Name: hemogenic reprogramming of human fibroblasts by enforced expression of transcription factors
Uploaded: 2019-11-04T13:00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors at JoVE.com

Фонд Кнута и Алисы Валленберг, медицинский факультет Лундского университета и региона Сконе признаны за щедрую финансовую поддержку. Эта работа была поддержана грантом от Olle Engkvists Stiftelse (194-0694 Филипе Перейра) и стипендии PhD от Фунданьо пара Ci'ncia электронной Tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 Филипе Перейра, и SFRH/BD/135725/2018 и SFRH/BD/51968/2012 Рите Алвес и Андрея Гомеша). Это исследование было также поддержано средствами от NIH и NYSTEM (1R01HL119404 и C32597GG к Kateri A. Moore).

<ol>
	<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+potent+human+hematopoietic+stem+cells+first+emerge+in+the+intraembryonic+aorta-gonad-mesonephros+region.">Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).</li><li>Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., P&#233;ault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+human+hematopoiesis.">Embryonic origin of human hematopoiesis.</a> International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).</li><li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system:+advances+and+questions.">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138, 1017-1031 (2011).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell.">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).</li><li>Vo, L., Daley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+generation+of+HSCs+from+somatic+and+pluripotent+stem+cell+sources.">De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources.</a> Blood. 125, 2641-2648 (2015).</li><li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition.">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121, 770-781 (2013).</li><li>Ebina, W., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+reprogramming+toward+hematopoietic+stem+cells.">Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells.</a> EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+Hemogenic+Program+in+Mouse+Fibroblasts.">Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+Reprogramming+In+vitro+Informs+In+Vivo+Identification+of+Hemogenic+Precursors+to+Definitive+Hematopoietic+Stem+Cells.">Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Single+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+Capable+of+Long-Term+Multilineage+Engraftment.">Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment.</a> Science. 333, 218-221 (2011).</li><li>Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., P&#233;ault, B., Tavian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+(CD143)+specifies+emerging+lympho-hematopoietic+progenitors+in+the+human+embryo.">Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo.</a> Blood. 119, 3712-3724 (2012).</li><li>Gomes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Transcription+Factor+Induction+Mediates+Hemogenic+Reprogramming.">Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming.</a> Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).</li><li>Karlsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+The+Tetraspanin+CD9+Affords+High-Purity+Capture+of+All+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells.">Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Reports. 4, 642-648 (2013).</li><li>Leung, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetraspanin+CD9+regulates+migration,+adhesion,+and+homing+of+human+cord+blood+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 117, 1840-1851 (2011).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency.">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).</li><li>Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors.">Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).</li><li>Suzuki, Y. S., Suzuki, Y., Ke, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulatable+Lentiviral+Vector+System.">Gene Regulatable Lentiviral Vector System.</a> Viral Gene Therapy. , (2011).</li><li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors.">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157, 549-564 (2014).</li><li>Lis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+endothelium+to+immunocompetent+haematopoietic+stem+cells.">Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells.</a> Nature. 545, 439-445 (2017).</li><li>Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+blood+to+blood&#8217;:+de-differentiation+of+hematopoietic+progenitors+to+stem+cells.">From blood to blood&#8217;: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells.</a> EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Signatures+of+Tissue-Specific+Microvascular+Endothelial+Cell+Heterogeneity+in+Organ+Maintenance+and+Regeneration.">Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration.</a> Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Murine+Fibroblasts+to+Hematopoietic+Progenitor+Cells.">Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells.</a> Cell Reports. 9, 1871 (2014).</li><li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mouse+fibroblasts+into+engraftable+myeloerythroid+and+lymphoid+progenitors.">Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors.</a> Nature Communications. 7, 1-15 (2016).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

В этой статье описан метод для генерации гематопоиетических клеток-прародителей непосредственно из фибробластов человека, которые проходят через промежуточные клетки HP, подобно окончательному HSCs14.
