Name: a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies
Uploaded: 2019-08-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies at JoVE.com

Nous reconnaissons l'aide de Barbara Schedding dans la préparation du BM2 et du lebein-1. Nous remercions Àgnes Noel d'avoir partagé son expertise dans les essais sphéroïdes. Nous remercions Sonja Schelhaas et Michael Schàfers pour leur aide dans la gestion de la transfection lentivirale dans des conditions S2. Nous reconnaissons l'insistance de Sabine von Ràden dans la préparation des CAF à partir de tissus cancéreux pancréatiques.
La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Programme des personnes (Actions Marie Curie) du septième programme-cadre de l'Union européenne, le 7e PC/2007-2013/ dans le cadre de l'accord de subvention REA (316610) à J.A.E. De plus, J.A.E. et A.C.M.C. ont reçu le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au sein du Cluster d'excellence Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Ce projet a également été soutenu par Wilhelm Sander Stiftung (subvention: 2016.113.1 à J.A.E.).

1. Les sphéroïdes 3D comme modèle in vitro pour la différenciation fibroblaste/CAF à l'aide de différents composés inhibiteurs du TGF-1
<ol><li>Mélanger 1 partie de la solution de méthylcellulose de 6 mg/mL et 3 parties du support de culture cellulaire, MEM complétée avec 1% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine pour obtenir la solution de formation sphéroïde.</li>
	<li>Resuspendre les fibroblastes normaux immortalisés fraîchement décongelés (iNF), le...

<ol>
	<li>Pietil&#228;, M., Ivaska, J., Mani, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whom+to+blame+for+metastasis,+the+epithelial-mesenchymal+transition+or+the+tumor+microenvironment?.">Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?.</a> Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).</li><li>Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy.">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+carcinomas+deposit+laminin-5,+preferably+adhere+to+laminin-5,+and+migrate+on+the+newly+deposited+basement+membrane.">Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane.</a> The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).</li><li>Eble, J. A., Niland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+tumor+progression+and+metastasis.">The extracellular matrix in tumor progression and metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. , (2019).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior.">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).</li><li>Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+Damage+Intended-Cancer-Associated+Fibroblasts+and+Vasculature+Are+Potential+Targets+in+Cancer+Therapy.">Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).</li><li>Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalinin:+an+epithelium-specific+basement+membrane+adhesion+molecule+that+is+a+component+of+anchoring+filaments.">Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).</li><li>Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipera+lebetina+venom+contains+two+disintegrins+inhibiting+laminin-binding+beta1+integrins.">Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).</li><li>Kusuma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+response+to+laminin-511+regulates+breast+tumor+cell+invasion+and+metastasis.">Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis.</a> International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).</li><li>Martins Cavaco, ., C, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Laminin-332+and+&#945;3&#946;1+Integrin+Determines+Differentiation+and+Maintenance+of+CAFs,+and+Supports+Invasion+of+Pancreatic+Duct+Adenocarcinoma+Cells.">The Interaction between Laminin-332 and &#945;3&#946;1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells.</a> Cancers. 11 (1), 14 (2019).</li><li>Ansari, N., M&#252;ller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+cell-based+assay+performed+with+cellular+spheroids+and+fluorescence+microscopy.">Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).</li><li>Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+suppresses+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+dermal+fibroblasts:+an+implication+for+abnormal+wound+healing.">TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).</li><li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-332-Rich+Tumor+Microenvironment+for+Tumor+Invasion+in+the+Interface+Zone+of+Breast+Cancer.">Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+&#946;3+Chains+of+Laminin-332+is+Associated+With+Clinicopathologic+Features+and+Decreased+Survival+in+Patients+With+Pancreatic+Adenocarcinoma.">Overexpression of &#946;3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).</li><li>Huang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+therapeutic+neovascularization+in+a+mouse+model+of+an+ischemic+limb+using+cell+aggregates+composed+of+HUVECs+and+cbMSCs.">Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs.</a> Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;6high+Cell+Population+Functions+as+an+Initiator+in+Tumorigenesis+and+Relapse+of+Human+Liposarcoma.">Integrin &#945;6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).</li><li>Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Drug+Sensitivity+in+Human+Colon+Cancer+Cells+after+Exposure+to+Heat:+Implications+for+Liver+Metastasis+Therapy+using+RFA+and+Chemotherapy.">Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).</li><li>Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+endothelial+cells+on+human+mesenchymal+stem+cell+activity+in+a+three-dimensional+in+vitro+model.">Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model.</a> European Cells &amp; Materials. 22, 242-257 (2011).</li><li>Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+system+using+on-chip+probe+with+wide+range+actuation.">Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation.</a> 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).</li><li>Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).</li><li>Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Nowicki, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+inhibits+invasion+of+glioma+cells;+possible+involvement+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3.</a> Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).</li></ol>

