Name: characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment
Uploaded: 2020-06-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment at JoVE.com

Die vorgestellte Arbeit wurde von der Ministére de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche und INSERM unterstützt. Wir danken der BICeL- Campus Scientific City Facility für den Zugang zu Instrumenten und technischen Ratschlägen. Wir danken Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard und Isabelle Fournier für die Unterstützung der Massenspektrometrie. Wir danken Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli und Pierre-Eric Sautiére für ihren starken Beitrag zu den wissenschaftlichen und technischen Entwicklungen.

1. Primärkultur von Mikroglia/Makrophagen
<ol><li>
Primärkultur der Mikroglia
	<ol>
<li>Kultur kommerzielle Ratte primäre Mikroglia (2 x 106 Zellen) (siehe Tabelle der Materialien) in Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% exosomenfreies Serum, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 9,0 g/L Glukose bei 37 °C und 5% CO2.</li>
		<li>Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 48-Stunden-Kultur und gehen Sie zur Isolierung von Ele...

Das zentralnervöse System (ZNS) ist ein komplexes Gewebe, in dem die Zell-zu-Zell-Kommunikation normale neuronale Funktionen reguliert, die für die Homöostase30notwendig sind. Elektrofahrzeuge werden heute weithin untersucht und als wichtige molekulare Ladungen für die Zell-zu-Zell-Kommunikation beschrieben31. Sie liefern speziell einen Cocktail von Mediatoren an Empfängerzellen und beeinflussen so ihre Funktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen<sup class...