Бассейн производства лентивирных частиц, кодирующих GATA2, GFI1B и FOS был предпочтительным по сравнению с отдельным производством, так как в наших руках это приводит к более высокой эффективности перепрограммирования (неопубликованные данные). Лентивирусы, как члены семейства Retroviridae, как правило, содержат две копии положительной одноцепочечной РНК19. Повышенная эффективность перепрограммирования может быть обусловлена упаковкой двух различных трансгенов в одной и той же лецивирусной частице, что приводит к увеличению числа клеток, связанных с тремя транскрипционными факторами. Для обеспечения успеха этого протокола необходимо преобразовать HDF с достаточным количеством вируса в зависимости от прохождения клеток, чтобы получить оптимальный баланс между эффективностью перепрограммирования и жизнеспособностью клеток, как это рекомендовано в шаге 4.6. Кроме того, можно использовать свежие неконцентрированные вирусы. Рекомендуется преобразовывать клетки с 0,5-3 мл пула 3TF и M2rtTA. Кроме того, плотность клеток должна быть скорректирована в соответствии с приложением. 150 000 HDFs на 6-ну хорошую пластину (шаг 4.4) обеспечили оптимальную плотность для выполнения FACS, трансплантации и цитометрии потока анализа перепрограммированных клеток. Для экспериментов по ChIP-seq с самого начала требовалось больше ячеек (шаг 5.1). Важно регулярно проверять клетки на наличие морфологических изменений и два раза в неделю заменять гематопоиетическую среду для поддержки появления индуцированных гематопоэтиных клеток. Добавление гематопоитических цитокинов или сокультуры в слоях фидера может повысить эффективность перепрограммирования.
С помощью этого метода мы можем определить новые гематопоитические маркеры, которые динамически выражены во время гемогенного перепрограммирования. CD9, который, как было показано, регулируется в перепрограммированных клеток на транскрипционном уровне14, быстро выражается на поверхности клетки в начальных фазах перепрограммирования вместе с CD49f и CD143, выступающей в качестве нового маркера человеческих прекурсоров HSC. Мы также показываем, что ITGA6 и ACE являются прямыми целями GATA2 на начальных этапах гемогенного перепрограммирования, в дополнение к CD9 и CD3414, обеспечивая прямую механистическую связь между гемогеной человека прекурсор фенотип и GATA2.
Одним из преимуществ этой системы является использование относительно однородных фибробластных культур. В то время как PSCs легко расширяются и поддерживаются в пробирке,протоколы дифференциации генерируют неоднородные популяции, которые включают гематопоитетические прародители, которые прививаютсявряют плохо 5,6,7. Кроме того, существует риск опухолевого генеза при пересадке ПСК полученных HSPCs, так как недифференцированные PSCs все еще может оставаться в культуре даже после использования протоколов дифференциации. Кроме того, фибробласты, прямое перепрограммирование в HSCs была применена к крови совершенных прародителей20 и эндотелиальных клеток21. Однако, начиная с крови ограниченных клеток-прародителей препятствует терапевтическое применение в результате HSCs, если пациент несет мутации, которые влияют на стволовых / прародитель гематопоитической популяции22. В случае эндотелиальных клеток, они более трудно получить по сравнению с фибробластов, и представляют собой очень неоднородной популяции клеток с точки зрения фенотипа, функции и структуры, которые являются орган-зависимых23. Другие исследования удалось перепрограммировать мыши фибробластов в привитых гематопоиетических прародителей24,25 еще, до сих пор, ни один другой протокол описывает поколение HSPC-подобных клеток из человеческих фибробластов.
Этот подход, в сочетании с фармакологическим ингибированием, генным нокаутом, или нокдаун позволяет определить индивидуальные или комбинации факторов, которые необходимы для непосредственного стимулирования человека HSCs. Технологии CRISPR-Cas9 в HDF до перепрограммирования представляют собой захватывающую попытку определить новые регуляторы человеческого окончательного гематоподия. В будущем, перепрограммирование не связанных с кровью типов клеток человека, таких как фибробласты будет служить в качестве платформы для создания здоровых пациентов с учетом гематопоиетических клеток-прародителей для клинического применения.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.
