Name: characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment
Uploaded: 2020-06-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment at JoVE.com

Les travaux présentés ont été soutenus par le Ministère de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche et l’INSERM. Nous remercions l’installation BICeL- Campus Scientific City pour l’accès aux instruments et aux conseils techniques. Nous remercions Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard et Isabelle Fournier pour l’assistance à la spectrométrie de masse. Nous remercions Tanina Arab, Christelle van Camp, Françoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli et Pierre-Eric Sautière pour leur forte contribution aux développements scientifiques et techniques.

1. Culture primaire des Microglies/Macrophages
<ol><li>
Culture primaire de la microglie
	<ol>
<li>Microglie primaire de rat commercial de culture (2 x 106 cellules) (voir la Table des Matériaux) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum sans exosome, 100 U/mL de pénicilline, 100 'g/mL streptomycine, et 9,0 g/L de glucose à 37 'C et 5% deCO2%.</li>
		<li>Recueillir le milieu conditionné après une culture de 48 h et proc...

Le système nerveux central (SNC) est un tissu complexe dans lequel la communication cellule-cellule régule les fonctions neuronales normales nécessaires pour l’homéostasie30. Les véhicules électriques sont maintenant largement étudiés et décrits comme des cargaisons moléculaires importantes pour la communication cellule-cellule31. Ils livrent spécifiquement un cocktail de médiateurs aux cellules de destinataire affectant ainsi leurs fonctions dans des conditio...

Beaucoup de neuropathologies sont liées à l’état neuro-inflammatoire qui est un mécanisme complexe qui est de plus en plus considéré, mais toujours mal compris parce que les processus immunitaires sont divers et dépendent de l’environnement cellulaire. En effet, les troubles du SNC n’impliquent pas systématiquement les mêmes signaux d’activation et les mêmes populations de cellules immunitaires et, par conséquent, les réponses pro ou anti-inflammatoires sont difficiles à évaluer comme causes ou conséquences de pathologies. Les macrophages résidents du cerveau appelés "microglies" semblent être à l’interface entre le système nerveux et le système immunitaire1. Les microglies ont une origine myéloïde et sont dérivées du sac jaune pendant l’hématopoiesis primitive pour coloniser le cerveau, tandis que les macrophages périphériques sont dérivés du foie foetal pendant l’hématopoiesis définitif pour devenir macrophages périphériques2. Les cellules de microglies communiquent avec les neurones et les cellules gliales dérivées de neurones telles que les astrocytes et les oligodendrocytes3. Plusieurs études récentes ont démontré que les microglies sont impliquées dans la plasticité neuronale pendant le développement de CNS et l’homéostasie adulte de tissu, et également dans l’état inflammatoire lié aux maladies neurodegenerative4,,5. Dans le cas contraire, l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique peut être compromise dans d’autres pathologies du SNC. Les réponses immunitaires, en particulier dans le cancer multiforme de glioblastome, ne sont pas soutenues seulement par des cellules de microglie que la barrière hémato-encéphalique est réorganisée par des processus angiogéniques et la présence des vaisseaux lymphatiques6,7. Par conséquent, une grande infiltration de macrophages dérivés de moelle osseuse (BMDM) se produit dans la tumeur de cerveau à travers les mécanismes d’angiogenèse tumeur-dépendante8. Les cellules cancéreuses exercent une influence significative sur les MMO infiltrés menant aux propriétés immunosuppressives et à la croissance de tumeur9. Ainsi, la communication entre les cellules immunitaires et leur microenvironnement cérébral est difficile à comprendre car l’origine cellulaire et les signaux d’activation sont divers10,11. Il est donc intéressant d’appréhender les fonctions des signatures moléculaires associées aux cellules immunitaires dans des conditions physiologiques. À cet égard, la communication cellulaire entre les cellules immunitaires et le microenvironnement cellulaire peut être étudiée par la libération de vésicules extracellulaires (VE).
