Name: characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment
Uploaded: 2020-06-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment at JoVE.com

Sunulan çalışma Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche ve INSERM tarafından desteklendi. BiCeL-Campus Scientific City Facility'i enstrümanlara ve teknik tavsiyelere erişim için takdir ediyoruz. Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard ve Isabelle Fournier'i Kitle spektrometresi yardımı için minnetle kabul ediyoruz. Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli ve Pierre-Eric Sautière'i bilimsel ve teknik gelişmelere olan güçlü katkılarından dolayı minnetle kabul ediyoruz.

1. Mikroglia/Makrofajların Birincil Kültürü
<ol><li>
Mikroglia birincil kültür
	<ol>
<li>Kültür ticari sıçan birincil mikroglia (2 x 106 hücreleri) (Malzemeler Tablosubakınız) Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM) ile takviye 10% ekzozozomiçermeyen serum, 100 U/ mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, ve 9.0 g/L glikoz at 37 °C ve% 5 CO2.</li>
		<li>48 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EVs'lerin izolasyonuna devam...

Merkezi sinir sistemi (CNS) hücre-hücre iletişimi homeostaz için gerekli normal nöronal fonksiyonları düzenleyen karmaşık birdokudur 30. EVs şimdi yaygın olarak incelenmiş ve hücre-hücre iletişimi için önemli moleküler kargolar olarak tanımlanan31. Özellikle alıcı hücrelere aracıbir kokteyl teslim ederek sağlıklı ve patolojik koşullarda işlevlerini etkileyen32. Son çalışmalar EVs CNS önemli bir rol oynadığını gös...