The second author affiliation was&#160;updated from:
2Wallenberg Center for Molecular, Lund University
to:
2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.

Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Окончательный гематопоиетических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPCs) возникают в области аорты-гонад-мезонефров (AGM) и плаценты из эндотелиальных прекурсоров с гемогенной емкостью, через эндотелиальный-гематопоатический переход (EHT)1, 2. Гемогенные прекурсоры (ГП) выражают как эндотелиальные, так и гематопоитические маркеры, но их точная идентификация остается неуловимой, особенно в человеческой системе. Несмотря на то, что относительно сохранивпроцесс у млекопитающих, развитие гематопоиетических стволовых клеток (HSC) по-прежнему значительно отличается между людьми и моделями мыши3,4. Поэтому необходимы подходы in vitro для повторения развития HSC человека.
Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) на HSCs, хотя и многообещающая, встретила ограниченный успех в течение последних 20 лет, в основном из-за имеющихся протоколов дифференциации, которые приводят к примитивным гематопоитическим потомкам с плохим притворством способность5,6,7. Кроме того, методы перепрограммирования прямых ячеек были применены для генерации HSPC-подобных ячеек из нескольких типов клеток, используя транскрипционные факторы (TFs)8,9. В частности, переэкспрессия трех TFs, Gata2, Gfi1b и cFos, преобразованных мыши эмбриональных фибробластов в HSPCs через промежуточный HP с определенным фенотипом (Пром1-Ска-1'CD34-CD45-)10. Этот процесс напоминал EHT, который происходит в эмбрионе и плаценте, во время спецификации окончательного hematopoiesis. Этот фенотип позволил идентификации и изоляции населения HPs в мышь плаценты, что после краткосрочной культуры и Notch активации генерируется последовательно трансплантативных HSCs11.
До сих пор не было установлено фенотипа, который отличал бы человеческие ГХК от их предшественников, но некоторые молекулы, как известно, выражены в новых HSCs. Integrin alpha 6 (ITGA6 или CD49f) высоко выражен в долгосрочном заселении ГХК, самых незрелых клетки в отсеке HSC12, и ангиотензин-преобразующий фермент (ACE или CD143) присутствует в CD34 отрицательных гематопоитических предшественников в эмбриональных кроветворных тканей13.
Недавно мы показали, что человеческие версии трех TFs, GATA2, FOS и GFI1B перепрограммировать человеческие кожные фибробласты (HDFs) в HPs с краткосрочной возможностью привить14. На начальных этапах перепрограммирования GATA2 привлекает открытый хроматин и набирает GFI1B и FOS для подавления генов фибробластов и активации эндотелиальных и гематопогетических генов. Индуцированные клетки высоко выражали CD49f и ACE, и содержали небольшой процент клеток, выражающих маркер HSPC CD34. Ген CD9, который выражается в HSCs15 и имеет важное значение для HSC самонаведения16, было показано, что прямая цель GATA2 и среди наиболее до регулируемых генов в перепрограммированных клеток14. Таким образом, CD9 может представлять собой дополнительный маркер для HPs человеческого окончательного гематопоеза.
В этом протоколе мы описываем генерацию HSPC-подобных клеток из фибробластов человека через принудительное выражение GATA2, GFI1B и FOS, а также адаптированный метод анализа иммунопременции хроматина (ChIP)-секвенирования (seq) в начале Перепрограммирования. TFs были закодированы в доксициклин (DOX)-индуцируемого лентивирусного вектора (pFUW-tetO), который содержит элемент тетрациклина (TRE) и минимальный промоутер ЦМВ, и были трансукторованы вместе с составным вектором, содержащим обратный тетрациклин трансактиваторный белок (pFUW-M2rtTA). Когда DOX (аналог тетрациклина) добавляется после трансдукции, он связывается с белком rtTA, который взаимодействует с TRE, позволяющим транскрипцию TF (Система Тет-Он). Процедура требует 25 дней. Для экспериментов ChIP-seq, HDFs были трансуктором с помеченными версиями GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) и GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), плюс pFUW-tetO-FOS и tF связывающие сайты были проанализированы через два дня после doX дополнения.
