I dag vil vi gerne vise dig varianter af den fælles varme-induceret antigen hentning protokol. Det kombinerer fordelene ved lavere temperatur for neutrofil elastase antigen og høj pH-værdi, der kræves for histoner. Denne teknik gør det muligt at studere NETs, neutrofil ekstracellulære fælder, i paraffin væv både fra mus eller mænd.
Og det er også anses for at studere arkiveret materiale eller retrospektiv undersøgelse. Først skal du placere de forberedte dias i stativer og dykke dem ned i de medier, der anvendes til dehydrering og clearing i omvendt rækkefølge i fem minutter hver. Dernæst opvarme et vandbad med en temperatur-kontrolleret varmeplade til 70 grader Celsius.
Placer en krukke fyldt med varme-induceret epitope hentning buffer og 10% glycerol i vandbadet. Når bufferen har nået 70 grader Celsius, skal du placere reolen med diasene i bufferglasset. Inkuber diasene ved 70 grader Celsius i 120 minutter.
Derefter skal du fjerne krukken fra vandbadet, og lad den køle af til stuetemperatur. Skyl de afkølede sektioner tre gange med det ioniserede vand og én gang med TBS. Brug rullet filterpapir eller en vatpind, fjern forsigtigt væsken mellem sektionerne på objektglassene, og sørg for at lade sektionerne være hydrerede.
Brug derefter en hydrofobe barrierepen til at oprette en barriere omkring hvert afsnit. Indkube afsnittet i blokerende buffer ved stuetemperatur i 30 minutter for at forhindre uspecifik binding. De primære antistoffer fortyndes ved blokerende buffer i en koncentration på et mikrogram pr. milliliter.
Fjern blokeringsbufferen fra objektglassene, og tilsæt de fortyndede primære antistoffer, og sørg for at bruge en tilstrækkelig volumen til at forhindre tørring. Luk den fugtige beholder, og inkubere natten over ved stuetemperatur. Den næste dag, vaske sektioner tre gange med TBS med hver vask varer fem minutter.
Forbered en arbejdsopløsning af sekundære antistoffer i blokerende buffer. Dæk vævssektionerne med den sekundære antistofopløsning, og overfør objektglassene til en fugtig beholder. Forsegle den fugtige beholder, og inkubere ved stuetemperatur i en time.
Herefter vaskes sektionerne tre gange med TBS og én gang i vand med hver vask, der varer fem minutter. Dæk de vaskede sektioner med monteringsmedium, og påfør dækglas og undgå bobledannelse. Når monteringsmediet er størknet, skal du bruge et konfokalt mikroskop eller et wide-field mikroskop med passende båndpasfiltre til at analysere immunfluorescensen.
Hvis du vil digitalisere hele sektionerne ved hjælp af en slidescanner, skal du indstille fluorescensintensiteten ved hjælp af de negative og positive kontrolelementer. Brug neutrofil elastase farvning, finde neutrofiler-rige områder og zoome ind på disse områder for at kontrollere, om neutrofil elastase signal er granuleret eller ekstracellulær. Hvis signalet er ekstracellulært og overlapper med både histon og DNA-farvning, er de neutroil ekstracellulære fælder opnået.
I denne undersøgelse, NET komponenter med succes opdaget i paraffin-indlejret væv, både af human og murine oprindelse. Hvis vævssektionerne har en tykkelse mellem to til tre mikrometer, kan de analyseres ved hjælp af wide-field mikroskopi ved hjælp af 10x eller 20x mål. For at vurdere farvningen korrekt er både negative og positive prøver blevet behandlet.
En repræsentativ del af humant blindtarmsbetændelse væv viser væv farves for NE, H2B, og Hoechst 33342. Billederne til venstre er fra et område af sektionen, der indeholder NETs, mens billederne til højre er fra et andet område af samme sektion, der indeholder mange neutrofiler, men ingen NETs. Områder med massiv NET-formation kan nemt findes selv ved lave forstørrelser, da alle tre NET komponenter colocalize ofte i trævædde ekstracellulære strukturer.
Dette vises i overlejring af de tre kanaler som hvidlige ekstracellulære fibre, som kan kvantificeres ved hjælp af billedanalyse software til at skabe en lilla overlay ved hjælp af pixels fra overlappende signaler, der er positive for grøn, rød og blå. For højere opløsning, konfokale mikroskoper eller wide-field mikroskoper med deconvolution skal bruges til at minimere out-of-focus blur. En maksimal projektion af en konfokal stak af et NET-rigt område fra samme menneskelige blindtarmsbetændelsesprøve viser, at NE findes i granulat, men også er rigeligt ekstracellulært, hvor det colocalizes med H2B og med DNA.
Den ekstracellulære colocalization resulterer i en hvidlig farvekombination. De pixel, der er positive for grøn, rød og blå, kan igen bruges til at oprette en lilla overlejring, der præsenterer NET'er. En repræsentativ detalje af en central sektion fra en muselunge inficeret med Mycobacterium tuberkulose giver et andet eksempel på den colocalization af alle tre NET komponenter er klart synlige som hvidlige områder mellem neutrofiler, som kan bruges til at skabe en lilla lag angiver NETs.
Under farvningsproceduren må sektionerne ikke blive tørre, da dette vil forårsage en falsk-positiv farvning eller en høj baggrund. Analysen af arkiveret materiale kan bidrage til at forstå virkningen af NETs i sygdomme. Fordi paraffinvæv kan have en enorm baggrund, er det vigtigt at have en positiv og en negativ kontrol, som du kan skelne mellem din farvning og baggrunden.
Dewaxing og dehydrering skal udføres under en røghætte. Sørg for at bære handsker og din laboratoriekittel.
