Name: a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies
Uploaded: 2019-08-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies at JoVE.com

We erkennen de hulp van Barbara Schedding bij het voorbereiden van de BM2 en lebein-1. We erkennen Àgnes Noel voor het delen van haar expertise in spheroid-assays. We danken Sonja Schelhaas en Michael Schäfers voor hun hulp bij het hanteren van linvirale transfectie onder S2-condities. We erkennen Sabine von Rüden's assistentie in het bereiden van CAFs van pancreaskanker weefsel.
Het onderzoek dat tot deze resultaten leidt, heeft financiering ontvangen van het people-programma (Marie Curie-acties) van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie KP7/2007-2013/onder de REA subsidieovereenkomst n ◦ (316610) tot en met J.A.E. Bovendien werd J.A.E. en A.C.M.C. financieel gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen de cellen-in-Motion cluster of Excellence (EXC 1003-CiM). Dit project werd ook gesteund door Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).

1.3D-sferoïden als een in vitro model voor fibroblast/CAF-differentiatie met behulp van verschillende TGF-β1 remmende verbindingen van celmatrix interactie
<ol><li>Meng 1 deel van 6 mg/mL methylcellulose-oplossing en 3 delen celkweek media, MEM aangevuld met 1% van het warmtegeïnactiveerde foetale runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine om de spheroid-formatie oplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Resubreng vers ontdooide vereeuwigd normale fibroblasten (iNFs), vereeuwigd CAF (iCAFs) of integrine α3β1 KO i...

<ol>
	<li>Pietil&#228;, M., Ivaska, J., Mani, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whom+to+blame+for+metastasis,+the+epithelial-mesenchymal+transition+or+the+tumor+microenvironment?.">Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?.</a> Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).</li><li>Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy.">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+carcinomas+deposit+laminin-5,+preferably+adhere+to+laminin-5,+and+migrate+on+the+newly+deposited+basement+membrane.">Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane.</a> The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).</li><li>Eble, J. A., Niland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+tumor+progression+and+metastasis.">The extracellular matrix in tumor progression and metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. , (2019).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior.">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).</li><li>Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+Damage+Intended-Cancer-Associated+Fibroblasts+and+Vasculature+Are+Potential+Targets+in+Cancer+Therapy.">Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).</li><li>Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalinin:+an+epithelium-specific+basement+membrane+adhesion+molecule+that+is+a+component+of+anchoring+filaments.">Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).</li><li>Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipera+lebetina+venom+contains+two+disintegrins+inhibiting+laminin-binding+beta1+integrins.">Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).</li><li>Kusuma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+response+to+laminin-511+regulates+breast+tumor+cell+invasion+and+metastasis.">Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis.</a> International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).</li><li>Martins Cavaco, ., C, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Laminin-332+and+&#945;3&#946;1+Integrin+Determines+Differentiation+and+Maintenance+of+CAFs,+and+Supports+Invasion+of+Pancreatic+Duct+Adenocarcinoma+Cells.">The Interaction between Laminin-332 and &#945;3&#946;1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells.</a> Cancers. 11 (1), 14 (2019).</li><li>Ansari, N., M&#252;ller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+cell-based+assay+performed+with+cellular+spheroids+and+fluorescence+microscopy.">Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).</li><li>Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+suppresses+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+dermal+fibroblasts:+an+implication+for+abnormal+wound+healing.">TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).</li><li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-332-Rich+Tumor+Microenvironment+for+Tumor+Invasion+in+the+Interface+Zone+of+Breast+Cancer.">Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+&#946;3+Chains+of+Laminin-332+is+Associated+With+Clinicopathologic+Features+and+Decreased+Survival+in+Patients+With+Pancreatic+Adenocarcinoma.">Overexpression of &#946;3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).</li><li>Huang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+therapeutic+neovascularization+in+a+mouse+model+of+an+ischemic+limb+using+cell+aggregates+composed+of+HUVECs+and+cbMSCs.">Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs.</a> Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;6high+Cell+Population+Functions+as+an+Initiator+in+Tumorigenesis+and+Relapse+of+Human+Liposarcoma.">Integrin &#945;6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).</li><li>Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Drug+Sensitivity+in+Human+Colon+Cancer+Cells+after+Exposure+to+Heat:+Implications+for+Liver+Metastasis+Therapy+using+RFA+and+Chemotherapy.">Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).</li><li>Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+endothelial+cells+on+human+mesenchymal+stem+cell+activity+in+a+three-dimensional+in+vitro+model.">Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model.</a> European Cells &amp; Materials. 22, 242-257 (2011).</li><li>Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+system+using+on-chip+probe+with+wide+range+actuation.">Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation.</a> 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).</li><li>Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).</li><li>Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Nowicki, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+inhibits+invasion+of+glioma+cells;+possible+involvement+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3.</a> Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).</li></ol>