В конечном счете, гемогенное перепрограммирование фибробластов человека обеспечивает систему витровых путей для изучения механизмов, лежащих в основе гематопоеза развития человека и потенциальный источник специфических для пациентов HSPCs для будущего клинического применения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#430625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>#343518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#14280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#UFC903096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1X) no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate (DOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#25-0495-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUW-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from Porcine Skin Type A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematopoietic medium, MyeloCult H5100</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#05150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Fibroblasts (HDFs)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>#2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution (Pen/Strep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#SH30256.01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>#312105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-FOS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-GATA2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUW-tetO-GFI1B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV-tetO-HA-GFI1B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#125599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic reprogramming of human fibroblasts by enforced expression of transcription factors

Клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе спецификации гематопоатических стволовых клеток человека (ГСК), остаются неуловимыми. Стратегии для повторения человеческого HSC появление in vitro необходимы для преодоления ограничений в изучении этого сложного процесса развития. Здесь мы описываем протокол для создания гематопоиетического стебля и клеток, похожих на гененора, из человеческих дермальных фибробластов, использующих подход прямого перепрограммирования клеток. Эти клетки проходят через гемогенный промежуточный клеточный тип, напоминающий эндотелиальный к гематопоиетному переходу (EHT), характерный для спецификации HSC. Фибробласты были перепрограммированы на гемогенные клетки с помощью трансдукции GATA2, GFI1B и FOS транскрипции факторов. Это сочетание трех факторов индуцированных морфологических изменений, выражение гемогенных и гематопогетических маркеров и динамических транскрипционных программ EHT. Перепрограммированные клетки генерируют гематопоитетическое потомство и заселяют иммунодефицитных мышей в течение трех месяцев. Этот протокол может быть адаптирован к механистскому вскрытию процесса EHT человека, о чем свидетельствует здесь, определив цели GATA2 на ранних этапах перепрограммирования. Таким образом, гемогенное перепрограммирование человека обеспечивает простой и уступчивый подход к выявлению новых маркеров и регуляторов возникновения HSC человека. В будущем верная индукция гемогенной судьбы в фибробластах может привести к генерации специфических для пациентов ГСК для трансплантации.

Схематическое представление подхода перепрограммирования с использованием HDFs иллюстрируется на рисунке 1A. Фибробласты приобретаются из коммерческих источников или собираются у доноров и расширяются в пробирке до перепрограммирования. После покрытия, клетки трансумции дважды с GATA2, GFI1B и FOS (и M2rtTA) лентивирусов, и доксициклин добавляется в день 0 перепрограммирования. На второй день, клетки разделены и покрывают в гематопоитической среде до 25 дня культуры. Перепрограммированные клетки могут создаваться в разных точках времени для нескольких применений, включая трансплантацию у мышей с ослабленным иммунитетом, одноклеточное РНК-секвенирование (scRNA-seq) очищенных клеточных популяций (день 2 несортированный, день 15 CD49f день 25 CD49fиCD34- клетки), а также анализ микроскопии и цитометрии потока для маркеров поверхности клетки CD49f, CD34, CD9 и CD143. Представитель цитометрии участков показать, что 17% перепрограммированных ячеек, выражающих как CD49f и CD9(Рисунок 1B, левая панель),после 25 дней перепрограммирования. Большинство двойных положительных клеток выражают CD143 (86%), а небольшая популяция выражает CD34 (0,9%), что свидетельствует о динамической индукции гемогенной судьбы. Эти маркеры не активируются в M2rtTA трансиндуцированных HDFs культивируется в течение 25 дней(Рисунок 1B, правая панель). Иммунофлуоресценция изображения подтверждают выражение CD9 и CD143 в приверженных и круглых клеток, морфологически отличается от фибробластов, которые являются отрицательными для этих маркеров (Рисунок 1C). Человеческие гемогеные колонии также выражают CD49f и CD3414. ScRNA-seq анализ HDFs, день 2 несортированных клеток, и очищенные перепрограммированные клетки на день 15 (CD49fCD34- )и день 25 (CD49fcd34)показать пошаговое увеличение cd49f, CD9 и CD143 выражение от дня 2 до дня 25. CD49f и CD9 положительные клетки появляются сначала в процессе перепрограммирования, между днем 2 и 15, что указывает на то, что эти молекулы могут представлять маркеры раннего гемогенеза человека. Выражение CD143 начинает обнаруживаться в день 15, а CD34, выражающих клетки, обнаруживаются только в более поздние временные моменты (день 25). В качестве эталона были использованы клетки CD34- пуповинной крови (UCB).