Viele Neuropathologien stehen im Zusammenhang mit dem neuro-inflammatorischen Zustand, der ein komplexer Mechanismus ist, der zunehmend in Betracht gezogen wird, aber immer noch schlecht verstanden wird, weil die Immunprozesse vielfältig sind und von der Zellumgebung abhängen. Tatsächlich beinhalten die ZNS-Erkrankungen nicht systematisch die gleichen Aktivierungssignale und Immunzellpopulationen, so dass die pro- oder entzündungshemmenden Reaktionen als Ursachen oder Folgen von Pathologien schwer zu bewerten sind. Die hirnresidenten Makrophagen, die als "Mikroglia" bezeichnet werden, scheinen an der Schnittstelle zwischen Nerven- und Immunsystem zu sein1. Mikroglia haben einen myeloischen Ursprung und werden aus dem Dottersack während der primitiven Hämatopoese abgeleitet, um das Gehirn zu kolonisieren, während periphere Makrophagen von der fetalen Leber während der definitiven Hämatopoese abgeleitet werden, um periphere Makrophagen zu werden2. Die Mikrogliazellen kommunizieren mit Neuronen und neuronabgeleiteten Gliazellen wie Astrozyten und Oligodendrozyten3. Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass Mikroglia an neuronaler Plastizität während der ZNS-Entwicklung und der Homöostase von Erwachsenengewebe beteiligt ist, und auch im entzündlichen Zustand, der mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert ist4,5. Andernfalls kann die Integrität der Blut-Hirn-Schranke in anderen ZNS-Pathologien beeinträchtigt werden. Die Immunantworten, insbesondere bei Glioblastom-Multiforme-Krebs, werden nicht nur von Mikroglia-Zellen unterstützt, da die Blut-Hirn-Schranke durch angiogene Prozesse und das Vorhandensein von Lymphgefäßen6,7reorganisiert wird. Daher tritt eine große Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs) Infiltration im Hirntumor durch tumorabhängige Angiogenesemechanismen8auf. Die Krebszellen üben einen signifikanten Einfluss auf infiltrierte BMDMs aus, was zu immunsuppressiven Eigenschaften und Tumorwachstum9führt. So ist die Kommunikation zwischen den Immunzellen und ihrer Gehirnmikroumgebung schwer zu verstehen, da der Zellursprung und die Aktivierungssignale unterschiedlich sind10,11. Es ist daher interessant, die Funktionen immunzellassoziierter molekularer Signaturen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. In diesem Zusammenhang kann die Zell-Zell-Kommunikation zwischen Immunzellen und Zellmikroumgebung durch die Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) untersucht werden.
Die Elektrofahrzeuge werden mehr und mehr in der Regulierung von Immunfunktionen unter gesunden sowie pathologischen Bedingungen untersucht12,13. Zwei Populationen, Exosomen und Mikrovesiken, können berücksichtigt werden. Sie präsentieren unterschiedliche Biogenese und Größenbereiche. Die Exosomen sind Vesikel von 30 bis 150 nm Durchmesser und werden aus dem endosomalen System erzeugt und bei der Fusion von multivesicularen Körpern (MVBs) mit der Plasmamembran abgesondert. Die Mikrovesiken haben einen Durchmesser von etwa 100–1.000 nm und werden durch einen nach außen gerichteten Aufblühen aus der Zellplasmamembran14erzeugt. Da die Exosome n.A.-Mikrovesik-Diskriminierung je nach Größe und molekularen Mustern immer noch schwer zu realisieren ist, werden wir im vorliegenden Bericht nur den Begriff Elektrofahrzeuge verwenden. Die EV-assoziierte Kommunikation im ZNS stellt einen Ahnenmechanismus dar, da Studien ihre Beteiligung an wirbellosen Arten wie Nematoden, Insekten oder Anneliden15,16zeigten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, die zeigen, dass Elektrofahrzeuge mit Zellen verschiedener Arten kommunizieren können, diesen Mechanismus als Schlüsselschlosssystem, das zunächst auf der Oberflächenmolekülerkennung zwischen Vesikeln und Empfängerzellen basiert und dann die Aufnahme von Mediatoren16,17ermöglicht. Tatsächlich enthalten die Elektrofahrzeuge viele Moleküle wie Proteine (z. B. Enzyme, Signaltransduktion, Biogenesefaktor), Lipide (z. B. Ceramid, Cholesterin) oder Nukleinsäuren (z. B. DNA, mRNA oder miRNAs), die als direkte oder indirekte Regulatoren der Empfängerzellaktivitäten14wirken. Deshalb wurden auch methodische Studien an Immunzellen durchgeführt, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und ihre Proteinsignaturen vollständig zu charakterisieren18,19.
Die frühesten Studien zeigten die Freisetzung von Exosomen aus primär kultivierter Rattenmikroglia als induzierbaren Mechanismus nach einer Wnt3a- oder Serotonin-abhängigen Aktivierung20,21. Funktionell im ZNS regulieren mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge die synaptische Vesikelfreisetzung durch präsynaptische Terminals in Neuronen, die zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit beitragen22,23. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge könnten auch Zytokine-vermittelte Entzündungsreaktionen in großen Hirnregionen24,25vermehren. Wichtig ist, dass die verschiedenen Liganden für die gebührenähnliche Rezeptorfamilie bestimmte Produktionen von Elektrofahrzeugen in der Mikroglia26aktivieren könnten. Beispielsweise zeigen In-vitro-Studien, dass LPS-aktivierte Mikroglia BV2-Zelllinien differenzielle EV-Gehalte einschließlich pro-inflammatorische Zytokineproduzieren 27. Daher könnte die funktionelle Vielfalt von Immunzellsubpopulationen in den ZNS-, Mikroglia- und infiltrierenden BMDMs durch ihre eigenen EV-Populationen bewertet werden, einschließlich der Auswirkungen von Elektrofahrzeugen auf Empfängerzellen und der Identifizierung von EV-Inhalten.
Wir haben zuvor Methoden beschrieben, um die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia- und BMDM-abgeleiteten Elektrofahrzeugen nach deren Isolierung zu bewerten16,19. Im vorliegenden Bericht schlagen wir vor, die Wirkung von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen auf das Neuritenwachstum und die Wirkung von makrophageabgeleiteten Elektrofahrzeugen auf die Kontrolle von Gliomzellaggregaten unabhängig zu bewerten. Diese Studie schlägt auch eine breit angelegte proteomische Analyse der EV-Fraktionen vor, um das EV-Isolationsverfahren zu validieren und die biologisch aktiven Proteinsignaturen zu identifizieren. Die wohltuende Wirkung und die molekulare Entschlüsselung von EEV-Inhalten könnten ihnen helfen, sie zu manipulieren und als therapeutische Mittel bei Hirnerkrankungen zu verwenden.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12% Mini-PROTEAN&nbsp;TGX Precast Protein Gels</td>
<td>Bio-rad</td>
<td>4561045EDU</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>A955-1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon 50 kDa centrifugal filter</td>
<td>Merck</td>
<td>UFC505024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>9830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>HSP90 &alpha;/&beta; antibody (RRID: AB_675659)</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-13119</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>B27 Plus supplement</td>
<td>Gibco</td>
<td>A3582801</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BenchMixer V2 Vortex Mixer</td>
<td>Benchmark Scientific</td>
<td>BV1003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>5000006</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C18 ZipTips</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>ZTC18S096</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C6 rat glioma cell</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CCL-107</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Canonical tubes</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62.554.002</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5804000010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>CO2 Incubator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Confocal microscope LSM880</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>LSM880</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>Marienfeld</td>