Het ontwikkelen van een geschikt in vitro model om CAF-differentiatie te bestuderen is een uitdagende taak. Na het gebruik van verschillende benaderingen concludeerden we dat een 3D-spheroid-model het praktischer, fysiologisch en klinisch relevant model is, waarin het samenspel tussen pancreas carcinoom cellen met vereeuwigd CAFs kan worden bestudeerd. Dit model voorkwam spontane differentiatie van fibroblasten, als gevolg van artefeitelijke stressoren zoals de stijfheid van de celcultuur kunststof, althans in korte-term...

De tumor micro Environment is een zeer complexe niche en uiterst belangrijk voor het onderhoud en de progressie van de tumorcellen1. Het wordt niet alleen gevormd door de kankercellen, maar ook door stromale fibroblasten. De tumorcellen zijn omgeven door een stroma die specifiek is en verschillend van de stroma van normale weefsels2. Laminine-332 is een extracellulair matrix eiwit ectopisch uitgedrukt in de stroma van verschillende tumoren, zoals pancreas adenocarcinoom3. Bovendien, de biochemische samenstelling van de ECM en ook haar biofysische eigenschappen, zoals stijfheid en spanning, verandering binnen de tumor bulk4. Deze tumor stroma, of "reactieve stroma", wordt veroorzaakt door een aanpassing van fibroblasten aan de naburige kankercellen en door de werving van andere zeer belangrijke spelers die een gunstige en ondersteunende omgeving voor tumorprogressie ontwikkelen. De differentiatie van stromale fibroblasten resulteert in kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF). Deze cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van verschillende markers zoals α-gladde spier actine (αsma)5 of neurale/glial antigeen 2 (ng2)6.
Het meest geschikte in vitro model om de tumor micro Environment (TME) met CAFS te recapituleren is moeilijk te selecteren. De methode voor het nabootsen van fysiologische parameters van de TME op een kostenefficiënte en reproduceerbare manier moet worden overwogen voor een dergelijk modelsysteem. Binnen de TME, verschillende processen, zoals proliferatie, differentiatie, migratie en invasie van de verschillende celtypen optreden. Deze cellulaire processen kunnen individueel worden uitgevoerd met verschillende methoden. Echter, de experimentele omstandigheden moeten rekening houden met de cellulaire interacties met de tumor stroma ECM, aangezien de stijfheid van de substratum invloed op de CAF differentiatieproces. R.G. Wells becommentarieerde de impact van matrix stijfheid op Celgedrag en benadrukte dat cytoskelet organisatie en differentiatie status waargenomen in in vitro gekweekte cellen mogelijk artefeitelijk7. Verschillende stimuli lijken te worden betrokken bij CAF differentiatie, met inbegrip van mechanische spanning5,7. Om dit te voorkomen, kunnen 2D zachte substraten mogelijk benaderingen voor differentiatie studies, als ze het probleem van de stijve cultuur schotel plastic omzeilen. Een zacht 2D-oppervlak, waarop fibroblasten kunnen worden geteeld, kan collageen-I gecoate polyacrylamidegels zijn, waarbij de gelstijfheid kan worden gemanipuleerd door de concentratie van polyacrylamide en de gel cross-linker. De hechting en vorming van αSMA-rijke stress vezels worden versterkt in fibroblasten samen met de gel stijfheid8. Deze resultaten benadrukken het belang van zachte substraat steigers voor meer fysiologische in vitro differentiatie modellen. Echter, in onze handen waren de experimentele reproduceerbaarheid en beeldvorming van deze gels uitdagend. Om deze tekortkomingen te overwinnen, veranderden we het 2D zachte substraat systeem voor een 3D-spheroid-model voor differentiatie en invasie studies. Dit model is meer klinisch relevant en, vergelijkbaar met een in vitro organoïde, aan in vivo celcelinteracties, ECM productie en depositie, evenals Celgedrag9.
Spheroids worden gevormd wanneer cellen een substraat missen om zich aan te houden. Wanneer de cellen worden gelaten zonder een lijm oppervlak, ze aggregeren om een meer of minder sferische structuur te vormen. Als de sferoïden zijn samengesteld uit één type cel, worden ze homo-spheroïden genoemd; Als het bestaat uit twee of meer verschillende celtypen, vormen ze heterospheroids.
