Name: characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment
Uploaded: 2020-06-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment at JoVE.com

제시된 작품은 미니스테르 드 L'Education Nationale, 드 L'Enseignement 수페리어 에 드 라 레체르슈와 INSERM에 의해 지원되었다. 우리는 악기및 기술 자문에 대한 액세스 BICeL- 캠퍼스 과학 도시 시설을 감사하게 인정합니다. 장 파스칼 지메노, 소울라이마네 아불루아르, 이자벨 푸르니에가 질량분광에 도움을 주신 것을 진심으로 감사드립니다. 타니나 아랍, 크리스텔 반 캠프, 프랑수아 르 마레크-크로크, 야코포 비지올리, 피에르 에릭 소티에르가 과학 기술 발전에 크게 기여한 것을 감사드립니다.

1. 마이크로 글리아 / 대식세포의 기본 문화
<ol><li>
마이크로 글리아의 기본 문화
	<ol>
<li>배양 상업용 쥐 1차 마이크로글리아(2 x 106 세포) (재료 표참조) 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 10% 엑소좀 프리 혈청, 페니실린 100 U/mL, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 37°C에서 9.0 g/L 포도당으로 보충됨2</li>
		<li>48시간 배양 후 컨디셔닝된 배지를 수집하고 전기자동?...

중추 신경계 (CNS)는 세포 간 통신이 항상성에 필요한 정상적인 신경 기능을 조절하는 복잡한 조직입니다30. 전기자동차는 현재 세포간 통신을 위한 중요한 분자화물(31)으로널리 연구되고 기술되고 있다. 그(것)들은 특히 건강하고 병리학적인 조건에 있는 그들의 기능에 영향을 미치는 수신자 세포에 중재자의 칵테일을 전달합니다32. 최근 연구...