<td>111580</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture Dish (60 mm)</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43819</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Gibco</td>
<td>41966029</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Electron microscope JEM-2100</td>
<td>JEOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>03777-10G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>ED-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Exo-FBS</td>
<td>Ozyme</td>
<td>EXO-FBS-50A-1</td>
<td>Exosome depleted FBS</td>
</tr>
<tr>
<td>ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.exocarta.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Gibco</td>
<td>16140071</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Horse Serum</td>
<td>Biowest</td>
<td>S0960-500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtropur S 0.2</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>83.1826.001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fisherbrand&nbsp;Q500 Sonicator with Probe</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>12893543</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>FlexAnalysis</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence mounting medium</td>
<td>Agilent</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic Acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>695076</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formvar-carbon coated copper grids</td>
<td>Agar scientific Ltd</td>
<td>AGS162-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>340855</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Euromedex</td>
<td>17535-AAT</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Idoacetamide</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
<td>Expedeon</td>
<td>ISB1L</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Invert light microscope CKX53</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>LabTek II 8 wells</td>
<td>&nbsp;Nunc</td>
<td>154534</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laemmli 2X</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610737</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>Corning</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MaxQuant software (proteins identification software)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/maxquant/</td>
</tr>
<tr>
<td>MBT Polish stell</td>
<td>Brucker</td>
<td>8268711</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MEM 10X</td>
<td>Gibco</td>
<td>21090-022</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylcellulose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M6385-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MiliQ water</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Milk</td>
<td>Regilait</td>
<td>REGILAIT300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1658000FC</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MonoP FPLC column</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Nanosight NS300</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>NS300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight NTA software v3.2</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight syringe pump</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nitrocellulose membrane</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>10600007</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>Fluka</td>
<td>56741</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunc multidish 24 wells</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Electro microscopy Science</td>
<td>15713</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PC-12 cell line</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CRL-1721</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide calibration mix</td>
<td>LaserBio Labs</td>
<td>C101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>115-035-003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Perseus software (Processing of identified proteins)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-362065</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>78830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Saline</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190094</td>
<td>no calcium, no magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>pluriStrainer M/ 60 &micro;m</td>
<td>pluriSelect</td>
<td>43-50060</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6407</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>355651</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830-20TAB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PureCol</td>
<td>Cell Systems</td>
<td>5005</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Q-Exactive mass spectrometer</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>rapifleX mass spectrometer</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat cortical neurons</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R882N-20</td>
<td>Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Macrophage &amp; Microglia Culture Medium</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R620K-100</td>
<td>Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary macrophages</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R8818-10a</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary microglia</td>
<td>Lonza</td>
<td>RG535</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sepharose CL-2B</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17014001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>Dustsher</td>
<td>100204</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Scharlau</td>
<td>SO0227</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L3771</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7920-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hydroxide</td>
<td>Scharlab</td>
<td>SO0420005P</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyrophosphate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S6422-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>String software (functional protein association networks)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://string-db.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperSignal West Dura extended Duration Substrate</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>34075</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe 1.0 mL</td>
<td>Terumo</td>
<td>8SS01H1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1703940</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Interchim</td>
<td>UP031657</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-Glycine</td>
<td>Euromedex</td>
<td>EU0550</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2287</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>A95765</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>342184</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Uranyl acetate</td>
<td>Agar Scientific Ltd</td>
<td>AGR1260A</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>WHA10347510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C2020-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment

Der neuroinflammatorische Zustand des Zentralnervensystems (ZNS) spielt bei physiologischen und pathologischen Erkrankungen eine Schlüsselrolle. Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn und manchmal die infiltrierenden Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs), regulieren das entzündungshemmende Profil ihrer Mikroumgebung im ZNS. Es wird nun akzeptiert, dass die extrazellulären Vesikelpopulationen (EV) aus Immunzellen als Immunmediatoren fungieren. Daher sind ihre Sammlung und Isolierung wichtig, um ihren Inhalt zu identifizieren, aber auch ihre biologischen Auswirkungen auf Empfängerzellen zu bewerten. Die vorliegenden Daten heben die chronologischen Anforderungen an die EV-Isolierung von Mikrogliazellen oder Blutmakrophagen hervor, einschließlich der Schritte zur Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC). Eine nicht zielgerichtete proteomische Analyse ermöglichte die Validierung von Proteinsignaturen als EV-Marker und charakterisierte den biologisch aktiven EV-Gehalt. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden auch funktionell auf der Primärkultur von Neuronen verwendet, um ihre Bedeutung als Immunmediatoren im Neuritenwachstum zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge dazu beitragen, das Neuritenwachstum in vitro zu erleichtern. Parallel dazu wurden von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge funktionell als Immunmediatoren in Sphäroidkulturen von C6-Gliomzellen eingesetzt, die Ergebnisse zeigten, dass diese EVs die Gliomzellinvasion in vitro kontrollieren. Dieser Bericht hebt die Möglichkeit hervor, die EV-vermittelten Immunzellfunktionen zu bewerten, aber auch die molekularen Grundlagen einer solchen Kommunikation zu verstehen. Diese Entschlüsselung könnte die Verwendung natürlicher Vesikel und/oder die In-vitro-Vorbereitung von therapeutischen Vesikeln fördern, um Immuneigenschaften in der Mikroumgebung von ZNS-Pathologien nachzuahmen.

