로부터 HSPC 유사 세포의 생성을 설명하는 다른 프로토콜은 없다.
이러한 접근법은 약리학적 억제, 유전자 녹아웃 또는 노크다운 허가와 결합하여 인간 HSC를 직접 유도하는 데 필요한 인자의 개별 또는 조합을 정의하는 것을 허가합니다. RE프로그래밍 에 앞서 HDF의 CRISPR-Cas9 기술은 인간의 최종 조혈에 대한 새로운 규제 기관을 정의하기 위한 흥미로운 노력을 나타냅니다. 미래에는 섬유아세포와 같은 비혈액 관련 인간 세포 유형을 재프로그래밍하여 임상 적용을 위한 건강한 환자 맞춤형 조혈 전구 세포를 생성하는 플랫폼역할을 할 것입니다.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.
The second author affiliation was&#160;updated from:
2Wallenberg Center for Molecular, Lund University
to:
2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.

Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

확정된 조혈줄기 및 전구세포(HSPC)는 대동맥-고나드-메소네프로스(AGM) 부위와 내피전구체로부터 의태반에서 나타나며, 내피-투-포포포비틱 전이를 통해(EHT)1, 2. 혈생 전구체 (HPs)는 내피 및 조혈 마커를 모두 표현하지만, 그들의 정확한 식별은 특히 인간 시스템에서 애매하게 남아 있습니다. 포유류에서 비교적 보존된 과정임에도 불구하고, 조혈줄기세포(HSC) 발달은 여전히 인간과 마우스모델3,4사이에 유의하게 다르다. 따라서, 인간 HSC 개발을 재현하기 위한 시험관내 접근법이 필요하다.
만능 줄기 세포 (PSCs)를 HSC로 분화하는 것은 유망하지만 지난 20 년 동안 제한된 성공을 거두었으며, 주로 사용 가능한 분화 프로토콜로 인해 생착이 불량한 원시 조혈 전구를 초래합니다. 능력5,6,7. 대안적으로, 직접 세포 리프로그래밍 방법론은 전사 인자(TFs)8,9를사용하여 여러 세포 유형으로부터 HSPC 유사 세포를 생성하기 위해 적용되었다. 특히, 3개의 TFs, Gata2, Gfi1b 및 cFos의 과발현은, 정의된 표현형을 가진 HP 중간체를 통해 HSPC로 마우스 배아 섬유아세포로 변환(Prom1+Sca-1+CD34+CD45-)10. 이 과정은 확실한 조혈의 명세서 도중, 태아와 태반에서 생기는 EHT를 닮았다. 이러한 표현형은 마우스 태반에서 HPs의 집단의 식별 및 격리를 가능하게 하여 단기 배양 및 노치 활성화 후 연속적으로 이식가능한HSCs(11)를생성했다.
지금까지 인간 HSC와 전구체를 구별하는 표현형이 확립되지 않았지만 일부 분자는 신흥 HSC에서 발현되는 것으로 알려져 있습니다. HSC구획(12)에서세포는, 안지오텐신 변환 효소(ACE 또는 CD143)가 배아 혈액 형성조직(13)에서CD34 음성 조혈 전구체에 존재한다.
최근, 우리는 3개의 TFs, GATA2, FOS 및 GFI1B의 인간 버전이 단기 생착 용량14를가진 HPs로 인간 진피 섬유아세포(HDFs)를 재프로그래밍한다는 것을 입증하였다. 재프로그래밍의 초기 단계에서, GATA2는 오픈 크로마틴을 종사하고 섬유 아세포 유전자를 억압하고 내피 및 조혈 유전자를 활성화하기 위해 GFI1B와 FOS를 모집합니다. 유도된 세포는 고도로 발현된 CD49f 및 ACE, 및 HSPC 마커 CD34를 발현하는 세포의 작은 백분율을 함유하였다. HSCs15에서 발현되고 HSC 호밍16에중요한 CD9 유전자는, GATA2의 직접적인 표적및 재프로그래밍된세포(14)에서가장 상향 조절된 유전자 들 사이에서 나타났다. CD9는 따라서 인간 결정적인 조혈의 HPs를 위한 추가 마커를 구성할 수 있습니다.