Рисунок 2А описывает измененный протокол для генерации достаточного количества клеток для анализа CHIP-seq на начальных стадиях гемогенного перепрограммирования (день 2). Во-первых, HDFs покрываются плотностью в два раза выше, чем в стандартном протоколе (300 000 ячеек против 150 000 клеток на тарелку). После трансдукции, каждая скважина повторно покрыта в 100 мм блюдо позволяет клеткам расширяться в течение 6 дней, прежде чем дополнять среду с DOX. Клетки анализируются через 2 дня после добавления DOX и последующего выражения TF. На рисунке 2B показаны профили генома браузера GATA2, связывающиеся с геномными регулятивными регионами ITGA6 и ACE, когда клетки со-трансумции с тремя факторами (3TF) или GATA2 индивидуально. GATA2 также связывается с открытыми регионами хроматина генов CD9 и CD34 14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig1a.jpg"> Рисунок 1: Индукция гемогенной судьбы в кожных фибробластах человека. (A) Экспериментальная стратегия гемогенного перепрограммирования кожных фибробластов человека (HDFs). Фибробласты из биопсии кожи пунш собираются у доноров, расширяются и перекрываются с помощью лентивирусов GATA2, GFI1B, FOS и M2rtTA. Доксициклин (DOX) добавляется в культуру на 0 день перепрограммирования и клетки анализируются в несколько точек времени до 25-го дня. scRNA-seq, одноклеточный РНК-секвенирование. FACS, Флуоресценция активированная сортировка клеток. (B) Стратегия Gating используемая для того чтобы оценить выражение гемогеновых/гематопоитических маркеров цитометрией потока на день 25 после transduction с 3 факторами транскрипции (3TFs). Цитометрии участки показывают процент двойных положительных клеток для CD49f и CD9, закрытые в живой клетке населения (DAPI-отрицательный). В двойном положительном населении показано выражение CD143 и CD34. HDFs, трансцированные только с вирусом M2rtTA при тех же условиях культуры используются в качестве контроля. (C) Иммунофлуоресценция изображения день 25 перепрограммированных колоний, подтверждающих выражение CD9 (верхняя панель) и CD143 (нижняя панель). Клетки были окрашены антителами(Таблица материалов) разбавленной 1:100 в PBS/2% FBS с сывороткой мыши, инкубировали 20 мин при 37 КС, 5% CO2, промывают три раза и изображения в PBS/2% FBS. Фазовый, фазовый градиентный контраст. Шкала баров 50 мкм. (D) ScRNA-seq анализ 253 клеток в разных точках времени. Выражение ITGA6, CD9, ACE и CD34 активируется во время перепрограммирования. Клетки собираются на второй день (несортированный), день 15 (CD49fиCD34- )и день 25 (CD49fиCD34). В качестве справочных данных используются hdFs и CD34- пуповинная кровь (34-UCB). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig1alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig02.jpg"> Рисунок 2: Расширение кожных фибробластов человека для анализа ChIP-seq. (A) Экспериментальная стратегия, изображающая измененный протокол для генерации большого количества трансмальных человеческих кожных фибробластов (HDFs) для ChIP-seq на второй день перепрограммирования. 300 000 клеток покрываются 6-колодными пластинами и дважды трансумциируются с помощью индивидуальных факторов (pFUW-tetO-FOS, pLV-tetO-HA-GFI1B или pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) или сочетанием трех факторов (плюс M2rtTA). После удаления вирусов фибробласты расширяются на шесть дней в 100 мм. Доксициклин (DOX) добавляется в день 0 и клетки собираются через два дня после добавления DOX. (B) Профили браузера генома подчеркивая GATA2-обязательные места (серые коробки) на ITGA6 и ace loci через два дня после трансдукции с тремя транскрипционными факторами (3TFs) или только с GATA2. Общее количество отображенных считываемых отображается на оси y-. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1.jpg"> Дополнительная цифра 1: Определение оптимизированного объема лентивирных препаратов для эффективного гемогенного перепрограммирования. Для трансдуцирования кожных фибробластов (HDF) используются увеличивающиеся объемы концентрированных (10-100 кл.) пуля, производимых пулом, последующие шаги 4,5–4,12 протокола. Перепрограммированные клетки анализируются на 25-й день, чтобы определить оптимальный объем трансдукции для гемогенного перепрограммирования, учитывая процент CD49fиCD9- клетки, закрытые в живых клетках (DAPI-отрицательный). Жизнеспособность клеток может быть оценена путем количественной оценки абсолютного числа живых клеток на 25-й день. В качестве отрицательного контроля используются HDF, трансцированные с помощью M2rtTA (100 л). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2.jpg"> Дополнительная рисунок 2: Морфология изменяется во время гемогенного перепрограммирования кожных фибробластов человека. Человеческие дермальные фибробласты культуры изображены в день первого трансдукции (день -2), когда DOX добавляется в культуры (день 0), два дня (день 2) и пятнадцать дней (день 15) после DOX добавок, и в конечной точке эксперимента (день 25). Подсвечиваются гемогенные колонии в 15 и 25 дней. Шкала баров 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors at JoVE.com

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Этот протокол демонстрирует индукцию гемогенной программы в кожных фибробластах человека путем принудительного выражения транскрипционных факторов GATA2, GFI1B и FOS для генерации гематопоиетических стволовых и прародителей клеток.

Гемогенное перепрограммирование фибробластов человека путем принудительного выражения факторов транскрипции

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Этот метод помогает преодолеть ограничения в изучении гематопоэтического развития человека, предоставляя простую и уроченную платформу in vitro, основанную на прямом перепрограммирование клеток. Визуальная демонстрация этого метода обеспечит идеальное руководство в фундаментальных шагов для создания человеческих гемогенных клеток, а именно во время лентивирусного производства, фибробластовой трансдукции и клеточной культуры. Путем преобразовывать фибробласты кожи в гемогенные прекурсоры, мы надеемся произвести пациента специфические гематопоэтические ствол и клетки progenitor в достаточных номерах для трансплантации стволовой клетки.Начните с выращивания HEK293T клеток в 100-миллиметровой культуры ткани лечение блюдо с 10 миллилитров полного DMEM при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа до слияния. За день до трансфекции, после аспирации среды, тщательно промыть блюдо пятью миллилитров PBS и отделить клетки с 1,5 миллилитров диссоциации раствора. После инкубации в течение пяти-десяти минут при 37 градусах Цельсия, инактивировать раствор с тремя миллилитров полного DMEM и передачи подвески клетки в 15 миллилитров конической трубки.Вымойте блюдо с 5 миллилитров полного DMEM, чтобы удалить все оставшиеся прикрепленные клетки и вытащить мыть с клеточным раствором. Соберите клетки путем центрифугации, аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в шесть миллилитров полного DMEM. Затем, разделить подвеску равномерно между шестью 100 миллиметров ткани культуры обработанные блюда в конечном томе 10 миллилитров полного DMEM на блюдо.На следующий день добавьте 10 микрограммов общей массы трех плазмидов переноса вместе в новую 15 миллилитровую коническую трубку. Далее добавьте 10 микрограммов второго поколения вектора упаковки psPAX2, кодирующих гены кляпа, pol, tat и rev с последующим добавлением пяти микрограммов pMD2. Вектор конверта G, кодирующий ген VSV-G к трубке.