Eine der größten Herausforderungen bei der Zuordnung von bioulären Vesikeln (EVs) ist die Fähigkeit, die Elektrofahrzeuge vom gesamten Kulturmedium zu isolieren. In diesem Bericht stellen wir eine Methode mit Ultrazentrifugation (UC) und Größenausschlusschromatographie (SEC) vor, die an die groß angelegte Analyse von Proteinsignaturen gekoppelt ist, um EV-Marker zu validieren und bioaktive Verbindungen zu identifizieren. Die makrophagen- oder mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeuge wurden nach einer 24-h- bzw. 48-...

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Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, eine gute Isolierung von extrazellulären Vesikeln und die Meldung einer höheren Anzahl von EBDF-Proteinen zu gewährleisten. Im Vergleich zu anderen Isolationstechniken behauptet diese, dass es mehr Integrität und vertikale Aktivitäten ist. Elektrofahrzeuge werden mehr und mehr unter LC und pathologischen Bedingungen untersucht.Diese Methode kann auf alle Systeme angewendet werden, die wir wählen, um die Elektrofahrzeuge zu charakterisieren und zu studieren. Für diesen Inhalt oder die biologische Ethik ist bei der Iterierung von Elektrofahrzeugen besondere Aufmerksamkeit geboten, wie in der Kultur zu den folgenden Experimenten führt. Eine visuelle Demonstration ist entscheidend für die Aufnahme spezifischer Geräte wie eine hausgemachte Farbtonographiekolonne für Größenausschluss sowie die Einbeziehung von Nanopartikelzählern und Massenspektrometern.Als Beweis für das Verfahren wird Antonella Raffo-Romero aus dem Labor beitragen. Beginnen Sie mit der Vorisolierung extrazellulärer Vesikel oder Elektrofahrzeuge aus dem Zustandsmedium. Übertragen Sie den Zustand auf Kulturmedium von Mikroglia- oder Makrophagenkulturen in ein konisches Rohr und zentrifugieren Sie ihn bei 1, 200 mal G für 10 Minuten, um die Zellen zu pellet.Übertragen Sie den Überstand für weitere 20 Minuten in ein neues konisches Rohr und eine neue Zentrifuge, um apoptotische Körper zu eliminieren. Dann den Überstand in ein 10,4 Milliliter Polycarbonat-Rohr geben. Legen Sie das Rohr in einen 70,1 TI Rotor und Ultrazentrifuge bei 100. 000 mal G für 90 Minuten bei vier Grad Celsius, um die EVs zu pellet.Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet in 200 Mikrolitern 0,2 Mikrometer gefiltertem PBS wieder aufsetzen. Um die Elektrofahrzeuge zu isolieren, bereiten Sie eine hausgemachte Spalte mit Ausschlusschromatographie vor, indem Sie eine Glaschromatographiesäule waschen und sterilisieren und einen 60-Mikroliter-Filter an der Unterseite platzieren. Stapeln Sie die Säule mit vernetzter Agarose-Gel-Filtrationsbasismatrix, um eine stationäre Phase mit einem Durchmesser von 0,6 Zentimetern und einer Höhe von 20 Zentimetern zu schaffen.Dann spülen Sie die Phase mit 50 Milliliter0,2 Mikrometer gefilterten PBS. Bewahren Sie die Säule bei Bedarf bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung auf. Legen Sie das resuspendierte EV-Pellet auf die stationäre Phase und sammeln Sie 20 sequentielle Fraktionen von 250 Mikrolitern, während Sie weiterhin PBS an der Spitze der stationären Phase hinzufügen.Die Fraktionen können bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um eine Nanopartikel-Tracking-Analyse durchzuführen, machen Sie eine Verdünnung jeder Fraktion mit 0,2 Mikrometer gefilterten PBS und Wirbel es, um Aggregate zu beseitigen. Legen Sie die Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze und legen Sie sie in die automatische Spritzenpumpe.Passen Sie als Nächstes die Kameraeinstellungen an die entsprechende Bildschirmverstärkungsstufe und Kameraebene an und klicken Sie auf Ausführen. Laden Sie die Probe 15 Sekunden lang in die Analysekammer mit einer Infusionsrate von 1000. Verringern und stabilisieren Sie dann den Geschwindigkeitsfluss für Videoaufnahmen auf eine Infusionsrate von 25 für 15 Sekunden.Erfassen Sie drei aufeinander folgende 60-Sekunden-Videos des Partikelflusses. Passen Sie dann den Kamerapegel und den Erkennungsschwellenwert vor der Videoanalyse an. Klicken Sie auf Einstellungen OK, um die Analyse zu starten, und klicken Sie auf Exportieren, wenn Sie fertig sind.Waschen Sie das System mit einem Milliliter 0,2 Mikrometer gefilterten PBS zwischen jeder Fraktion. Wenn Sie eine Elektronenmikroskopieanalyse durchführen, verwenden Sie einen 50 Kilodalton-Zentrifugalfilter, um die Größenausschlusschromatographie-Fraktionen von Interesse zu konzentrieren. Für die Proteinextraktion 50 Mikroliter RIPA-Puffer mit der EV-Probe fünf Minuten auf Eis mischen.Sonicate die Proben dreimal mit 500 Watt und 20 Kilohertz für fünf Sekunden. Dann entfernen Sie vesikuläre Trümmer durch Zentrifugieren bei 20.