이 프로토콜에서, 우리는 GATA2, GFI1B 및 FOS의 강제 발현을 통해 인간 섬유아세포에서 HSPC 유사 세포의 생성뿐만 아니라 염색질 면역 침전 (ChIP)-시퀀싱 (seq) 분석을 개시시 에 대해 설명합니다. 프로그래밍. TFs는 테트라사이클린 반응 요소(TRE) 및 최소 CMV 프로모터를 포함하는 독시사이클린(DOX)-유도성 렌티바이러스 벡터(pFUW-tetO)로 인코딩되었고, 역테트라사이클린을 함유하는 구성 벡터와 함께 트랜스플로브되었다. 형질전환기 단백질 (pFUW-M2rtTA). DOX (테트라 사이클린의 아날로그)가 전이 후 추가될 때, 그것은 TF 전사를 허용하는 TRE와 상호 작용하는 rtTA 단백질에 결합한다 (Tet-On 시스템). 이 절차를 완료하는 데 25 일이 필요합니다. ChIP-seq 실험의 경우, GATA2(pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) 및 GFI1B(pLV-tetO-HA-GFI1B)의 태그가 지정된 버전으로 FF를 변환하였고, pFUW-tetO-FOS 및 TF 결합 부위는 DOX 보충 후 이틀 후에 분석되었다.
궁극적으로, 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍은 미래의 임상 적용을 위한 인간 발달 조혈의 근본적인 메커니즘과 환자 특정 HSPC의 잠재적인 공급원을 연구하는 시험관내 관할 시스템을 제공한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#430625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>#343518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#14280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC903096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1X) no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate (DOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#25-0495-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUW-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from Porcine Skin Type A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematopoietic medium, MyeloCult H5100</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#05150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Fibroblasts (HDFs)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>#2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution (Pen/Strep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SH30256.01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>#312105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-FOS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-GATA2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-GFI1B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV-tetO-HA-GFI1B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic reprogramming of human fibroblasts by enforced expression of transcription factors

인간 조혈 줄기 세포 (HSCs)의 기본 사양의 세포 및 분자 메커니즘은 애매 남아있다. 시험관에서 인간 HSC 출현을 재현하는 전략은 이 복잡한 발달 과정을 공부에 있는 한계를 극복하기 위하여 요구됩니다. 여기서, 우리는 직접 적인 세포 재프로그래밍 접근법을 채택하는 인간 진피 섬유아세포로부터 조혈줄기 및 전구유사 세포를 생성하는 프로토콜을 기술한다. 이들 세포는 HSC 사양의 내피-투-조혈 전이(EHT) 특성을 닮은 혈생 중간 세포 유형을 통해 전달된다. 섬유아세포는 GATA2, GFI1B 및 FOS 전사 인자를 가진 형질전환을 통해 혈생 세포로 재프로그래밍하였다. 3개의 요인의 조합은 형태학적 변화를 유도, 혈생 및 조혈 마커및 동적 EHT 전사 프로그램의 발현. 다시 프로그램된 세포는 조혈 자손을 생성하고 3 개월 동안 면역 결핍 마우스를 다시 채웁니다. 이 프로토콜은 재프로그래밍의 초기 단계에서 GATA2 표적을 정의함으로써 여기서 예시된 바와 같이 인간 EHT 프로세스의 기계적 해부로 적응될 수 있다. 따라서, 인간 혈우병 재프로그래밍은 인간 HSC 출현의 새로운 마커 및 조절자를 식별하는 간단하고 견인 가능한 접근 방식을 제공한다. 미래에, 섬유아세포에 있는 혈생 운명의 충실한 유도는 이식을 위한 환자 특정 HSC의 생성으로 이끌어 낼 수 있습니다.