Birçok nöropatoloji giderek düşünülen karmaşık bir mekanizma dır nöro-inflamatuar devlet ile ilgilidir, ancak bağışıklık süreçleri çeşitli ve hücre ortamına bağlıdır, çünkü hala kötü anlaşılmaktadır. Gerçekten de, CNS bozuklukları sistematik olarak aynı aktivasyon sinyalleri ve bağışıklık hücre popülasyonları içermez ve bu nedenle pro-veya anti-inflamatuar yanıtları patolojilerin nedenleri veya sonuçları olarak değerlendirmek zordur. "Microglia" adı verilen beyin yerleşik makrofajlar sinir ve bağışıklık sistemleri arasındaki arayüz de gibi görünüyor1. Mikroglia bir miyeloid kökenli ve ilkel hematopoiesis sırasında beyin kolonize yumurta kesesi türetilmiştir, periferik makrofajlar periferik makrofajlar olmak için kesin hematopoezis sırasında fetal karaciğertülen türetilmiştir ise2. Mikroglia hücreleri nöronlar ve astrositler ve oligodendrocytes33 gibi nöron kaynaklı glial hücreleri ile iletişim . Birkaç yeni çalışmalar mikroglia CNS gelişimi ve yetişkin doku homeostaz sırasında nöronal plastisite dahil olduğunu göstermiştir, ve aynı zamanda nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili inflamatuar devlet4,5. Aksi takdirde, kan beyin bariyerinin bütünlüğü diğer CNS patolojilerinde tehlikeye olabilir. Bağışıklık yanıtları, özellikle glioblastoma multiforme kanser, kan beyin bariyeri anjiyojenik süreçler ve lenfatik damarların varlığı ile yeniden düzenlenir gibi mikroglia hücreleri tarafından desteklenmez6,7. Bu nedenle tümöre bağlı anjiyogenez mekanizmaları boyunca beyin tümöründe büyük kemik iliği kaynaklı makrofajlar (MBM) infiltrasyonu meydana gelir8. Kanser hücreleri immünsupresif özellikleri ve tümör büyümesi ne kadar opresif özellikleri ve tümör büyümesi ne kadar infiltrasyon lu KBM'ler üzerinde önemli bir etki uygular9. Böylece bağışıklık hücreleri ve beyin mikroçevre arasındaki iletişim hücre kökeni ve aktivasyon sinyalleri çeşitli olduğu gibi anlamak zordur10,11. Bu nedenle fizyolojik koşullarda bağışıklık hücresi ile ilişkili moleküler imzaların işlevlerini yakalamak ilginçtir. Bu bağlamda, bağışıklık hücreleri ve hücre mikroçevre arasındaki hücre-hücre iletişimi ekstrasellüler serbest bırakılması ile incelenebilir (EVs).
EVs sağlıklı yanı sıra patolojik koşullarda bağışıklık fonksiyonlarının düzenlenmesinde daha fazla çalışılmaktadır12,13. İki popülasyon, ekzozomlar ve mikroveziküller dikkate alınabilir. Farklı biyogenez ve boyut aralıkları sunarlar. Ekzozomlar ~30-150 nm çapında veziküllerdir ve endozomal sistemden üretilir ve plazma zarı ile multiveziküler cisimlerin (MVB) füzyonu sırasında salgılanır. Mikroveziküller çapı yaklaşık 100-1.000 nm ve hücre plazmamembran14bir dış tomurcuklanma tarafından oluşturulur. Ekzozom ve mikrovezilem ayrımcılığının boyutuna ve moleküler kalıplarına göre fark etmesi hala zor olduğundan, bu raporda sadece EVs terimini kullanacağız. Çalışmalar nematodlar, böcekler veya annelidler15,16dahil omurgasız türlerde rol lerini gösterdi beri CNS EV ilişkili iletişim atalarının bir mekanizma temsil eder. Ayrıca, EVs farklı türlerden hücrelerle iletişim kurabilir gösteren sonuçlar, ilk veziküller ve alıcı hücreler arasında yüzey molekülü tanıma dayalı ve daha sonra arabulucuların alımı na izin bir anahtar kilit sistemi olarak bu mekanizma göstermek16,17. Gerçekten de, EVs proteinler (örneğin, enzimler, sinyal transdüksiyonu, biyogenez faktörü), lipidler (örneğin, ceramid, kolesterol) veya nükleik asitler (örneğin, DNA, mRNA veya miRNA veya miRNA veya miRNA) gibi birçok molekül içeren alıcı hücre faaliyetlerinin doğrudan veya dolaylı düzenleyicileri olarak hareket14. Bu nedenle evs izole etmek ve tam olarak protein imzaları karakterize bağışıklık hücreleri üzerinde metodolojik çalışmalar yapıldı18,19.
İlk çalışmalar bir Wnt3a aşağıdaki indükedilemez bir mekanizma olarak birincil kültürlü sıçan mikroglia ekzozomların serbest olduğunu gösterdi- veya serotonine bağlı aktivasyon20,21. Fonksiyonel CNS, mikroglia türetilmiş EVs nöronlarda presinaptik terminalleri tarafından nöronal eksitilat kontrolüne katkıda bulunan sinaptik vezikül salınımını düzenleyen22,23. Mikroglia kaynaklı EVs de büyük beyin bölgelerinde sitokinler aracılı inflamatuar yanıt yaymak olabilir24,25. Daha da önemlisi, toll benzeri reseptör ailesi için çeşitli ligands microglia26EVs belirli üretimleri etkinleştirmek olabilir. Örneğin, in vitro çalışmalar LPS aktive mikroglia BV2 hücre hatları pro-inflamatuar sitokinler27dahil diferansiyel EV içeriği üretmek olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, CNS bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının fonksiyonel çeşitliliği, mikroglia ve bmdm'ler infiltrasyon, alıcı hücreler ve EV içeriğinin belirlenmesi üzerinde EV etkisi de dahil olmak üzere kendi EV popülasyonları ile değerlendirilebilir.
Daha önce mikroglia ve BMDM kaynaklı EVs onların izolasyon16,19sonra fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu raporda, mikroglia kaynaklı EV'lerin nörit büyüme üzerindeki etkisini ve makrofaj kaynaklı EV'lerin glioma hücre agregalarının kontrolü üzerindeki etkisini bağımsız olarak değerlendirmeyi öneriyoruz. Bu çalışma aynı zamanda EV izolasyon prosedürünü doğrulamak ve biyolojik olarak aktif protein imzalarını belirlemek için EV fraksiyonlarının geniş bir proteomik analizini önermektedir. Yararlı etkileri ve EV içeriğinin moleküler deşifre onların olası manipülasyon yardımcı olabilir ve beyin bozukluklarında terapötik ajanlar olarak kullanmak.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12% Mini-PROTEAN&nbsp;TGX Precast Protein Gels</td>
<td>Bio-rad</td>
<td>4561045EDU</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>A955-1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon 50 kDa centrifugal filter</td>
<td>Merck</td>
<td>UFC505024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>9830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>HSP90 &alpha;/&beta; antibody (RRID: AB_675659)</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-13119</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>B27 Plus supplement</td>
<td>Gibco</td>
<td>A3582801</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BenchMixer V2 Vortex Mixer</td>
<td>Benchmark Scientific</td>
<td>BV1003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>5000006</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C18 ZipTips</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>ZTC18S096</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C6 rat glioma cell</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CCL-107</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Canonical tubes</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62.554.002</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5804000010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>CO2 Incubator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Confocal microscope LSM880</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>LSM880</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>Marienfeld</td>
<td>111580</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture Dish (60 mm)</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43819</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Gibco</td>