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Isolierung der Proteine führen Sie die Proteinmigration im Stapelgel eines 12%polyacrylen Gels durch.Mischen Sie die Proteine im Gel mit Coomassie Blue für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Dann verbrauchen Sie jedes farbige Gelstück und schneiden Sie es in kleine Stücke. Legen Sie die Gelstücke durch eine Reihe von aufeinanderfolgenden Waschungen, wie im Manuskript beschrieben.Dann trocknen Sie sie vollständig mit einem Vakuumkonzentrator. Nach dem Trocknen führen Sie Proteinreduktion mit 100 Mikroliter 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat mit 10 Millimolar Dithiothreitol für eine Stunde bei 56 Grad Celsius. Als nächstes führen Sie Proteinalkylierung mit 100 Mikrolitern von 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat mit 50 Millimolar Iodoacetamid für 45 Minuten im Dunkeln.Waschen Sie die Gelstücke nach Manuskriptanweisungen und trocknen Sie sie vollständig auf dem Vakuumkonzentrator. Führen Sie die Proteinverdauung mit 50 Mikroliter Trypsin in 20 Millimolar Ammoniumbicarbonat bei 37 Grad Celsius über Nacht durch. Am nächsten Tag die verdauten Proteine mit 50 Mikrolitern 100%ACN für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren aus dem Gel extrahieren.Dann extrahieren Sie die Proteine zweimal mit 50 Mikroliter 5%TFA in 20 Millimolar Ammoniumbicarbonat, während kontinuierlich für 20 Minuten rühren. 100 Mikroliter ACN hinzufügen und 10 Minuten weiterrühren. Anschließend die Proteine trocknen und in 20 Mikrolitern 0,1%TFA wieder aussetzen.Die Probe mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze mit C 18-Reverse-Phasen-Medien zur Entsalzung und Konzentration von Peptiden entsalzen. Dann elute sie mit ACN und 0,1%Ameisensäure. Trocknen Sie die Probe vollständig mit einem Vakuumkonzentrator und setzen Sie sie in 20 Mikroliter ACN und 0,1% Ameisensäure für flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie oder LC-MS wieder auf.Laden Sie die verdauten Peptide in das Gerät und führen Sie eine Probenanalyse durch. Um die EV-Isolation zu bestätigen, wurde jede SCC-Fraktion einer Nanopartikel-Tracking-Analyse unterzogen. Die Partikelzahl war in den Fraktionen fünf, sechs und sieben deutlich höher.Diese Fraktionen wurden in einer Stichprobe 2F-EV positiv gepoolt, und verglichen mit EV-negativen Fraktionen, 1F-EV negativ und 3F-EV negativ, mit Western Blot-Analyse. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von Hitzeschockprotein 90 in der EV-positiven Probe und in der Zelllysatkontrolle. Die Elektronenmikroskopie der EV-positiven Probe zeigte Elektrofahrzeuge im Größenbereich von etwa 100 Nanometern und 400 Nanometern.Die Proteomik-Analyse wurde durchgeführt, um Kontaminantenproteine in EV-negativen Proben zu identifizieren und den Proteingehalt von Elektrofahrzeugen zu charakterisieren. Die identifizierten Proteine wurden zwischen 1F-EV-Negativ- und einer 2F-EV-positiven Probe sowie zwischen 2F-EV-positiven und einer 3F-EV-negativen Probe verglichen. Mit dieser nicht zielgerichteten Methode wurde ein Pool von 536 Proteinen in die ExoCarta-Datenbank eingebracht und führte zur Identifizierung von 86 EV-assoziierten Proteinen.Darüber hinaus ermöglichte dieser Pool auch die Identifizierung von Protein-Wechselwirkungen und derdamit verbundenen biologischen Funktionen. Es wurde festgestellt, dass die Proteine aus der EV-positiven Probe eine Rolle in immun- und neuroprotektive Bahnen spielten. Die Auswirkungen von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen wurden auf das Neuritenwachstum mit PC 12-Zellen und Ratten-Primärneuronen untersucht.Bei Elektrofahrzeugen wurde ein signifikanter Anstieg des Auswuchses im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Makrophagen-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden auf Gliom-Zell-Invasion untersucht. Es wurde festgestellt, dass Elektrofahrzeuge das Wachstum und die Invasion von Gliomsphäriden beeinträchtigten.Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist, den Überstand des Ultrazentrifugationsschritts wirklich sorgfältig zu verwerfen, um den Verlust von Elektrofahrzeugen in diesem Verfahren zu verhindern. Wir bevorzugen einen groß angelegten und nicht zielgerichteten Ansatz, um uns auf den gesamten Proteingehalt und dann auf die vertikale Wirkung von Elektrofahrzeugen zu konzentrieren. so können Inhalte in Nukleinsäuren mittels Analyse zugeordnet werden.Mit diesem Ansatz aus einer Primärkultur sind wir in der Lage, zwischen EV-Proteinen und freien Proteinen zu unterscheiden, die außerhalb der Vielfalt liegen. Es bleibt also die Frage, ob diese Gerinnung artefaktikuliert ist oder eher

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

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Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Funktionale Bewertung der biologischen Neurotoxine in Networked Cultures für Stammzell abgeleitete Zentralnervensystem Neuronen

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

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Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

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Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

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In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

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Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinale Transplantation von menschlichem embryonalem Stammzellgewebe in einem katzenartigen Großtiermodell

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...