HDF를 사용하는 리프로그래밍 접근 방식의 개략적 표현은 그림 1A에나와 있습니다. 섬유아세포는 상업적인 근원에게서 취득되거나 인간 기증자에게서 집합되고 재프로그래밍이전에 시험관외에서 확장됩니다. 도금 후, 세포는 GATA2, GFI1B 및 FOS (및 M2rtTA) 렌티바이러스로 두 번 변환되고, 독시 사이클린은 리프로그래밍의 0 일째에 추가됩니다. 2일째에 세포는 배양 25일째까지 조혈 배지로 분할및 도금된다. 재프로그래밍된 세포는 정제된 세포 집단의 면역 손상 마우스, 단세포 RNA-시퀀싱(scRNA-seq)의 이식을 포함한 여러 응용 분야에 대해 상이한 시점에서 생성될 수 있다(2일째, 15일째 15CD49f+ CD34 및 일 25 CD49f+CD34+ 세포), 뿐만 아니라 현미경 및 세포 표면 마커 CD49f, CD34, CD9 및 CD143에 대한 유세포 분석. 대표적인 세포분석 플롯은 25일 간의 재프로그래밍 후 CD49f 및 CD9(도1B, 좌측 패널)를모두 발현하는 재프로그래밍 된 세포의 ~17%를 나타낸다. 이중 양성 세포의 대다수는 CD143 (~86%)을 표현하고, 작은 인구는 CD34 (0.9%)를 표현하고, 동적 혈생 운명 유도를 건의합니다. 이러한 마커는 25일 동안 배양된 M2rtTA 변환 형 HDF에서 활성화되지않는다(그림 1B, 우측 패널). 면역형광 이미지는 부착 및 원형 세포에서 CD9 및 CD143의 발현을 확인하며, 이들 마커에 대해 음성인 섬유아세포와 형태학적으로 구별된다(도1C). 인간의 혈우병 식민지는 또한 CD49f 및 CD3414를표현한다. HDFs의 ScRNA-seq 분석, 2일째 분류되지 않은 세포, 및 정제된 재프로그래밍 된 세포는 15일째(CD49f+CD34-) 및 25일째(CD49f+CD34+)에서 단계별 증가를 나타내며, 2일째부터 25일째까지CD49f, CD9 및 CD143 발현을 단계적으로 증가시켰다. CD49f 및 CD9 양성 세포는 2일째와 15일 사이에 재프로그래밍 과정 중에 먼저 나타나며, 이는 이러한 분자가 초기 인간 혈형성의 마커를 나타낼 수 있음을 나타낸다. CD143 발현은 15일째에 검출되기 시작하고 CD34 발현 세포는 나중 시점(25일째)에만 검출된다. CD34+ 탯줄 혈액(UCB) 세포를 참고자료로 사용하였다(도1D).
도 2A는 혈생 리프로그래밍의 초기 단계에서 ChIP-seq 분석을 위한 충분한 수의 세포를 생성하도록 변형된 프로토콜을 기술한다(2일째). 첫째, HDF는 표준 프로토콜(300,000셀 대 플레이트당 150,000셀)보다 2배 높은 밀도로 도금됩니다. 전환 후, 각 우물은 DOX로 배지를 보충하기 전에 세포가 6 일 동안 확장 할 수 있도록 100mm 접시로 다시 도금됩니다. 세포는 DOX 및 결과적인 TF 발현을 추가한 후 2일 후에 분석된다. 그림 2B는 세포가 3가지 인자(3Fs) 또는 GATA2와 개별적으로 병용될 때 ITGA6 및 ACE의 게놈 조절 영역에 결합하는 GATA2의 게놈 브라우저 프로파일을 나타낸다. GATA2는 또한 CD9및 CD34 유전자14의크로마틴 지구를 열기 위하여 묶습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig1a.jpg"> 그림 1: 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 운명의 유도. (a)인간 진피 섬유아세포(HDF)의 혈혈성 재프로그래밍을 위한 실험 전략. 피부 펀치 생검에서 섬유 아세포는 기증자로부터 수집, 확장 및 GATA2, GFI1B, FOS 및 M2rtTA 렌티 바이러스로 변환. 독시사이클린(DOX)은 리프로그래밍의 0일째에 배양에 첨가되고 세포는 25일째까지 여러 시점에서 분석된다. scRNA-seq, 단세포 RNA-시퀀싱. FACS, 형광 활성화 세포 분류. (B)3개의 전사 인자(3Fs)를 가진 형질전환 후 25일째에 유세포측정에 의한 혈혈/조혈 마커의 발현을 평가하는 데 사용되는 게이팅 전략. 세포 분석 플롯은 CD49f 및 CD9에 대한 이중 양성 세포의 백분율을 보여, 라이브 셀 집단에서 게이트 (DAPI 음성). 이중 양성 인구 내에서 CD143 및 CD34의 발현이 도시됩니다. 