Les véhicules électriques sont de plus en plus étudiés dans la régulation des fonctions immunitaires dans des conditions saines ainsi que pathologiques12,13. Deux populations, exosomes et microvess, peuvent être prises en compte. Ils présentent différentes gammes de biogenèse et de taille. Les exosomes sont des vésicules de 30 à 150 nm de diamètre et sont générées à partir du système endosomal et sécrétées lors de la fusion des corps multivesculaires (MVBs) avec la membrane plasmatique. Les microsévères ont environ 100 à 1 000 nm de diamètre et sont générées par un bourgeonnement extérieur de la membrane plasmatiquecellulaire 14. Étant donné que la discrimination exosome versus microvesicle est encore difficile à réaliser selon la taille et les modèles moléculaires, nous n’utiliserons le terme DEV que dans le présent rapport. La communication associée à l’EV dans le SNC représente un mécanisme ancestral puisque des études ont montré leur implication dans des espèces d’invertébrés, y compris les nématodes, les insectes ou les annelides15,16. En outre, les résultats montrant que les véhicules électriques peuvent communiquer avec des cellules de différentes espèces démontrent que ce mécanisme est un système de verrouillage des clés, basé d’abord sur la reconnaissance des molécules de surface entre les vésicules et les cellules de receveur, puis permettant l’absorption des médiateurs16,17. En effet, les véhicules électriques contiennent de nombreuses molécules comme les protéines (par exemple, les enzymes, la transduction de signaux, le facteur de biogenèse), les lipides (p. ex. le céramide, le cholestérol) ou les acides nucléiques (p. ex., ADN, ARNm ou miARN) agissant comme régulateurs directs ou indirects des activités cellulairesbénéficiaires 14. C’est pourquoi des études méthodologiques ont également été réalisées sur des cellules immunitaires pour isoler les véhicules électriques et caractériser pleinement leurs signatures protéiques18,19.
Les premières études ont démontré la libération d’exosomes de la microglie de rat de culture primaire comme mécanisme inductible suivant une activation Wnt3a- ou sérotonine-dépendante20,21. Fonctionnellement dans le SNC, les véhicules électriques dérivés de microglies régulent la libération de vésicule synaptique par des terminaux présynaptiques dans les neurones contribuant au contrôle de l’excitabilité neuronale22,23. Les véhicules électriques dérivés de microglies pourraient également propager la réponse inflammatoire cytokines-négociée dans les grandes régions du cerveau24,25. Fait important, les ligands divers pour la famille des récepteurs de péage-comme pourrait activer des productions spécifiques de véhicules électriques dans la microglie26. Par exemple, des études in vitro montrent que les lignées cellulaires BV2 de microglie activées par LPS produisent un contenu EV différentiel comprenant des cytokines pro-inflammatoires27. Par conséquent, la diversité fonctionnelle des sous-populations de cellules immunitaires dans le SNC, les microglies et les BMDM infiltrés, pourrait être évaluée par leurs propres populations de véhicules électriques, y compris l’impact des véhicules électriques sur les cellules bénéficiaires et l’identification du contenu des véhicules électriques.