많은 신경병학은 점점 더 고려되는 복잡한 기계장치인 신경 선동적인 상태와 관련있습니다, 그러나 면역 프로세스가 다양하고 세포 환경에 달려 있기 때문에 아직도 제대로 이해되지 않습니다. 실제로, CNS 무질서는 체계적으로 동일 활성화 신호 및 면역 세포 인구를 관련시키지 않으며 따라서 프로-또는 항염증 반응은 병리학의 원인 또는 결과로 평가하기 어렵습니다. "microglia"라고 불리는 뇌 상주 대식세포는 신경과 면역 계통 사이의 인터페이스에 있는 것처럼 보입니다1. 미세글리아는 골수성 기원을 가지며 원시 조혈 동안 노른자 낭으로부터 유래되어 뇌를 식민지화하는 반면, 말초 대식세포는 말초 대식세포가 되기 위한 확실한 조혈 동안 태아 간에서 유래된다2. 마이크로글리아 세포는 성상세포 및 올리고엔드로시트와 같은 뉴런 및 뉴런 유래 신경교세포와 통신한다3. 최근 몇 차례의 연구는 마이크로글리아가 CNS 발달 및 성인 조직 항상성 동안 신경성 가소성에 관여하고 있으며, 또한 신경퇴행성 질환과 관련된 염증 성 상태에서4,,5. 그렇지 않으면, 혈액 뇌 장벽의 무결성 다른 CNS 병 리에서 손상 될 수 있습니다. 면역 반응, 특히 교모세포종 다형성암에서, 혈관신생 과정과 림프혈관의 존재를 통해 혈액 뇌 장벽이 재구성됨에 따라 미세글리아 세포에 의해서만 지원되지 않는다6,,7. 따라서, 큰 골수 유래 대식세포(BMDMs) 침윤은 종양 의존성 혈관신생 기전 전반에 걸쳐 뇌종양에서 발생한다8. 암세포는 면역억제성질 및 종양성장으로 이어지는 침투된 BMDM에 상당한 영향을 미친다9. 따라서 면역세포와 이들의 뇌 미세환경 간의 통신은 세포 기원 및 활성화 신호가 다양함에 따라 이해하기 어렵다10,,11. 생리적 조건에서 면역 세포 관련 분자 서명의 기능을 체포 하는 이렇게 재미 있다. 이와 관련하여, 면역 세포와 세포 미세환경 사이의 세포-세포 통신은 세포외 소포(EV)의 방출을 통해 연구될 수 있다.
전기자동차는 병리학적 조건뿐만 아니라 건강한 면역기능의 조절에서 점점 더 많이 연구되고 있다12,,13. 엑소좀과 마이크로베시클 2마리를 고려할 수 있습니다. 그(것)들은 다른 생물학 및 크기 범위를 제출합니다. 엑소좀은 ~ 30-150 nm 직경의 소포이며 내분계에서 생성되고 혈장 막과 다기관 (MVBs)의 융합 동안 분비됩니다. 상기 마이크로베식은 직경이 약 100-1,000 nm이고세포혈장막(14)으로부터바깥쪽으로 신진하여 생성된다. 엑소좀 대 마이크로비시클 의 차별은 크기와 분자 패턴에 따라 실현하기 어렵기 때문에 본 보고서에서는 EV라는 용어만 사용할 것입니다. CNS에 있는 EV 관련 커뮤니케이션은 선충, 곤충 또는 annelids15,,16를포함하여 무척추 동물 종에 그들의 관여를 보여주었기 때문에 조상 기계장치를 나타냅니다. 더욱이, 전기자동차가 상이종의 세포와 통신할 수 있다는 것을 보여주는 결과는 소포와 수용자 세포 사이의 표면 분자 인식에 기초한 키-잠금 시스템으로 이 메커니즘을 입증한 다음, 매개체16,,17의섭취를 허용한다. 실제로, EV는 단백질(예를 들어, 효소, 신호 전달, 생물발생 인자), 지질(예를 들어, 세라미드, 콜레스테롤) 또는 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 또는 miRNAs)과 같은 많은 분자를 함유하고 있어 수용자 세포 활동의 직간접적 조절제로서 작용한다14. 이것이 바로 이 유도론적 연구가 또한 면역 세포에서 수행되어 전기자동차를 분리하고 그들의 단백질 시그니처를 완전히 특성화하는18,,19.
초기 연구는 Wnt3a-또는 세로토닌 의존성 활성화20,,21에따른 유도성 메커니즘으로서 1차 배양된 쥐 마이크로글리아로부터 엑소좀의 방출을 입증했다. 기능적으로 CNS에서, 마이크로글리아 유래 EV는 뉴런 의 흥분성의 제어에 기여하는 뉴런에서 시냅스 말단에 의해 시냅스 소포방출을 조절한다 22,,23. Microglia 유래 EV는 또한 큰 두뇌 지구24,,25에서사이토카인 중재한 선동반응을 전파할 수 있었습니다. 중요한 것은, 통행료 유사 수용체 패밀리를 위한 다양한 리간드가 마이크로글리아26에서EV의 특정 생산을 활성화시킬 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 시험관 내 연구는 LPS 활성화 미세글리아 BV2 세포주가 프로-염증성 사이토카인27을포함하는 차동 EV 함량을 생성한다는 것을 보여준다. 따라서, CNS, 마이크로글리아 및 침투 BMDM에서 면역 세포 하위 집단의 기능적 다양성은 수신자 세포에 대한 EV 영향 및 EV 내용물의 식별을 포함하여 자신의 EV 집단을 통해 평가될 수 있다.
우리는 이전에 그들의 격리16,,19후에 microglia-및 BMDM 유래 전기 의 기능적 특성을 평가하는 방법을 기술했습니다. 본 보고서에서, 우리는 신경구 의 자생에 마이크로 글리아 유래 전기 의 효과, 그리고 신경교종 세포 응집체의 제어에 대식세포 파생 전기 의 효과 독립적으로 평가하는 것이 제안한다. 이 연구는 또한 EV 격리 절차를 검증하고 생물학적 활성 단백질 시그니처를 식별하기 위해 EV 분획의 광범위한 단백질 분석을 제안합니다. 유익한 효과 와 EV 내용물의 분자 해독 그들의 가능한 조작 하 고 뇌 질환에 치료 에이전트로 사용 하는 데 도움이 수 있습니다.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12% Mini-PROTEAN&nbsp;TGX Precast Protein Gels</td>
<td>Bio-rad</td>
<td>4561045EDU</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>A955-1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon 50 kDa centrifugal filter</td>
<td>Merck</td>
<td>UFC505024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>9830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>HSP90 &alpha;/&beta; antibody (RRID: AB_675659)</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-13119</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>B27 Plus supplement</td>
<td>Gibco</td>
<td>A3582801</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BenchMixer V2 Vortex Mixer</td>
<td>Benchmark Scientific</td>
<td>BV1003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>5000006</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C18 ZipTips</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>ZTC18S096</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C6 rat glioma cell</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CCL-107</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Canonical tubes</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62.554.002</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5804000010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>CO2 Incubator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Confocal microscope LSM880</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>LSM880</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>Marienfeld</td>
<td>111580</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture Dish (60 mm)</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43819</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Gibco</td>
<td>41966029</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Electron microscope JEM-2100</td>
<td>JEOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>03777-10G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>ED-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Exo-FBS</td>
<td>Ozyme</td>
<td>EXO-FBS-50A-1</td>
<td>Exosome depleted FBS</td>
</tr>
<tr>
<td>ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.exocarta.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Gibco</td>
<td>16140071</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Horse Serum</td>
<td>Biowest</td>
<td>S0960-500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtropur S 0.2</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>83.1826.001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fisherbrand&nbsp;Q500 Sonicator with Probe</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>12893543</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>FlexAnalysis</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence mounting medium</td>
<td>Agilent</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic Acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>695076</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formvar-carbon coated copper grids</td>
<td>Agar scientific Ltd</td>