Onder de verschillende methoden voor het bereiden van spheroid voeren we het protocol uit met niet-aanhandige ronde bodem 96-well Plates. Het is zeer effectief met betrekking tot de kosten. Hier produceren we zowel homospheroïden van fibroblasten, CAF of CAFs zonder de integrine α3-subeenheid om het differentiatieproces te onderzoeken en heterospheroïden van CAFs of integrine α3 KO CAFs en pancreas cellen van de alvleesklier (AsPC-I en PANC-I) om de invasie te bestuderen in de omringende matrix.
Het doel voor deze studies was het gebruik van primaire CAFs geïsoleerd van menselijke alvleesklier carcinoom biopsies. Echter, de biopsieën om de cellen te verkrijgen zijn schaars en om deze reden, de CAFs gebruikt in deze studies zijn vereeuwigd met behulp van lentivirus met HTERT. Ze heten icafs, en hun normale tegenhangers, primaire menselijke alvleesklier fibroblasten, worden genoemd INFS. De humane alvleesklier fibroblasten en de tumorcellen van de alvleesklier, AsPC-I en PANC-I, zijn in de handel verkrijgbaar.
Dit protocol werd gebruikt om het effect van de interactie laminin-332-integrin in het CAF-differentiatieproces te bestuderen. Om de specificiteit van deze interactie en zijn functie te bewijzen, werden remmer-verbindingen gebruikt: BM2, een monoklonaal antilichaam dat de integrine bindingsplaats de laminin-332 α3 keten10, of lebein 1, een slang Venom afgeleide stof blokkeert die de laminine binding Integrins α3β1, α6β1 en α7β111,12.
Voor de invasie test waren cellen met lentivirus, die cDNA-codering bevatten, ofwel mCherry (iCAFs en integrine α3 KO iCAFs) of GFP (AsPC-I en PANC-I) om de verschillende celtypen in de heterospheroïden te onderscheiden. De transductie van de cellen om ze te vereeuwigen en/of om ze te labelen met een fluorescerende proteïne (mCherry en GFP) expressie wordt beschreven in een eerdere studie13, die moet worden geraadpleegd voor meer informatie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D9542-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6F12 anti-Laminin &#946;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A3IIF5 Anti-&#945;3 integrin subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V - BSA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-laminin &#947;2 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-589-620</td>
			<td>Sprout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM2 anti-laminin &#945;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 1S-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088831001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-I, rat tail</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 and 800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose 4.5 g/L)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSCaliburTM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelifying matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Matrigel, Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG, isotype</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X 0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>12449-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Primary Pancreatic Fibroblasts</td>
			<td>PELOBiotech</td>
			<td>PB-H-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>B6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-332</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 wells, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG, isotype</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi axle rotating mixer</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5 80V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-I</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by Prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG, isotype</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Rotor-Gene Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor Gene SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td>Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#243;rtex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Slide Angiogenesis, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies

Het definiëren van het ideale model voor een in vitro studie is essentieel, vooral als het bestuderen van fysiologische processen zoals differentiatie van cellen. In de tumor stroma, gastheer fibroblasten worden gestimuleerd door kankercellen te differentiëren. Dus, ze verwerven een fenotype dat bijdraagt aan de tumor micro omgeving en ondersteunt de progressie van de tumor. Door gebruik te maken van het spheroid-model hebben we zo'n 3D in vitro modelsysteem opgezet, waarin we de rol van laminin-332 en de receptor integrine α3β1 in dit differentiatieproces analyseerden. Dit spheroid-modelsysteem reproduceert niet alleen de omstandigheden van de tumor microomgeving op een nauwkeurigere manier, maar is ook een zeer veelzijdig model, omdat het verschillende downstreamonderzoeken mogelijk maakt, zoals immunofluorescentie kleuring van zowel intra-als extracellulaire markers, evenals gedeponeerde extracellulaire matrix eiwitten. Bovendien kunnen transcriptionele analyses van qPCR, flow cytometrie en cellulaire invasie met dit model worden bestudeerd. Hier beschrijven we een protocol van een spheroid-model om de rol van CAFs ' integrine α3β1 te beoordelen en zijn ectopisch gestorte ligand, laminin-332, in differentiatie en ter ondersteuning van de invasie van pancreaskanker cellen.

De resultaten van dit experimentele ontwerp worden gepubliceerd in Martins Cavaco et al.13, die wordt aanbevolen voor verdere lezing van de conclusies die werden getrokken uit deze experimenten.
Figuur 1, een representatief beeld van een immunofluorescentie-spheroid, toont de immunokleuring van de integrine α3-subeenheid van beide vereeuwigd normale fibroblasten en vereeuwig...

Watch this Scientific Journal Video about A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies at JoVE.com