동일한 배양 조건하에서 M2rtTA 바이러스로만 트랜스듀렉된 HDF는 대조군으로 사용된다. (C)25일째의 면역형광 이미지는 CD9(상부 패널) 및 CD143(하부 패널)의 발현을 확인한 콜로니를 재프로그래밍하였다. 세포는항체(재료표)로염색하여 마우스 혈청으로 PBS/2% FBS에서 1:100 희석하고, 37°C에서 20분, 5%의CO2를배양하고, 3회 세척하고 PBS/2% FBS로 심하였다. 위상, 위상 그라데이션 대비. 스케일 바 = 50 μm.(D)상이한 시점에서 253개의 세포의 ScRNA-seq 분석. ITGA6, CD9, ACE 및 CD34의 발현은 리프로그래밍 중에 활성화됩니다. 세포는 2일째(분류되지 않은), 15일째(CD49f+CD34- ) 및 25일째(CD49f+CD34+ )에서 수집된다. HDF 및 CD34+ 탯줄 혈액 (34 + UCB) 세포는 참조로 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig02.jpg"> 그림 2: ChIP-seq 분석을 위한 인간 진피 섬유아세포의 팽창. (a)재프로그래밍 2일째에 ChIP-seq에 대한 고수된 인간 진피 섬유아세포(HDF)를 생성하기 위해 변형된 프로토콜을 묘사하는 실험 전략. 300,000 개의 셀은 6 웰 플레이트에 도금되고 개별 요인 (pFUW-tetO-FOS, pLV-tetO-HA-GFI1B 또는 pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) 또는 세 가지 요인 (플러스 M2rtTA)의 조합으로 두 번 변환됩니다. 바이러스를 제거 한 후 섬유 아세포는 100mm 요리에서 6 일 동안 확장됩니다. 독시사이클린(DOX)은 0일째에 첨가되고 세포는 DOX 첨가 후 이틀 후에 수집된다. (B)GATA2 결합 부위(회색 상자)를 ITGA6 및 ACE 로시에서 2일 후 3개의 전사 인자(3TFs) 또는 GATA2 단독으로 강조하는 게놈 브라우저 프로파일. 매핑된 총 읽기 수는 y축에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1.jpg"> 보충 그림 1: 효율적인 혈혈 재프로그래밍을 위해 최적화된 렌티바이러스 부피를 정의합니다. 농축된 부피(10 내지 100 μL)의 풀 생산 렌티바이러스 입자(3Fs: GATA2, GFI1B 및 FOS)는 M2rtTA와 함께 1:1의 비율로 인간 진피 섬유아세포(HDF)를 트랜스듀베이션하는 데 사용되며, 프로토콜의 4.5-4.12 단계를 따르게 된다. 재프로그래밍된 세포는 25일째에 분석되어 혈우병 재프로그래밍을 위한 최적의 형질전환 볼륨을 정의하고, 살아있는 세포에서 문이 닫힌 CD49f+CD9+ 셀의 백분율에 의해 주어진다(DAPI-음성). 세포 생존력은 25일째에 살아있는 세포의 절대 수를 정량화함으로써 평가될 수 있다. M2rtTA(100 μL)로 변환된 HDF는 음성 제어로 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2.jpg"> 보충 그림 2: 인간 진피 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍 도중 형태학적 변화. 인간 진피 섬유아세포(HDF) 배양체는 제1 트랜스덕션(일째-2)의 날에, DOX가 배양액(0일째), 2일(일째 2일) 및 15일째(15일째)에 첨가될 때, 그리고 DOX 보충 후, 및 실험의 종점(25일째)에 영상화된다. 15 일과 25 일의 혈혈 성 식민지가 강조 표시됩니다. 배율 막대 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