<td>41966029</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Electron microscope JEM-2100</td>
<td>JEOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>03777-10G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>ED-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Exo-FBS</td>
<td>Ozyme</td>
<td>EXO-FBS-50A-1</td>
<td>Exosome depleted FBS</td>
</tr>
<tr>
<td>ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.exocarta.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Gibco</td>
<td>16140071</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Horse Serum</td>
<td>Biowest</td>
<td>S0960-500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtropur S 0.2</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>83.1826.001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fisherbrand&nbsp;Q500 Sonicator with Probe</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>12893543</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>FlexAnalysis</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence mounting medium</td>
<td>Agilent</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic Acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>695076</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formvar-carbon coated copper grids</td>
<td>Agar scientific Ltd</td>
<td>AGS162-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>340855</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Euromedex</td>
<td>17535-AAT</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Idoacetamide</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
<td>Expedeon</td>
<td>ISB1L</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Invert light microscope CKX53</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>LabTek II 8 wells</td>
<td>&nbsp;Nunc</td>
<td>154534</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laemmli 2X</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610737</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>Corning</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MaxQuant software (proteins identification software)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/maxquant/</td>
</tr>
<tr>
<td>MBT Polish stell</td>
<td>Brucker</td>
<td>8268711</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MEM 10X</td>
<td>Gibco</td>
<td>21090-022</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylcellulose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M6385-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MiliQ water</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Milk</td>
<td>Regilait</td>
<td>REGILAIT300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1658000FC</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MonoP FPLC column</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Nanosight NS300</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>NS300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight NTA software v3.2</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight syringe pump</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nitrocellulose membrane</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>10600007</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>Fluka</td>
<td>56741</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunc multidish 24 wells</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Electro microscopy Science</td>
<td>15713</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PC-12 cell line</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CRL-1721</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide calibration mix</td>
<td>LaserBio Labs</td>
<td>C101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>115-035-003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Perseus software (Processing of identified proteins)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-362065</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>78830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Saline</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190094</td>
<td>no calcium, no magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>pluriStrainer M/ 60 &micro;m</td>
<td>pluriSelect</td>
<td>43-50060</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6407</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>355651</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830-20TAB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PureCol</td>
<td>Cell Systems</td>
<td>5005</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Q-Exactive mass spectrometer</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>rapifleX mass spectrometer</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat cortical neurons</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R882N-20</td>
<td>Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Macrophage &amp; Microglia Culture Medium</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R620K-100</td>
<td>Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary macrophages</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R8818-10a</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary microglia</td>
<td>Lonza</td>
<td>RG535</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sepharose CL-2B</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17014001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>Dustsher</td>
<td>100204</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Scharlau</td>
<td>SO0227</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L3771</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7920-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hydroxide</td>
<td>Scharlab</td>
<td>SO0420005P</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyrophosphate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S6422-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>String software (functional protein association networks)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://string-db.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperSignal West Dura extended Duration Substrate</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>34075</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe 1.0 mL</td>
<td>Terumo</td>
<td>8SS01H1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1703940</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Interchim</td>
<td>UP031657</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-Glycine</td>
<td>Euromedex</td>
<td>EU0550</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2287</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>A95765</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>342184</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Uranyl acetate</td>
<td>Agar Scientific Ltd</td>
<td>AGR1260A</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>WHA10347510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C2020-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment

Merkezi sinir sisteminin nöroinflamatuar durumu (CNS) fizyolojik ve patolojik koşullarda önemli bir rol oynar. Mikroglia, beyinde yerleşik bağışıklık hücreleri, ve bazen sızan kemik iliği kaynaklı makrofajlar (KBM), CNS kendi mikroortamının inflamatuar profilini düzenler. Bağışıklık hücrelerinden gelen hücre dışı vezikül (EV) popülasyonlarının immün arabulucu olarak hareket ettiği kabul edilir. Bu nedenle, bunların toplanması ve izolasyonu, içeriklerini tanımlamak için önemlidir, aynı zamanda alıcı hücreler üzerindeki biyolojik etkilerini de değerlendirirler. Bu veriler, ultrasantrifüj ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) adımları da dahil olmak üzere mikroglia hücrelerinden veya kan makrofajlarından EV izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Hedeflenmemiş bir proteomik analiz, protein imzalarının EV belirteçleri olarak doğrulanmasına izin verdi ve biyolojik olarak aktif EV içeriğini karakterize etti. Mikroglia kaynaklı EVs de işlevsel nöronların birincil kültür de nötrit büyüme bağışıklık mediatörler olarak önemini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, mikroglia kaynaklı EV'lerin in vitro neurite büyümesini kolaylaştırmaya katkıda olduğunu göstermiştir. Buna paralel olarak, kan makrofaj kaynaklı EVs fonksiyonel C6 glioma hücrelerinin spheroid kültürlerde bağışıklık aracı olarak kullanılmıştır, bu eVs in vitro glioma hücre invazyonu kontrol gösteren sonuçlar. Bu rapor, EV aracılı bağışıklık hücresi fonksiyonlarını değerlendirme olasılığını vurgular ken, aynı zamanda böyle bir iletişimin moleküler temellerini de anlamaktadır. Bu deşifre doğal veziküllerin kullanımını teşvik edebilir ve / veya cns patolojilerin mikroortamda bağışıklık özelliklerini taklit etmek için terapötik veziküllerin in vitro hazırlanması.