<td>AGS162-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>340855</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Euromedex</td>
<td>17535-AAT</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Idoacetamide</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
<td>Expedeon</td>
<td>ISB1L</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Invert light microscope CKX53</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>LabTek II 8 wells</td>
<td>&nbsp;Nunc</td>
<td>154534</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laemmli 2X</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610737</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>Corning</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MaxQuant software (proteins identification software)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/maxquant/</td>
</tr>
<tr>
<td>MBT Polish stell</td>
<td>Brucker</td>
<td>8268711</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MEM 10X</td>
<td>Gibco</td>
<td>21090-022</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylcellulose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M6385-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MiliQ water</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Milk</td>
<td>Regilait</td>
<td>REGILAIT300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1658000FC</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MonoP FPLC column</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Nanosight NS300</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>NS300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight NTA software v3.2</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight syringe pump</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nitrocellulose membrane</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>10600007</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>Fluka</td>
<td>56741</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunc multidish 24 wells</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Electro microscopy Science</td>
<td>15713</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PC-12 cell line</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CRL-1721</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide calibration mix</td>
<td>LaserBio Labs</td>
<td>C101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>115-035-003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Perseus software (Processing of identified proteins)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-362065</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>78830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Saline</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190094</td>
<td>no calcium, no magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>pluriStrainer M/ 60 &micro;m</td>
<td>pluriSelect</td>
<td>43-50060</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6407</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>355651</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830-20TAB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PureCol</td>
<td>Cell Systems</td>
<td>5005</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Q-Exactive mass spectrometer</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>rapifleX mass spectrometer</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat cortical neurons</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R882N-20</td>
<td>Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Macrophage &amp; Microglia Culture Medium</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R620K-100</td>
<td>Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary macrophages</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R8818-10a</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary microglia</td>
<td>Lonza</td>
<td>RG535</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sepharose CL-2B</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17014001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>Dustsher</td>
<td>100204</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Scharlau</td>
<td>SO0227</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L3771</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7920-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hydroxide</td>
<td>Scharlab</td>
<td>SO0420005P</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyrophosphate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S6422-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>String software (functional protein association networks)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://string-db.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperSignal West Dura extended Duration Substrate</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>34075</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe 1.0 mL</td>
<td>Terumo</td>
<td>8SS01H1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1703940</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Interchim</td>
<td>UP031657</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-Glycine</td>
<td>Euromedex</td>
<td>EU0550</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2287</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>A95765</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>342184</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Uranyl acetate</td>
<td>Agar Scientific Ltd</td>
<td>AGR1260A</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>WHA10347510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C2020-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment

중추 신경계 (CNS)의 신경 염증 상태는 생리적 및 병리학적 조건에서 중요한 역할을합니다. Microglia, 뇌에 상주 면역 세포, 때로는 침투 골수 파생 대 식 세포 (BMDMs), CNS에서 그들의 미세 환경의 염증 성 프로필을 조절. 면역 세포에서 세포 외 소포 (EV) 인구가 면역 중재자로 작동한다는 것은 지금 받아들여집니다. 따라서, 그들의 수집 및 격리는 그들의 내용을 확인 하지만 또한 받는 사람 세포에 그들의 생물학적 효과 평가 하는 것이 중요 하다. 현재 데이터는 초원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 단계를 포함한 미세글리아 세포 또는 혈액 대식세포로부터의 EV 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. 비표적 프로테오믹 분석은 EV 마커로서 단백질 시그니처의 유효성을 검증하고 생물학적 활성 EV 함량을 특징으로 합니다. Microglia 유래 EV는 또한 신경세포의 1차 배양에 기능적으로 사용되어 뉴라이트 의 면역 매체로서의 중요성을 평가했습니다. 결과는 마이크로글리아 유래 전기 자동차체가 시험관 내에서 신경이염 의 자생을 촉진하는 데 기여하는 것으로 나타났다. 병행하여, 혈액 대식세포 유래 EV는 C6 신경교종 세포의 스페로이드 배양물에서 면역 매개체로서 기능적으로 사용되었고, 이들 EV가 시험관내 신경교종 세포 침범을 제어한다는 것을 보여주는 결과. 이 보고는 EV 매개면역 세포 기능을 평가하는 가능성을 강조하지만 또한 그러한 통신의 분자 기지를 이해합니다. 이 해독은 CNS 병리학의 미세 환경에서 면역 특성을 모방하기 위해 천연 소포 및 / 또는 치료 소포의 시험관 내 준비의 사용을 촉진 할 수 있습니다.

