I dag vil vi gjerne vise deg varianter av den vanlige varmeinduserte antigenhentingsprotokollen. Den kombinerer fordelene med lavere temperatur for nøytrofil elase antigen og høy pH-verdi som kreves for histoner. Denne teknikken gjør det mulig å studere NETs, nøytrofile ekstracellulære feller, i parafinvev både fra mus eller menn.
Og det anses også å studere arkivert materiale eller retrospektiv studie. Plasser først de forberedte lysbildene i stativer og nedsenk dem i mediet som brukes til dehydrering og rydding i omvendt rekkefølge i fem minutter hver. Deretter varmer du opp et vannbad med en temperaturkontrollert kokeplate til 70 grader Celsius.
Plasser en krukke fylt med varmeindusert epitop gjenfinningsbuffer og 10% glyserol i vannbadet. Når bufferen har nådd 70 grader Celsius, plasserer du stativet med lysbildene i bufferkrukken. Inkuber lysbildene ved 70 grader Celsius i 120 minutter.
Etter dette fjerner du krukken fra vannbadet, og la den avkjøles til romtemperatur. Skyll de avkjølte seksjonene tre ganger med det ioniserte vannet og én gang med TBS. Bruk rullet filterpapir eller en bomullspinne, fjern forsiktig væsken mellom seksjonene på lysbildene, og sørg for å la seksjonene hydreres.
Deretter bruker du en hydrofob barrierepenn til å skape en barriere rundt hver seksjon. Inkuber seksjonen i blokkeringsbuffer ved romtemperatur i 30 minutter for å forhindre uspesifisert binding. Fortynn de primære antistoffene i blokkeringsbufferen ved en konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter.
Fjern blokkeringsbufferen fra lysbildene, og legg til de fortynnede primære antistoffene, og sørg for å bruke et tilstrekkelig volum for å hindre tørking. Lukk den fuktige beholderen, og inkuber over natten ved romtemperatur. Neste dag, vask seksjonene tre ganger med TBS med hver vask som varer i fem minutter.
Forbered en arbeidsløsning av sekundære antistoffer i blokkeringsbufferen. Dekk vevsseksjonene med den sekundære antistoffløsningen, og overfør lysbildene til en fuktig beholder. Forsegle den fuktige beholderen, og inkuber ved romtemperatur i en time.
Etter dette vasker du seksjonene tre ganger med TBS og en gang i vann med hver vask som varer i fem minutter. Dekk de vasket seksjonene med monteringsmedium, og påfør dekkglass samtidig som du unngår bobledannelse. Etter at monteringsmediet har størknet, bruk et konfokalt mikroskop eller et bredt feltmikroskop med passende båndpassfiltre for å analysere immunofluorescence.
Hvis du vil digitalisere de fullstendige delene ved hjelp av en glideskanner, angir du fluorescensintensiteten ved hjelp av de negative og positive kontrollene. Bruk nøytrofil elaastasefarging, finn nøytrofilrike områder og zoom inn på disse områdene for å sjekke om nøytrofileastasesignalet er granulært eller ekstracellulært. Hvis signalet er ekstracellulært og overlapper med både histone og DNA-farging, er nøytrofile ekstracellulære feller oppnådd.
I denne studien oppdages NET-komponenter i parafin-innebygd vev, både av menneskelig og murin opprinnelse. Hvis vevsseksjonene har en tykkelse mellom to til tre mikrometer, kan de analyseres av bredfeltmikroskopi ved hjelp av 10x eller 20x mål. For å evaluere fargeleggingen riktig, har både negative og positive prøver blitt behandlet.
En representativ del av humant blindtarmbetennelsevev viser vev farget for NE, H2B og Hoechst 33342. Bildene til venstre er fra et område av seksjonen som inneholder NETs, mens bildene til høyre er fra et annet område av samme seksjon som inneholder mange nøytrofiler, men ingen NETs. Områder med massiv NET-formasjon kan lett bli funnet selv ved lave forstørrelser siden alle tre NET-komponentene colocalize ofte i strenge ekstracellulære strukturer.
Dette vises i overlegget av de tre kanalene som hvite ekstracellulære fibre som kan kvantifiseres ved hjelp av bildeanalyseprogramvare for å lage et lilla overlegg ved hjelp av piksler fra overlappende signaler som er positive for grønt, rødt og blått. For høyere oppløsning må konfokale mikroskoper eller bredfeltsmikroskoper med dekonivolution brukes til å minimere uskarphet utenfor fokus. En maksimal projeksjon av en konfokal stabel av et NET-rikt område fra samme menneskelige blindtarmbetennelse prøven viser at NE finnes i granulat, men er også rikelig ekstracellulært hvor det colocalizes med H2B og med DNA.
Den ekstracellulære kolokaliseringen resulterer i en hvitaktig fargekombinasjon. Pikslene som er positive for grønt, rødt og blått, kan igjen brukes til å lage et lilla overlegg som presenterer NETs. En representativ detalj av en sentral seksjon fra en muselunge infisert med Mycobacterium tuberkulose gir et annet eksempel på at colocalization av alle tre NET-komponenter er tydelig synlige som hvite områder mellom nøytrofiler som kan brukes til å lage et lilla lag som indikerer NETs.
Under fargingsprosedyren må seksjonene ikke falle tørre fordi dette vil føre til falsk positiv farging eller høy bakgrunn. Analysen av arkivert materiale kan bidra til å forstå virkningen av NETs i sykdommer. Fordi parafinvev kan ha en stor bakgrunn, er det viktig å ha en positiv og en negativ kontroll som du kan skille mellom farging og bakgrunnen.
Dewaxing og dehydrering bør utføres under en røykhette. Pass på å bruke hansker og labfrakk.