이 방법은 직접 세포 리프로그래밍을 기반으로 간단하고 가관 가능한 시험관 장 플랫폼을 제공함으로써 인간 조혈 개발을 연구하는 데 한계를 극복하는 데 도움이됩니다. 이 방법의 시각적 데모는 렌즈피바이러스 생산, 섬유아세포 트랜스듀션 및 세포 배양 중에 인간 혈전 세포를 생성하는 근본적인 단계에서 이상적인 지침을 제공합니다. 피부 섬유아세포를 혈우성 전구체로 전환함으로써, 우리는 줄기 세포 이식을 위한 충분한 수의 환자 특정 조혈 줄기 및 선조 세포를 생성하기를 희망합니다.HEK293T 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10밀리리터의 완전 DMEM으로 처리한 100mm 조직 배양에서 HEK293T 세포를 성장시키는 것으로 시작하십시오. 트랜스펙팅 전날, 배지를 심은 후, PBS의 5밀리리터로 조심스럽게 접시를 씻고 1.5 밀리리터의 해리용으로 세포를 분리한다. 섭씨 37도에서 5~10분 동안 배양한 후, 완전한 DMEM 3밀리리터로 용액을 비활성화하고 셀 서스펜션을 15밀리리터 원내 튜브로 전송합니다.5 밀리리터의 완전한 DMEM으로 접시를 씻어 남은 부착 된 세포를 제거하고 세포 용액으로 세척을 당깁니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 슈퍼나탈자를 흡인시키고, 완전한 DMEM의 6밀리리터에서 펠릿을 재보펜한다. 그런 다음, 6 개의 100 밀리미터 조직 배양 처리 된 접시 사이에 균일하게 현탁액을 접시 당 10 밀리리터의 최종 부피로 분할합니다.다음 날, 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브에 함께 세 개의 전송 플라스미드의 10 마이크로 그램 총 질량을 추가합니다. 다음으로, 개그, 폴, 타트 및 레브 유전자를 인코딩하는 psPAX2 패키징 벡터의 2세대 의 10 마이크로그램을 추가하고 5마이크로그램의 pMD2를 첨가한다. G 봉투 벡터는 VSV-G 유전자를 튜브에 인코딩한다.마지막으로 물을 추가하여 최종 부피를 500 마이크로리터에 넣습니다. 두 개의 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브에 FUW-M2rtTA 플라스미드 10 마이크로그램, 포장 벡터 10마이크로그램, 각 튜브에 5마이크로그램의 봉투 벡터를 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 500 마이크로리터의 최종 부피까지 물을 추가합니다.다음으로, 3개의 튜브 각각에 2개의 어금니 칼슘 염화칼슘62.5 마이크로리터를 추가하고 파스퇴르 파이펫이 장착된 파이펫 컨트롤러를 사용하여 각 혼합물에 거품을 방출합니다. 거품이 형성되는 동안, 베S 완충식식염수의 500 마이크로리터를 파스퇴르 파이펫에 대고 혼합물에 떨어뜨립니다. 혼합물이 약간 흐린 것처럼 보일 때까지 적어도 15 분 동안 실온에서 튜브를 배양하십시오.인큐베이션 하는 동안, 신중 하 게 HEK293T 세포 배양의 상체를 대체 10 항생제 없이 완전 DMEM의 밀리 리터. 개별 HEK293T 세포 배양 접시에 DNA 복합체를 나누어 24시간 동안 배양한다. 다음 날, 수퍼네이터를 문화당 완전한 DMEM 의 4밀리리터로 대체하고 하룻밤 사이에 37도 의 이산화탄소 세포 배양 배양으로 접시를 반환합니다.다음 날 아침, 접시 당 50 밀리리터 튜브에 슈퍼네이터를 수집하고 각 접시에 신선한 매체 4 밀리리터를 추가합니다. 8시간의 문화가 더 끝나면, 이전에 수확한 상체와 함께 각 요리에 상체를 풀을 짜고 신선한 매체의 4 밀리리터를 추가합니다. 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환하고 마지막 한 번 초월을 수집합니다.모든 바이러스가 수집되면, 각 렌즈바이러스 상체를 개별 튜브에 0.45 마이크로미터 저단백질 결합 필터를 필터링하고 원심 분리를 위해 개별 원심 필터 장치에 필터링된 상산체 의 최대 15 밀리리터를 추가합니다. 흐름을 폐기합니다. 액체를 함유한 점성 렌즈바이러스는 필터 장치에 남아 있습니다.모든 렌티바이러스 상체가 냉장 보관을 위해 농축 렌티바이러스의 50 내지 200 마이크로리터를 알리쿼트 50 내지 200 마이크로리터로 여과했을 때. 재프로그래밍 절차를 시작하기 전에, 우물 당 0.1 %의 500 마이크로 리터와 여섯 잘 조직 배양 처리 플레이트를 코딩하고 37 섭씨에서 20 분 동안 플레이트를 배양. 인큐베이션의 끝에서 나머지 젤라틴 용액을 흡인시합니다.플레이트 인간 진피 섬유아세포는 1.5배 10배의 밀도로 플레이트당 완전한 DMEM의 2밀리리터로 플레이트당 5번째 세포에 1.5배의 밀도를 가지며 하룻밤 사이에 배양한다. 