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Het kweken van fibroblasten in sferoïde recapituleren tumorweefsel veel beter dan het veelgebruikte 2D-systeem op stijf plastic. Het maakt het mogelijk om fibroblasten differentiatie in een tumor-achtige omgeving te bestuderen. In deze methode heeft de stijfheid van het plastic werk van de celcultuur geen artefactuele invloed op fibroblastdifferentiatie.In plaats daarvan kan de invloed van celmatrix interactie op tumor geïnduceerde differentiatie van fibroblast in vitro worden geanalyseerd. Om deze procedure te beginnen, verkrijg de celkweekmedia, die MEM wordt aangevuld met 1%warmte geïnactiveerde FBS en 1%penicilline streptomycine. Verkrijg ook een oplossing van zes milligram per milliliter methylcellulose.Meng een deel van de methylcellulose met drie delen van de celkweekmedia om de sferoïde vormingsoplossing voor te bereiden. Resuspend vers ontdooid vereeuwigde normale fibroblasten of andere celtypes zoals vermeld in het tekstprotocol in de sferoïde vormingsoplossing. Als cytokinen of integrin-remmers in de studie zijn opgenomen, voeg deze verbindingen toe aan de celsuspensie om ze tijdens hun vorming in de sferoïden te steken.Voeg in voorkomend geval remmerverbindingen toe samen met 10 nanogram per milliliter TGF-bèta om differentiatie in vereeuwigde normale fibroblasten te activeren. Verdeel 100 microliter van de sferoïde formatie oplossing in elke put van een ronde bodem 96 multi-well plaat. Pipette de oplossing in elke put op en neer meerdere malen te mengen.Vervolgens, incubeer de plaat in de cel cultuur incubator op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide voor 24 uur om een sferoïde te vormen in elke put. Snijd eerst het uiteinde van een pipetpunt af om de opening te vergroten. Nadat de incubatie is voltooid, gebruik deze gesneden pipet om de sferoïden te verzamelen in één 1,5 milliliter reactiebuis per experimentele aandoening of per eiwit dat moet worden geanalyseerd.Centrifuge de sferoïden op 1000 keer G voor ongeveer 30 tot 60 seconden. Verwijder voorzichtig de methylcellulose die supernatant bevat door pipetting om ervoor te zorgen dat de pelleted sferoïden niet storen. Speciale zorg moet worden genomen bij het overbrengen van de sferoïden naar de reactiebuizen.Zorg ervoor dat je geen scharen drift krachten door het snijden van de tip. Het is ook belangrijk dat je alle sferoïden verzamelt. Tijdens de wasstap, zorg ervoor dat je niet de sferoïden te verliezen door aspiratie.Om de sferoïden te wassen voeg je 50 microliter van één X PBS toe. Centrifuge op 1000 keer G gedurende 30 tot 60 seconden. Verwijder vervolgens voorzichtig de PBS door pipetten.Afhankelijk van het eiwit te worden gekleurd, bevestig de sferoïden, hetzij met 50 microliters van 4%paraformaldehyde en PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de sferoïden met PBS zoals eerder beschreven. Doordring de cellen met 0,1% triton X en PBS gedurende vier minuten bij kamertemperatuur.Was vervolgens de sferoïden in PBS drie keer zoals eerder beschreven. Voeg PBS met 5%FBS en 2%BSA toe aan de sferoïden en broed een uur lang bij kamertemperatuur om niet-specifieke eiwitinteractieplaatsen te blokkeren. Nu, incubeer de sferoïden met 30 microliter van primaire antilichamen en PBS met 2.5%FBS en 1%BSA bij vier graden Celsius 's nachts.De volgende dag, was de sferoïden in PBS drie keer zoals eerder beschreven. Daarna de sferoïden inbroed met 30 microliter secundaire antilichamen en PBS met 2,5%FBS en 1%BSA bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Was de sferoïden in PBS drie keer zoals eerder beschreven.Vervolgens, incubeer de cellen met 30 microliters van Dappy kleuroplossing gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Was de sferoïden een keer in PBS zoals eerder beschreven. Plaats met behulp van een glazen Pasteur pipet de sferoïden op een glazen glijbaan en een druppel PBS.Gebruik een laser scanning microscoop om de sferoïden beeld door fluorescentie microscopie op een vergroting van 10 keer. Neem verschillende optische dwarsdoorsnede van de sferoïde op verschillende optische vlakten van de Z-stack. Een representatief beeld van de immunofluorescente kleuring van de homo sferoïden van normale pancreasfibroblasten in vergelijking met de homo sferoïden van vereeuwde kanker geassocieerd fibroblasten toont een verhoogd signaal voor de alfa drie subeenheden in de gedifferentieerde cellen.Het fluorescentiesignaal van de cellen in de sferoïde wordt vervolgens gekwantificeerd met de Z-stackbeelden van de 3D-sferoïde en de transcriptieniveaus van het integrin alfa drie subunit-gen worden bepaald door qPCR. Al deze resultaten tonen aan dat integrin alfa drie is upregulated in vereeuwigde kanker geassocieerd fibroblasten in vergelijking met de normale tegenhanger. Dit bewijst dat integrin alpha drie bèta één als een teller voor pancreasfibroblastendifferentiatie kan worden beschouwd.Deze methode is bij uitstek geschikt om zelfweefsel te capituleren in het algemeen gevonden in organen en kankermassa's waar de extra cel matrix stijfheid bepaalt cel lot. Sferoïden cultuur is een veelzijdig model dat kan worden gecombineerd met andere analytische testen na sferoïde dissociatie, zoals kwantiteit real-time PCR en volledige cytometrie. Paraformaldehyde gebruikt voor fixatie van de sferoïden is een gevaarlijk chemisch middel.Handschoenen en oogslijtage moeten worden gedragen voor bescherming.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Een Model voor perineurale invasie in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...