Idag vill vi visa varianter av det gemensamma värmeinducerade antigenhämtningsprotokollet. Den kombinerar fördelarna med lägre temperatur för neutrofila elastas antigen och högt pH-värde som krävs för histoner. Denna teknik gör det möjligt att studera NETs, neutrofil extracellulära fällor, i paraffin vävnader både från mus eller män.
Och det är också anses studera arkiverat material eller retrospektiv studie. Placera först de förberedda bilderna i rack och dränka dem i media som används för uttorkning och röjning i omvänd ordning i fem minuter vardera. Därefter värm ett vattenbad med en temperaturkontrollerad värmeplatta till 70 grader Celsius.
Placera en burk fylld med värmeinducerad epitop hämtning buffert och 10%glycerol i vattenbadet. När bufferten har nått 70 grader Celsius, placera rack med diabilderna i buffertburken. Inkubera rutschkanorna i 70 grader Celsius i 120 minuter.
Efter detta, ta bort burken från vattenbadet, och låt den svalna till rumstemperatur. Skölj de kylda sektionerna tre gånger med det joniserade vattnet och en gång med TBS. Använd valsat filterpapper eller en bomullspinne, ta försiktigt bort eventuell vätska mellan sektionerna på rutschbanorna och se till att lämna sektionerna hydrerade.
Använd sedan en hydrofoba barriärpenna för att skapa en barriär runt varje sektion. Inkubera sektionen i blockerande buffert i rumstemperatur i 30 minuter för att förhindra att det är en ospecifik bindning. Späd de primära antikropparna i blockerande buffert vid en koncentration av ett mikrogram per milliliter.
Ta bort blockeringsbufferten från objektglasen, och tillsätt de utspädda primära antikropparna, se till att använda en tillräcklig volym för att förhindra torkning. Stäng den fuktiga behållaren, och inkubera över natten i rumstemperatur. Nästa dag, tvätta sektionerna tre gånger med TBS med varje tvätt som varar fem minuter.
Bered en arbetslösning av sekundära antikroppar i blockerande buffert. Täck vävnaderna sektioner med den sekundära antikroppslösningen, och överför objektglasen till en fuktig behållare. Försegla den fuktiga behållaren, och inkubera i rumstemperatur i en timme.
Efter detta tvätta sektionerna tre gånger med TBS och en gång i vatten med varje tvätt som varar fem minuter. Täck de tvättade sektionerna med monteringsmedium, och applicera täckglas samtidigt som du undviker bubbelbildning. Efter monteringsmediet har stelnat, använd en confocal mikroskop eller ett brett fält mikroskop med lämpliga bandpassfilter för att analysera immunofluorescensen.
Om du vill digitalisera de fullständiga avsnitten med hjälp av en bildskanner ställer du in fluorescensintensiteten med hjälp av de negativa och positiva kontrollerna. Med hjälp av neutrofila elastas färgning, hitta neutrofil-rika områden och zooma in på dessa områden för att kontrollera om neutrofila elastas signalen är granulat eller extracellulär. Om signalen är extracellulär och överlappar med både histon och DNA-färgning har de neutrofila extracellulära fällorna erhållits.
I denna studie, NET komponenter är framgångsrikt detekteras i paraffin-embedded vävnad, både av mänskliga och murine ursprung. Om vävnadssektionerna har en tjocklek mellan två till tre mikrometer kan de analyseras genom bredfältsmikroskopi med 10x eller 20x mål. För att korrekt utvärdera infärgningen har både negativa och positiva prover bearbetats.
En representativ sektion av mänskliga blindtarmsinflammation vävnad visar vävnader färgas för NE, H2B och Hoechst 33342. Bilderna till vänster är från ett område i avsnittet som innehåller NEOTs, medan bilderna till höger är från ett annat område i samma avsnitt som innehåller många neutrofiler men inga NETs. Områden med massiv NET formation kan lätt hittas även vid låga förstoringar eftersom alla tre NET komponenter colocalize ofta i trådiga extracellulära strukturer.
Detta visas i överlagring av de tre kanalerna som vitaktig extracellulära fibrer som kan kvantifieras genom att använda bildanalys programvara för att skapa en lila överlägg med hjälp av pixlar från överlappande signaler som är positiva för grönt, rött och blått. För högre upplösning, konfokalmikroskop eller wide-field mikroskop med deconvolutions måste användas för att minimera out-of-fokus oskärpa. En maximal projektion av en confocal stack av ett NET-rikt område från samma mänskliga blindtarmsinflammation exemplar visar att NE finns i granulat men är också riklig extracellularly där det colocalizes med H2B och med DNA.
Den extracellulära colocalization resulterar i en vitaktig färgkombination. Pixlarna positiva för grönt, rött och blått kan återigen användas för att skapa en lila överlägg presentera NETs. En representativ detalj av en central sektion från en mus lunga infekterade med Mycobacterium tuberkulos ger ett annat exempel på colocalization av alla tre NET komponenter är tydligt synliga som vitaktiga områden mellan neutrofiler som kan användas för att skapa en lila skikt som anger NETTs.
Under färgningsproceduren får sektionerna inte falla torrt eftersom detta kommer att orsaka en falsk-positiv färgning eller en hög bakgrund. Analysen av arkiverat material kan hjälpa till att förstå effekten av neots vid sjukdomar. Eftersom paraffinvävnad kan ha en enorm bakgrund är det viktigt att ha en positiv och en negativ kontroll som du kan skilja mellan din färgning och bakgrunden.
Devaxning och uttorkning ska utföras under en draghuva. Se till att bära handskar och din labbrock.