세포외 소포(EV)에 생물학적 효과를 어트리뷰팅하는 주요 과제 중 하나는 전체 배양 배지에서 EV를 분리하는 기능입니다. 이 보고서에서는 EV 마커를 검증하고 생리 활성 화합물을 식별하기 위해 단백질 시그니처의 대규모 분석에 결합된 초원심분리(UC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하는 방법을 제시합니다. 대식세포-또는 마이크로글리아 유래 EV는 각각 24시간 또는 48시간 배양 후 컨디?...

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Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

이 프로토콜은 세포 외 소포의 좋은 격리및 EBDF 단백질의 더 높은 수의 통지를 보장할 수 있게 합니다. 다른 격리 기술에 비해, 이것은 더 무결성 및 수직 활동임을 유지합니다. LC뿐만 아니라 병리학적 조건에서는 전기자동차가 점점 더 많이 연구되고 있습니다.이 방법은 우리가 EV를 특성화하고 연구하기로 선택한 모든 시스템에 적용 할 수 있습니다. 이러한 내용이나 생물학적 윤리에 대해 다음과 같은 실험을 통해 배양과 마찬가지로 EV를 반복할 때 특별한 주의가 필요합니다. 시각적 데모는 수제 크기 배제 크로마토그래피 컬럼과 같은 특정 장비뿐만 아니라 나노 입자 카운터 및 질량 분광계의 참여와 같은 특정 장비를 호스팅하는 데 중요합니다.절차를 입증하는 데 도움이 안토넬라 라포 로메로, 실험실에서 될 것입니다. 조건 배지에서 세포외 소포 또는 EV를 사전 격리하는 것으로 시작합니다. 마이크로글리아 또는 대식세포 배양에서 배양 배지로 조건을 원적 튜브로 옮기고 세포를 펠릿하는 10분 동안 1, 200회 G에서 원심분리기로 옮긴다.상체를 새로운 원문 튜브와 원심분리기로 20분 간 옮겨 사멸체를 제거합니다. 그런 다음 상체를 10.4 밀리리터 폴리 카보네이트 튜브로 옮킨다. 튜브를 70.1 TI 로터와 초원심분리기의 100배, 000배 G에 넣고 4도에서 90분 동안 전기를 발사합니다.원심 분리 후, 상체를 버리고 0.2 마이크로미터여과 PBS의 200 마이크로리터에서 펠릿을 재연한다. 전기자동차를 분리하려면 유리 크로마토그래피 컬럼을 세척 및 살균하고 바닥에 60 마이크로리터 필터를 배치하여 수제 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 교차 연결된 아가로즈 젤 여과 베이스 매트릭스로 컬럼을 적층하여 직경 0.6cm, 높이 20cm의 고정 된 위상을 만듭니다.그런 다음 0.2 마이크로 미터필터링 PBS의 50 밀리리터로 위상을 헹구는 다. 필요한 경우 나중에 사용할 수 있도록 열을 섭씨 4도에 저장합니다. 정지된 EV 펠릿을 고정 된 단계 위에 놓고 고정 된 단계의 상단에 PBS를 계속 추가하면서 250 마이크로 리터의 20 순차 분수를 수집합니다.분수는 영하 20도에서 저장할 수 있습니다. 나노입자 추적 분석을 수행하려면 0.2 마이크로미터가 여과된 PBS로 각 분획을 희석하고 이를 소용돌이하여 골재를 제거합니다. 솔루션을 1밀리리터 주사기에 넣고 자동 주사기 펌프에 넣습니다.그런 다음 카메라 설정을 적절한 화면 게인 수준및 카메라 수준으로 조정하고 실행을 클릭합니다. 15초 동안 1000의 주입 속도로 분석 챔버에 샘플을 로드합니다. 그런 다음 비디오 녹화의 속도 흐름을 15초 동안 25로 줄이고 안정화합니다.파티클 흐름의 3초 연속 60초 동영상을 캡처합니다. 그런 다음 비디오 분석 전에 카메라 수준과 감지 임계값을 조정합니다. 설정을 클릭하여 분석을 시작하고 완료되면 내보내기를 클릭합니다.각 분수 사이에 0.2 마이크로미터의 1 밀리리터로 시스템을 세척합니다. 전자 현미경 분석을 수행하는 경우 50 킬로달톤 원심 필터를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 분획을 집중시하십시오. 단백질 추출의 경우, 50 마이크로리터의 RIPA 버퍼를 EV 샘플과 5분간 얼음 위에 섞는다.500와트, 20킬로헤르츠에서 샘플을 5초 동안 세 번 초음파 처리합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 20, 000배 G에서 원심분리하여 정맥투를 제거합니다. 단백질을 분리한 후 12%의 폴리아크릴 젤의 스태킹 젤에서 단백질 이동을 수행합니다.젤의 단백질을 쿠마시 블루와 20분간 실내 온도에서 섞습니다. 그런 다음 각 컬러 젤 조각을 소비하고 작은 조각으로 자른다. 원고에 설명된 일련의 연속적인 세서스를 통해 젤 조각을 넣습니다.그런 다음 진공 농축기로 완전히 건조하십시오. 