Nous avons déjà décrit des méthodes pour évaluer les propriétés fonctionnelles des véhicules électriques dérivés des microglies et des BMDM après leur isolement16,19. Dans le présent rapport, nous proposons d’évaluer indépendamment l’effet des véhicules électriques dérivés de microglies sur la excroissance neurite, et l’effet des véhicules électriques dérivés du macrophage sur le contrôle des agrégats de cellules de gliome. Cette étude propose également une vaste analyse protéomique des fractions EV afin de valider la procédure d’isolement des ev et d’identifier les signatures de protéines biologiquement actives. Les effets bénéfiques et le déchiffrement moléculaire du contenu EV pourraient aider leur manipulation possible et l’utilisation comme agents thérapeutiques dans les troubles du cerveau.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12% Mini-PROTEAN&nbsp;TGX Precast Protein Gels</td>
<td>Bio-rad</td>
<td>4561045EDU</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>A955-1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon 50 kDa centrifugal filter</td>
<td>Merck</td>
<td>UFC505024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>9830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>HSP90 &alpha;/&beta; antibody (RRID: AB_675659)</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-13119</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>B27 Plus supplement</td>
<td>Gibco</td>
<td>A3582801</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BenchMixer V2 Vortex Mixer</td>
<td>Benchmark Scientific</td>
<td>BV1003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>5000006</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C18 ZipTips</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>ZTC18S096</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C6 rat glioma cell</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CCL-107</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Canonical tubes</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62.554.002</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5804000010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>CO2 Incubator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Confocal microscope LSM880</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>LSM880</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>Marienfeld</td>
<td>111580</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture Dish (60 mm)</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43819</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Gibco</td>
<td>41966029</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Electron microscope JEM-2100</td>
<td>JEOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>03777-10G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>ED-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Exo-FBS</td>
<td>Ozyme</td>
<td>EXO-FBS-50A-1</td>
<td>Exosome depleted FBS</td>
</tr>
<tr>
<td>ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.exocarta.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Gibco</td>
<td>16140071</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Horse Serum</td>
<td>Biowest</td>
<td>S0960-500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtropur S 0.2</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>83.1826.001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fisherbrand&nbsp;Q500 Sonicator with Probe</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>12893543</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>FlexAnalysis</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence mounting medium</td>
<td>Agilent</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic Acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>695076</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formvar-carbon coated copper grids</td>
<td>Agar scientific Ltd</td>
<td>AGS162-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>340855</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Euromedex</td>
<td>17535-AAT</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Idoacetamide</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
<td>Expedeon</td>
<td>ISB1L</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Invert light microscope CKX53</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>LabTek II 8 wells</td>
<td>&nbsp;Nunc</td>
<td>154534</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laemmli 2X</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610737</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>Corning</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MaxQuant software (proteins identification software)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/maxquant/</td>
</tr>
<tr>
<td>MBT Polish stell</td>
<td>Brucker</td>
<td>8268711</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MEM 10X</td>
<td>Gibco</td>
<td>21090-022</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylcellulose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M6385-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MiliQ water</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Milk</td>
<td>Regilait</td>
<td>REGILAIT300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1658000FC</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MonoP FPLC column</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Nanosight NS300</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>NS300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight NTA software v3.2</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight syringe pump</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nitrocellulose membrane</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>10600007</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>Fluka</td>
<td>56741</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunc multidish 24 wells</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Electro microscopy Science</td>
<td>15713</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PC-12 cell line</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CRL-1721</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide calibration mix</td>
<td>LaserBio Labs</td>