Biyolojik etkilerin hücre dışı veziküllere (EVs) atflanmasının önündeki en büyük zorluklardan biri, EV'leri tüm kültür ortamından izole edebilme yeteneğidir. Bu raporda, EV belirteçlerini doğrulamak ve biyoaktif bileşikleri tanımlamak için protein imzalarının büyük ölçekli analizine bağlı olarak ultracentrifugation (UC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak bir yöntem salıyoruz. Makrofaj veya mikroglia kaynaklı EV'ler sırasıyla 24 saat veya 48 h kültüründen sonra şart...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment at JoVE.com

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Bu protokol, ekstrasellüler veziküllerin iyi bir şekilde izole edilmesinin ve daha fazla sayıda EBDF proteininin bildirilmesinin mümkün olmasını sağlar. Diğer izolasyon teknikleri ile karşılaştırıldığında, bu daha bütünlük ve dikey faaliyetleri olduğunu korur. EVs lc yanı sıra patolojik koşullarda daha fazla çalışılmaktadır.Bu yöntem, evleri karakterize etmeyi ve incelemeyi seçtiğimiz sistemlere uygulanabilir. Bu içerik veya biyolojik etik için, aşağıdaki deneylerde olduğu gibi, evleri yinelerken özel dikkat gereklidir. Görsel bir gösteri, ev yapımı boyut dışlama kromatografisi sütunu gibi belirli ekipmanların yanı sıra nanopartikül sayacı ve kütle spektrometresinin katılımıiçin önemlidir.Prosedürün gösterilmesine yardımcı olan laboratuvardan Antonella Raffo-Romero olacak. Hücre dışı vezikülleri veya EVs'i durum ortamından önceden izole ederek başlayın. Durumu mikroglia veya makrofaj kültürlerinden konik bir tüpe aktarın ve 1, 200 kez G'de 10 dakika boyunca hücreyi peletlemek için santrifüj edin.Apoptotik organları ortadan kaldırmak için başka bir 20 dakika için yeni bir konik tüp ve santrifüj içine supernatant aktarın. Sonra supernatant bir 10.4 mililitre polikarbonat tüp içine aktarın. Tüpü 70,1 TI rotorve ultra santrifüje 100,000 kez G'de, 4 santigrat derecede 4 derece yeterek yerleştirin.Santrifüjden sonra, supernatant atın ve 0,2 mikrometre filtrelenmiş PBS 200 mikrolitre pelet resuspend. EVs izole etmek için, yıkama ve bir cam kromatografi sütun sterilize ve alt 60 mikrolitre filtre yerleştirerek bir ev yapımı boyutu dışlama kromatografi sütun hazırlamak. Çapı 0,6 santimetre ve yüksekliği 20 santimetre sabit bir faz oluşturmak için çapraz bağlı agarose jel filtrasyon baz matris ile sütun yığını.Daha sonra 0,2 mikro metre filtrelenmiş PBS 50 mililitre ile faz durulayın. Gerekirse, daha sonra kullanmak üzere sütunu dört santigrat derecede saklayın. Sabit fazın üstüne yeniden askıya alınan EV peletini yerleştirin ve sabit fazın üstüne PBS eklemeye devam ederken 250 mikrolitrenin 20 ardışık fraksiyonlarını toplayın.Kesirler eksi 20 derecede saklanabilir. Bir nanopartikül izleme analizi gerçekleştirmek için, 0,2 mikrometre filtrelenmiş PBS ve girdap ile her kesir bir seyreltme yapmak agregaları ortadan kaldırmak için. Bir mililitreşile şırınga çözeltisi koyun ve otomatik şırınga pompası yerleştirin.Ardından, kamera ayarlarını uygun ekran kazanç düzeyine ve kamera seviyesine ayarlayın ve Çalıştır'a tıklayın. Numuneyi analiz odasına 15 saniye boyunca 1000 infüzyon hızıyla yükleyin. Daha sonra, video kaydı için hız akışını 15 saniye boyunca 25'lik bir infüzyon hızına düşürün ve sabitleyin.Parçacık akışının art arda üç 60 saniyelik videosunu yakalayın. Ardından video analizinden önce kamera düzeyini ve algılama eşiğini ayarlayın. Analizi başlatmak için Ayarlar Tamam'a tıklayın ve yapıldığında Dışa Aktar'a tıklayın.Sistemi her fraksiyon arasında 0,2 mikrometre filtrelenmiş PBS mililitre ile yıkayın. Elektron mikroskobu analizi yapıyorsanız, 50 kilodalton santrifüj filtre kullanarak boyut dışlama kromatografisi fraksiyonlarını yoğunlaştırıyor. Protein ekstraksiyonu için, 50 mikrolitre RIPA tamponu ile EV örneğini beş dakika boyunca buz üzerinde karıştırın.