Наконец, добавьте воду, чтобы довести конечный объем до 500 микролитров. В двух новых 15 миллилитровых конических трубок добавьте 10 микрограммов плазмиды FUW-M2rtTA, 10 микрограммов вектора упаковки и пять микрограммов вектора оболочки к каждой трубке. Затем добавьте воду до конечного объема в 500 микролитров в каждую трубку.Далее добавьте 62,5 микролитров двух хлорида молярного кальция к каждой из трех трубок и используйте контроллер пипетки, оснащенный Пастер Пипетт, чтобы выпустить пузырьки в каждую смесь. В то время как пузырьки формируются, добавить 500 микролитров BES буферной солевой dropwise против Пастер Pipette и на смесь. Инкубировать трубки при комнатной температуре, по крайней мере 15 минут, пока смеси появляются слегка облачно.Во время инкубации тщательно замените супернатант клеточных культур HEK293T 10 миллилитров полного DMEM без антибиотиков. Распределите комплексы ДНК на отдельные блюда культуры клеток HEK293T и инкубировать в течение 24 часов. На следующий день, заменить supernatants с четырьмя миллилитров полного DMEM за культуру и вернуть блюда на 37 градусов по Цельсию 5%углекислого газа культуры инкубатора ночь.На следующее утро, собирать supernatants в один 50 миллилитров трубки на блюдо и добавить четыре миллилитров свежей среды для каждого блюда. После еще восьми часов культуры, бассейн супернатант в каждом блюде с ранее собранным супернатантом и добавить четыре миллилитров свежей среды. Верните блюда в инкубатор клеточной культуры на ночь и соберите супернатанты в последний раз.Когда весь вирус был собран, фильтруйте каждый лентивирусный супернатант через 0,45 микрометровый фильтр связывания низкого белка в отдельные трубки и добавляйте максимум 15 миллилитров фильтрованного супернатанта к отдельным центробежным фильтрам для центробежки. Отбросьте поток через. В блоке фильтра останется вязкий лентивирус, содержащий жидкость.Когда все лентивирусные супернатанты были отфильтрованы aliquot от 50 до 200 микролитров концентрированных лентивирусов для холодного хранения. Перед началом процедуры перепрограммирования кодировать шесть хорошо ткани культуры обработанной пластины с 500 микролитров 0,1% желатина на колодец и инкубировать пластину в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации, аспирировать оставшийся раствор желатина.Плита человека кожные фибробласты при плотности 1,5 раза десять до пятой клетки на тарелку в двух миллилитров полного DMEM на колодец и инкубировать на ночь. На следующее утро, заменить средний в каждой хорошо с двумя миллилитров полного DMEM дополнены восемью микрограммами на миллилитр полибрена и добавить один к одному смесь пула производства транскрипции фактор лентивирусов и M2rtTA в новой микроцентрифуг трубки. Затем вывести фибробласт с оптимальным объемом лентивирусной смеси, от 10 до 100 микролитров на колодец.После 16 часов инкубации замените супернатанты на полный DMEM и верните клетки в инкубатор клеточной культуры на шесть-восемь часов. После выздоровления замените супернатанты двумя миллилитров полного DMEM, дополненных полибреном, и выполните вторую трансдукцию, как только что продемонстрировано. В конце второй инкубации трансдукции замените супернатанты полным DMEM, дополненным одним микрограммом на миллилитр доксициклина, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 48 часов.В конце инкубации, разделить каждый хорошо на один-два соотношения и replate клетки в два миллилитров на колодец гематопоэтической среды дополняется доксициклина в новом желатин покрытием шесть хорошо пластины. Чтобы получить достаточное количество клеток для анализа секвенирования иммунопреципиентации хроматина, пластина три раза от 10 до пятого фибробластов в желатине покрытием шесть хорошо пластины и инкубировать на ночь. В конце инкубации, трансдуцирование клеток два раза в течение двух дней подряд с 10 до 20 микролитров лентивируса, содержащего индивидуальные факторы, представляющие интерес или пул из трех факторов плюс FUW-M2rtTA на один к одному соотношению.