다음 날 아침, 밀리리터 폴리브레네 당 8 마이크로그램으로 보충된 완전한 DMEM의 2밀리리터로 매질을 교체하고 새로운 마이크로센트리슈에이체 튜브에 풀 생성 전사 인자 렌티바이러스와 M2rtTA의 혼합물을 1대 1로 추가한다. 그런 다음, 렌티바이러스 혼합물의 최적의 부피로 섬유아드를 잘 10~100마이크로리터 사이로 변환한다.16시간의 인큐베이션 후, 수퍼네이터를 완전한 DMEM으로 대체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 6~8시간 동안 되돌려 보입니다. 복구 후, 수퍼넌트는 폴리브레인으로 보충된 완전한 DMEM의 2밀리리터로 교체하고 방금 입증된 대로 두 번째 트랜스퍼션을 수행합니다. 두 번째 트랜스듀싱 인큐베이션의 끝에서, 초월체를 독시사이클린의 밀리리터당 1마이크로그램으로 보충한 완전한 DMEM으로 대체하고 48시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환한다.인큐베이션의 끝에서, 새로운 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 독시 사이클린으로 보충 조혈 매체의 웰 당 두 밀리리터에 각각 1 대 2 비율로 각각 잘 분할및 재플레이트 세포. 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 분석을 위한 충분한 수의 세포를 얻으려면, 6개의 웰 플레이트를 코팅한 젤라틴에서 제5 섬유아세포에 3회 10번 플레이트를 플레이트하고 하룻밤 동안 배양한다. 인큐베이션이 끝나면, 1대 1비율로 FUW-M2rtTA를 플러스한 세 가지 요인의 개별 인자 또는 풀을 포함하는 렌즈바이러스의 10~20마이크로리터로 2일 연속으로 세포를 두 번 트랜스듀싱한다.제2 전관 후 16시간 후, 상체가 함유된 바이러스를 제거하고 24시간 동안 완전한 DMEM에서 세포를 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 개별 젤라틴 코팅 된 개별 젤라틴으로 각각의 내용기를 다시 플레이트 100 밀리미터 조직 배양 완전한 DMEM과 함께 요리 당 10 밀리리터의 최종 볼륨에, 세포 배양 인큐베이터에 세포를 반환. 6 일 후, 독시 사이클린으로 보충 된 완전한 DMEM으로 상체를 교체하십시오.문화를 인큐베이터에 2일 더 돌려보내보도록 한다. 이러한 대표적인 세포 측정 플롯에서 입증된 바와 같이, 재프로그래밍된 세포의 약 17%가 25일 의 재프로그래밍 후 CD49f와 CD9를 모두 표현합니다. 이중 양성 세포의 대다수는 CD143및 작은 인구 표현 CD34를 표현합니다, 동적 혈전성 운명 유도를 건의합니다.이러한 마커는 M2rtTA에서 25일 동안 배양된 인간 진피 섬유아세포로 작용하지 않는다. 면역형광 이미징은 이러한 마커에 대해 부정적인 섬유아세포와 형태학적으로 구별되는 응고 및 둥근 세포에서 CD9 및 CD143의 발현을 확인합니다. 브라이트페이드 이미징은 리프로그래밍 프로세스 전반에 걸쳐 세포 융합, 형태 및 식민지 형성을 시각화하기 위해 수행됩니다.재프로그래밍된 세포의 단세포 RNA 염기분석분석은 2일부터 25일까지 CD49f, CD9 및 CD143 발현의 단계별 증가를 나타낸다. 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 후, 게놈 브라우저 프로파일은 섬유아세포가 개별적으로 3가지 요인 또는 GATA2와 결합될 때 ITGA6 및 ACE의 게놈 조절 영역에 결합하는 GATA2를 보여줍니다. 배양에 추가된 항바이러스 입자의 부피는 세포 생존가능성을 손상시키지 않으면서 성공적인 재프로그래밍을 위해 최적화되어야 합니다.이 플랫폼은 CRISPR-Cas9와 같은 약리학적 억제 및 게놈 스케일 스크리닝 기술과 결합하여 인간 최종 혈막증의 새로운 조절기를 정의할 수 있습니다. 이 직접 적인 재프로그래밍 접근은 연구원이 인간 발달 혈토포이시스의 필드에 있는 새로운 질문을 탐구하고 인간 조혈 줄기 세포의 사양의 밑에 기계장치를 해독하는 것을 허용할 것입니다. 렌티바이러스 작업을 위해 전용 라미나 플로우 후드에서 항바이러스 수집 및 환원제를 수행하고 바이러스 오염 폐기물을 적절한 용기에 버리는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...