Örnekleri 500 Watt ve 20 kilohertz'de beş saniye boyunca üç kez sonicate edin. Daha sonra 20,000 kez G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj ederek vesiküler enkaz çıkarın. Proteinleri izole ettikten sonra, %12 poliakrilik jelin istifleme jelinde protein göçü gerçekleştirin.Jeldeki proteinleri coomassie blue ile oda sıcaklığında 20 dakika karıştırın. Sonra her renkli jel parça çıkarmak ve küçük parçalar halinde kesti. El yazmasında açıklandığı gibi, jel parçalarını bir dizi ardışık yıkıntıya koyun.Sonra tamamen bir vakum konsantratörü ile kuru. Kurutma sonra 56 santigrat derece bir saat boyunca 10 milimolar Dithiothreitol içeren 100 milimolar amonyum bikarbonat 100 mikrolitre ile protein azaltma gerçekleştirin. Daha sonra karanlıkta 45 dakika boyunca 50 milimolar iodoacetamide içeren 100 milimolar amonyum bikarbonat 100 mikrolitre ile protein alkiliyasyonu gerçekleştirin.Jel parçalarını el yazması talimatlara göre yıkayın ve vakum konsantratörü üzerinde tamamen kurulayın. Bir gecede 37 santigrat derecede 20 milimolar amonyum bikarbonat 50 mikrolitre tripsin ile protein sindirimi gerçekleştirin. Ertesi gün, 37 santigrat derece 30 dakika ve daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 100 ACN 50 mikrolitre ile jel sindirilmiş proteinleri ayıklayın sürekli karıştırma ile.Daha sonra 20 milimolar amonyum bikarbonat% 5TFA 50 mikrolitre ile iki kez protein ayıklayın, sürekli karıştırarak 20 dakika. 100 mikrolitre ACN ekleyin ve 10 dakika karıştırmaya devam edin. Daha sonra, proteinlerkuru ve% 0.1 TFA 20 mikrolitre onları resuspend.Desalting ve konsantre peptidler için C 18 ters faz medya ile 10 mikrolitre pipet ucu kullanarak örnek desalt. Sonra ACN ve% 0.1 formik asit ile onları elver. Numuneyi bir vakum konsantratörü ile tamamen kurutun ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi veya LC-MS için 20 mikrolitre ACN ve %0,1 formik asit te resuspend.Sindirilmiş peptidleri alete yükleyin ve bir örnek analizi yapın. EV izolasyonu onaylamak için, her SCC fraksiyonu bir nanopartikül izleme analizine tabi tutuldu. Parçacık sayısı 5, altı ve yedi kesirlerde anlamlı olarak daha yüksekti.Bu kesirler bir örnek 2F-EV pozitif olarak birleştirilmiş ve Batı leke analizi kullanılarak EV negatif fraksiyonları, 1F-EV negatif ve 3F-EV negatif ile karşılaştırıldı. Sonuçlar, EV pozitif örneklemde ve hücre lysat kontrolünde ısı şok proteini 90'ın varlığını gösterdi. EV pozitif numunesinin elektron mikroskobu nda 100 nanometre ve 400 nanometre boyutlarında ev ler saptanmis.EV negatif örneklerinde kirletici proteinleri belirlemek ve EV'lerin protein içeriğini karakterize etmek amacıyla proteomik analiz yapıldı. Tanımlanan proteinler 1F-EV negatif ve 2F-EV pozitif örnekleri ile 2F-EV pozitif ve 3F-EV negatif örnekleri arasında karşılaştırıldı. Bu hedefsiz yöntem kullanılarak, ExoCarta veritabanına 536 proteinden oluşan bir havuz gönderildi ve 86 EV ilişkili proteinin tanımlanmasına yol açtı.Buna ek olarak, bu havuz da protein etkileşimleri ve ilişkili biyolojik fonksiyonların belirlenmesi için izin verdi. EV pozitif örneklemdeki proteinlerin immün ve nöroprotektif yollarda rol oynadığı bulunmuştur. Mikroglia kaynaklı EVs etkileri PC 12 hücreleri ve sıçan primer nöronlar ile neurite outgrowth üzerinde değerlendirildi.EVs altında kontrole göre önemli büyüme artışı gözlendi. Glioma hücre invazyonunda makrofaj türetilmiş EV'ler değerlendirildi. EVs'lerin glioma spheroidlerinin büyümesini ve istilasını bozdığı bulunmuştur.Hatırlanması gereken en önemli şey, bu işlemde EV kaybını önlemek için ultracentrifugation adımının supernatant'ını gerçekten dikkatli bir şekilde atmaktır. Tüm protein içeriğine ve daha sonra EVs'lerin dikey etkisine odaklanmak için büyük ölçekli ve hedefsiz bir yaklaşımdan yanayız. böylece nükleik asitlerdeki içerikler analiz kullanılarak ilişkilendirilebilir.Birincil kültürün bu yaklaşımı ile, EV proteinleri ile çeşitli olmayan serbest proteinler arasında ayrım yapabiliyoruz. Yani soru bu pıhtılaşma sanatsal ya da daha doğrusu başka bir gerçek olup olmadığı kalır

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Yayılma Depresyon Episodik ve Kronik Migren Sinir Bağışıklık Sinyalizasyonu Modelleme In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

Nörobilim

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Kök ve Ağ Kültürlerde Biyolojik nörotoksinlerin Fonksiyonel Değerlendirme Merkezi Sinir Sistemi Nöronlar Hücre-türetilmiş

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Tarama Davranış

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Kök hücre kullanarak gelişmekte olan insan beyni Vitro Zika virüs enfeksiyonu modelleme serebral Organoids türetilmiş

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Ön montajlı plastik mikrofluidik cips içinde ınsan kök hücresi türeyen neurons compartmentalization

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

Fetal ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Türevi Oligodendrosit Öncül Hücre Kültürlerinin Yüksek İçerik tarama farklılaşması ve olgunlaşma analizi

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...