<td>C101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>115-035-003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Perseus software (Processing of identified proteins)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-362065</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>78830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Saline</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190094</td>
<td>no calcium, no magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>pluriStrainer M/ 60 &micro;m</td>
<td>pluriSelect</td>
<td>43-50060</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6407</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>355651</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830-20TAB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PureCol</td>
<td>Cell Systems</td>
<td>5005</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Q-Exactive mass spectrometer</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>rapifleX mass spectrometer</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat cortical neurons</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R882N-20</td>
<td>Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Macrophage &amp; Microglia Culture Medium</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R620K-100</td>
<td>Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary macrophages</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R8818-10a</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary microglia</td>
<td>Lonza</td>
<td>RG535</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sepharose CL-2B</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17014001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>Dustsher</td>
<td>100204</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Scharlau</td>
<td>SO0227</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L3771</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7920-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hydroxide</td>
<td>Scharlab</td>
<td>SO0420005P</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyrophosphate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S6422-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>String software (functional protein association networks)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://string-db.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperSignal West Dura extended Duration Substrate</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>34075</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe 1.0 mL</td>
<td>Terumo</td>
<td>8SS01H1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1703940</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Interchim</td>
<td>UP031657</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-Glycine</td>
<td>Euromedex</td>
<td>EU0550</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2287</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>A95765</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>342184</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Uranyl acetate</td>
<td>Agar Scientific Ltd</td>
<td>AGR1260A</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>WHA10347510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C2020-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment

L’état neuroinflammatoire du système nerveux central (SNC) joue un rôle clé dans les conditions physiologiques et pathologiques. Les microglies, les cellules immunitaires résidentes dans le cerveau, et parfois les macrophages infiltrés dérivés de la moelle osseuse (BMDM), régulent le profil inflammatoire de leur microenvironnement dans le SNC. Il est maintenant admis que les populations extracellulaires de vésicule (EV) des cellules immunitaires agissent comme médiateurs immunitaires. Ainsi, leur collecte et leur isolement sont importants pour identifier leur contenu, mais aussi évaluer leurs effets biologiques sur les cellules bénéficiaires. Les données actuelles mettent en évidence les exigences chronologiques pour l’isolement des ev des cellules de microglies ou des macrophages sanguins, y compris les étapes ultracentrifugation et chromatographie de taille-exclusion (SEC). Une analyse protéomique non ciblée a permis la validation des signatures protéiques comme marqueurs EV et a caractérisé le contenu biologiquement actif de EV. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont également été utilisés fonctionnellement sur la culture primaire des neurones pour évaluer leur importance en tant que médiateurs immunitaires dans la excroissance neurite. Les résultats ont montré que les véhicules électriques dérivés de microglies contribuent à faciliter la excroissance neurite in vitro. En parallèle, les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été fonctionnellement utilisés comme médiateurs immunitaires dans les cultures sphéroïdes des cellules de glioma de C6, les résultats montrant que ces véhicules électriques contrôlent l’invasion de cellules de gliome in vitro. Ce rapport met en évidence la possibilité d’évaluer les fonctions des cellules immunitaires à médiation EV, mais aussi de comprendre les bases moléculaires d’une telle communication. Ce déchiffrement pourrait favoriser l’utilisation de vésicules naturelles et/ou la préparation in vitro de vésicules thérapeutiques afin d’imiter les propriétés immunitaires dans le microenvironnement des pathologies du SNC.

L’un des principaux défis à l’attribution des effets biologiques aux vésicules extracellulaires (VE) est la capacité d’isoler les véhicules électriques de l’ensemble du milieu de la culture. Dans ce rapport, nous présentons une méthode utilisant l’ultracentrifugation (UC) et la chromatographie de taille-exclusion (SEC) qui est couplée à l’analyse à grande échelle des signatures de protéine pour valider des marqueurs EV et identifier des composés bioactifs. Les véhicules électriques dérivés d...

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Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Le présent rapport souligne les exigences chronologiques pour l’isolement extracellulaire de vésicule (EV) des microglies ou des macrophages de sang. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués en tant que régulateurs de la excroissance neurite tandis que les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été étudiés dans le contrôle de l’invasion de cellules de glioma C6 dans les essais in vitro. L’objectif est de mieux comprendre ces fonctions EV en tant que médiateurs immunitaires dans des microenvironnements spécifiques.

Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Ce protocole permet de garantir un bon isolement des vésicules extracellulaires et la notification d’un plus grand nombre de protéines EBDF. Par rapport à d’autres techniques d’isolement, celui-ci soutient qu’il s’agit de plus d’intégrité et d’activités verticales. Les VE sont de plus en plus étudiés en LC ainsi que dans des conditions pathologiques.Cette méthode peut être appliquée à tous les systèmes que nous choisissons de caractériser et d’étudier les VE. Pour ce contenu ou l’éthique biologique une attention particulière est nécessaire lors de l’itération des VE, comme dans la culture se traduit par les expériences suivantes. Une démonstration visuelle est essentielle pour accueillir des équipements spécifiques tels qu’une colonne de chromatographie d’exclusion de taille maison ainsi que la participation du compteur de nanoparticules et du spectromètre de masse.Antonella Raffo-Romero, du laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Commencez par pré-isoler les vésicules extracellulaires, ou VE, à partir du milieu de l’état. Transférez la condition au milieu de culture des cultures de microglies ou de macrophages dans un tube conique et centrifugez-la à 1200 fois G pendant 10 minutes pour pelleter les cellules.Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique et une centrifugeuse pendant encore 20 minutes pour éliminer les corps apoptotiques. Transférer ensuite le supernatant dans un tube en polycarbonate de 10,4 millilitres. Placez le tube dans un rotor TI 70,1 et une centrifugeuse ultra à 100 000 fois G pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius pour pelleter les VE.Après centrifugation, jeter le supernatant et réutiliser la pastille en 200 microlitres de 0,2 micromètre filtré PBS. Pour isoler les VE, préparez une colonne chromatographie d’exclusion de taille maison en lavant et stérilisant une colonne de chromatographie en verre, et en plaçant un filtre de 60 microlitres au fond. Empilez la colonne avec la matrice de base de filtration de gel d’agarose croisée pour créer une phase stationnaire de 0,6 centimètre de diamètre et de 20 centimètres de hauteur.Rincez ensuite la phase avec 50 millilitres de 0,2 micromètre filtré PBS. Si nécessaire, conservez la colonne à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Placez la pastille EV résuspendue sur la phase stationnaire et recueillez 20 fractions séquentielles de 250 microlitres tout en continuant à ajouter du PBS au sommet de la phase stationnaire.Les fractions peuvent être stockées à moins 20 degrés Celsius. Pour effectuer une analyse de suivi des nanoparticules, faire une dilution de chaque fraction avec 0,2 micromètre filtré PBS et vortex pour éliminer les agrégats. Mettez la solution dans une seringue d’un millilitre et placez-la dans la pompe à seringues automatisée.Ensuite, réglez les paramètres de la caméra au niveau de gain d’écran approprié et au niveau de la caméra et cliquez sur Exécuter. Chargez l’échantillon dans la chambre d’analyse avec un taux d’infusion de 1000 pendant 15 secondes. Puis diminuer et stabiliser le flux de vitesse pour l’enregistrement vidéo à un taux de perfusion de 25 pendant 15 secondes.Capturez trois vidéos consécutives de 60 secondes du flux de particules. Ajustez ensuite le niveau de la caméra et le seuil de détection avant l’analyse vidéo. Cliquez sur Paramètres OK pour commencer l’analyse, et cliquez sur Export une fois terminé.Lavez le système avec un millilitre de 0,2 micromètre filtré PBS entre chaque fraction. Si vous effectuez une analyse par microscopie électronique, utilisez un filtre centrifuge de 50 kilodaltons pour concentrer les fractions d’intérêt de la chromatographie d’exclusion de taille. Pour l’extraction des protéines, mélanger 50 microlitres de tampon RIPA avec l’échantillon ev pendant cinq minutes sur la glace.Sonicate les échantillons trois fois à 500 Watts et 20 kilohertz pendant cinq secondes. Puis enlever les débris vésiculaires en centrifugant à 20 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir isolé les protéines, effectuer la migration des protéines dans le gel empilage d’un gel polyacrylique de 12%.Mélanger les protéines dans le gel avec Coomassie Blue pendant 20 minutes à température ambiante. Excisez ensuite chaque morceau de gel coloré et coupez-le en petits