Через 16 часов после второй трансдукции удалите вирус, содержащий супернатант, и инкубировать клетки в полном DMEM в течение 24 часов. В конце инкубации, replate содержание каждого хорошо в отдельных желатина покрытием 100 миллиметров ткани культуры обработанные блюда с полным DMEM до конечного объема 10 миллилитров среднего на блюдо, и вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры. Через шесть дней замените супернатант полным DMEM, дополненным доксициклиным.Верните культуры в инкубатор еще на два дня. Как показывают эти репрезентативные цитометрические участки, примерно 17% перепрограммированных ячеек выражают как CD49f, так и CD9 после 25 дней перепрограммирования. Большинство двойных положительных клеток выражают CD143, а небольшая популяция выражает CD34, что свидетельствует о динамической гемогенной индукции судьбы.Эти маркеры не активируются в M2rtTA трансдуцированных человеческих кожных фибробластов, культурных в течение 25 дней. Иммунофлуоресценция изображения подтверждает выражение CD9 и CD143 в адепт и круглые клетки, которые морфологически отличаются от фибробластов, которые являются отрицательными для этих маркеров. Яркая визуализация выполняется для визуализации слияния клеток, морфологии и формирования колоний на протяжении всего процесса перепрограммирования.Одноклеточный анализ секвенирования РНК перепрограммированных ячеек показывает пошаговое увеличение экспрессии CD49f, CD9 и CD143 с двух дней до 25. После секвенирования иммунопреципиентации хроматина профили Genome Browser показывают, что GATA2 привязи к геномным регулятивным регионам ITGA6 и ACE, когда фибробласты котрансдуируются с тремя факторами или GATA2 индивидуально. Объем противовирусных частиц, добавленных в культуру, должен быть оптимизирован для успешного перепрограммирования без ущерба для жизнеспособности клеток.Эта платформа может быть соединена с фармакологическим ингибированием и технологиями скрининга генома, такими как CRISPR-Cas9, для определения новых регуляторов человеческого окончательного гематопоеза. Такой подход прямого перепрограммирования позволит исследователям изучить новые вопросы в области развития человека гематопоэза и расшифровать механизмы, лежащие в основе спецификации человеческих гематопоэтических стволовых клеток. Важно выполнять противовирусные сборы и переливки в капюшоне ламинарного потока, предназначенного для лентивирусной работы, и выбрасывать вирусные загрязненные отходы в соответствующий контейнер.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Человек плюрипотентных стволовых клеток на основе Экспериментальная токсичность Анализы для химической безопасности Скрининг и системной биологии генерации данных

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Прямая индукция гемогенного эндотелия и крови сверхэкспрессией факторов транскрипции в человека плюрипотентные стволовые клетки

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Создание пролиферативный тетраплоид клеток из нетрансформированных фибробластах человека

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Условный Перепрограммирование педиатрический человеческого пищеводного эпителиальных клеток для использования в тканевой инженерии и профилактике заболеваний Исследование

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Оценка кардиомиоцитов подтипов После Транскрипция фактор опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Подавление Pro фиброзный сигнализации потенцирует фактор опосредованной перепрограммирования мыши эмбриональных фибробластов в индуцированной кардиомиоцитов

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...