건조 후 100 밀리머라 암모늄 중탄산염 100 마이크로리터로 단백질 감소를 수행하며, 섭씨 56도에서 1시간 동안 10밀리머 디티오트레이톨을 함유하고 있습니다. 다음으로 100 밀리알라 암모늄 중탄산염 100 마이크로리터로 단백질 알킬레이션을 수행하여 어둠 속에서 45분 동안 50밀리알라 요오도아세타미드를 함유하고 있습니다.원고 의 지시에 따라 젤 조각을 씻고 진공 농축기에서 완전히 건조하십시오. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 20 밀리머암모늄 중탄산염에서 50 마이크로리터의 트립신으로 단백질 소화를 수행합니다. 다음 날, 젤에서 소화된 단백질을 100%ACN 50마이크로리터로 30분간 30분간, 그리고 15분간 실온에서 연속 교반을 합니다.그런 다음 20 밀리머 암모늄 중탄산염에서 5%TFA의 50 마이크로리터로 단백질을 두 번 추출하고 20 분 동안 지속적으로 저어줍니다. ACN의 마이크로리터 100기를 추가하고 10분 동안 계속 저어줍니다. 그 후, 단백질을 건조하고 0.1 %TFA의 20 마이크로 리터에서 다시 중단.탈염 및 농축 펩티드를 위한 C 18 역상 매체를 사용한 10 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 샘플을 탈염한다. 그런 다음 ACN과 0.1 %의 포믹 산으로 그들을 엘테하십시오. 진공 농축기로 샘플을 완전히 건조시키고 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 또는 LC-MS용 ACN 20 마이크로리터 및 0.1%포름산으로 재보종합니다.소화된 펩티드를 기기에 적재하고 시료 분석을 수행한다. EV 절연을 확인하기 위해 각 SCC 분획은 나노입자 추적 분석을 거쳤습니다. 입자 수는 5, 6, 7번분수에서 상당히 높았다.이러한 분획은 하나의 샘플 2F-EV 양성으로 풀링은 서부 블롯 분석을 사용하여 EV 음수, 1F-EV 음수 및 3F-EV 음수와 비교되었습니다. 결과는 EV 양성 샘플 및 세포 리자테 대조군에서 열 충격 단백질(90)의 존재를 보여주었다. EV 양성 샘플의 전자 현미경 검사는 약 100 나노미터 및 400 나노미터 의 크기 범위에서 전기를 보였다.프로테오믹스 분석은 EV 음성 샘플에서 오염 물질 단백질을 식별하고 EV의 단백질 함량을 특성화하기 위해 수행되었다. 확인된 단백질은 1F-EV 음성 및 2F-EV 양성 샘플 사이뿐만 아니라 2F-EV 양성 및 3F-EV 음수 샘플 사이에서 비교되었습니다. 이 비표적 방법을 사용하여 536개의 단백질 풀을 ExoCarta 데이터베이스에 제출하고 86개의 EV 관련 단백질의 식별으로 이어졌습니다.또한,이 풀은 또한 단백질 상호 작용 및 관련 생물학적 기능의 식별을 허용했다. EV 양성 샘플의 단백질이 면역 및 신경 보호 경로에서 역할을 한다는 것을 발견했습니다. microglia 유래 전기 의 효과 PC와 neurite 성장에 평가 되었다 12 세포와 쥐 기본 뉴런.제어에 비해 전기자동차 하에서 상당한 증가가 관찰되었다. 대식세포 유래 전기는 신경교종 세포 침입에 대해 평가하였다. 그것은 EV가 신경종 스페로이드의 성장과 침략을 손상했다는 것을 것을을 발견되었습니다.기억해야 할 가장 중요한 것은 이 절차에서 EV의 손실을 방지하기 위해 초원심 분리 단계의 상체를 신중하게 폐기하는 것입니다. 우리는 전체 단백질 함량과 EV의 수직 효과에 초점을 맞추기 위해 대규모 및 비 표적 접근 방식을 선호합니다. 따라서 핵산의 내용은 분석을 사용하여 연관될 수 있다.1 차적인 문화에서 이 접근을 통해, 우리는 EV 단백질과 다양성의 외부에 있는 자유로운 단백질 사이에서 구별할 수 있습니다. 그래서 문제는이 응고가 관절 인지 또는 오히려 다른 진짜 남아

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

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스프 레딩 우울증을 사용하여 에피소드와 만성 두통의 신경 면역 신호를 모델링 체외에서</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

연구

신경과학

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 크롤링 동작

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

태아 및 성인 신경 줄기 세포의 고함량 선별 분화 및 성숙 분석- 유래 올리고드로시테 전구체 세포 배양

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...