morceaux. Mettez les morceaux de gel à travers une série de lavages successifs tels que décrits dans le manuscrit.Ensuite, séchez-les complètement avec un concentrateur à vide. Après séchage effectuer la réduction des protéines avec 100 microlitres de bicarbonate d’ammonium millimolaire contenant 10 millimolar Dithiothreitol pendant une heure à 56 degrés Celsius. Ensuite, effectuez l’alkylation protéique avec 100 microlitres de bicarbonate d’ammonium millimolaire contenant 50 millimolar iodoacetamide pendant 45 minutes dans l’obscurité.Lavez les morceaux de gel selon les instructions manuscrites et séchez-les complètement sur le concentrateur à vide. Effectuez la digestion des protéines avec 50 microlitres de trypsine en bicarbonate d’ammonium millimolaire à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, extraire les protéines digérées du gel avec 50 microlitres de 100% ACN pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis 15 minutes à température ambiante en remuant continuellement.Puis extraire les protéines deux fois avec 50 microlitres de 5%TFA en bicarbonate d’ammonium millimolaire, tout en remuant en continu pendant 20 minutes. Ajouter 100 microlitres d’ACN et continuer à remuer pendant 10 minutes. Ensuite, séchez les protéines et réutilisez-les en 20 microlitres de 0,1% TFA.Desalt l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres avec c 18 supports de phase inverse pour desaler et concentrer les peptides. Ensuite, élisez-les avec ACN et 0,1% d’acide formique. Séchez complètement l’échantillon à l’aide d’un concentrateur à vide et réutilisez-le dans 20 microlitres d’ACN et 0,1 % d’acide formique pour la spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide, ou LC-MS.Chargez les peptides digérés dans l’instrument et effectuez une analyse d’échantillon. Pour confirmer l’isolement ev, chaque fraction de CSC a été soumise à une analyse de suivi de nanoparticules. Le nombre de particules était significativement plus élevé en fractions cinq, six et sept.Ces fractions ont été mis en commun dans un échantillon 2F-EV positif, et comparés aux fractions négatives ev, 1F-EV négatif et 3F-EV négatif, en utilisant l’analyse de tache occidentale. Les résultats ont montré la présence de la protéine de choc thermique 90 dans l’échantillon positif ev et dans le contrôle de lysate de cellules. La microscopie électronique de l’échantillon positif à ev a montré des VE dans une gamme de taille autour de 100 nanomètres et 400 nanomètres.L’analyse protéomique a été effectuée afin d’identifier les protéines contaminantes dans les échantillons négatifs de ve et de caractériser la teneur en protéines des VE. Les protéines identifiées ont été comparées entre 1F-EV négatif et un 2F-EV échantillons positifs, ainsi qu’entre 2F-EV positif et un 3F-EV échantillons négatifs. À l’aide de cette méthode non ciblée, un pool de 536 protéines a été soumis à la base de données ExoCarta et a mené à l’identification de 86 protéines associées à l’EV.En outre, ce pool a également permis d’identifier les interactions protéiques et leurs fonctions biologiques associées. Il a été constaté que les protéines de l’échantillon positif ev joué un rôle dans les voies immunitaires et neuroprotectrices. Les effets des VE dérivés des microglies ont été évalués sur l’excroissance des neurites avec les cellules PC 12 et les neurones primaires des rats.Une augmentation significative de la croissance a été observée chez les VE par rapport au contrôle. Des VE macrophage-dérivés ont été évalués sur l’invasion cellulaire de gliome. Il a été constaté que les VE altéré la croissance et l’invasion des sphéroïdes gliomes.La chose la plus importante à retenir est de vraiment soigneusement jeter le supernatant de l’étape d’ultracentrifugation afin d’éviter la perte de VE dans cette procédure. Nous privilégions une approche à grande échelle et non ciblée pour nous concentrer sur l’ensemble de la teneur en protéines, puis sur l’effet vertical des VE. de sorte que le contenu dans les acides nucléiques peut être associé à l’aide de l’analyse.Avec cette approche d’une culture primaire, nous sommes en mesure de discriminer entre les protéines EV et les protéines libres qui sont en dehors de la variété. Reste donc à savoir si cette coagulation est artifactual ou plutôt une autre

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