Développer un modèle in vitro approprié pour étudier la différenciation des FAC est une tâche difficile. Après avoir utilisé différentes approches, nous avons conclu qu'un modèle sphéroïde 3D est le modèle le plus pratique, physiologique et cliniquement pertinent, dans lequel l'interaction entre les cellules du carcinome pancréatique avec des CAF immortalisés peut être étudiée. Ce modèle a empêché la différenciation spontanée des fibroblastes, due aux facteurs de stress artéfactuels tels que la ri...

Le microenvironnement tumoral est une niche très complexe et extrêmement importante pour le maintien et la progression des cellules tumorales1. Il est formé non seulement par les cellules cancéreuses, mais aussi par les fibroblastes stromaux. Les cellules tumorales sont entourées d'un stroma qui est spécifique et différent du stroma des tissus normaux2. Lalaminin-332 est une protéine de matrice extracellulaire ectopiquement exprimée dans le stroma de différentes tumeurs, telles que de l'adénocarcinome pancréatique3. En outre, la composition biochimique de l'ECM et aussi ses propriétés biophysiques, telles que la rigidité et la tension, changent dans le volume de tumeur4. Ce stroma tumoral, ou « stroma réactif », est causé par une adaptation des fibroblastes aux cellules cancéreuses voisines et par le recrutement d'autres acteurs très importants qui développent un environnement favorable et favorable à la progression tumorale. La différenciation des fibroblastes stromaux entraîne des fibroblastes associés au cancer (CAF). Ces cellules peuvent être identifiées à l'aide de différents marqueurs tels que l'actine musculaire lisse (SMA)5 ou l'antigène neural/glial 2 (NG2)6.
Le modèle in vitro le plus approprié pour récapituler le microenvironnement tumoral (TME) avec les CAT est difficile à sélectionner. La méthode pour imiter les paramètres physiologiques du TME d'une manière rentable et reproductible doit être considérée pour un tel système modèle. Dans le TME, différents processus, tels que la prolifération, la différenciation, la migration et l'invasion des différents types de cellules se produisent. Ces processus cellulaires peuvent être effectués individuellement avec différentes méthodes. Cependant, les conditions expérimentales doivent considérer les interactions cellulaires avec l'ECM de stroma de tumeur, puisque la rigidité du substrat influence le processus de différenciation de CAF. R.G. Wells a commenté sur l'impact de la rigidité de matrice sur le comportement cellulaire et a souligné que l'organisation cytosquelettique et le statut de différenciation observés dans les cellules cultivées in vitro pourraient être artéfactuels7. Différents stimuli semblent être impliqués dans la différenciation des FAC, y compris la tension mécanique5,7. Pour éviter cela, les substrats mous 2D pourraient être des approches possibles pour les études de différenciation, car ils contournent le problème du plastique plat de culture rigide. Une surface 2D douce, sur laquelle les fibroblastes peuvent être cultivés, peut être des gels polyacrylamide enduits de collagène-I, par lesquels la rigidité du gel peut être manipulée par la concentration de polyacrylamide et le gel cross-linker. L'adhérence et la formation de fibres de stress riches en SMA sont renforcées dans les fibroblastes avec la rigidité du gel8. Ces résultats soulignent l'importance des échafaudages de substrat souple pour des modèles de différenciation in vitro plus physiologiques. Cependant, dans nos mains la reproductibilité expérimentale et l'imagerie de ces gels étaient provocants. Pour surmonter ces lacunes, nous avons changé le système de substrat souple 2D pour un modèle sphéroïde 3D pour des études de différenciation et d'invasion. Ce modèle est plus pertinent sur le plan clinique et, à l'instar d'un organoïde in vitro, récapitule les interactions cellules-cellules in vivo, la production et le dépôt d'ECM, ainsi que le comportement cellulaire9.
Les sphéroïdes se forment lorsque les cellules n'ont pas de substrat auquel adhérer. Lorsque les cellules sont laissées sans surface adhésive, elles s'agrégent pour former une structure plus ou moins sphérique. Si les sphéroïdes sont composés d'un type de cellule, ils sont appelés homosphéyoïdes; s'ils sont composés de deux ou plusieurs types de cellules différents, ils forment des hétérorosphétoïdes.
Parmi les différentes méthodes de préparation sphéroïde, nous effectuons le protocole en utilisant des plaques rondes non adhérentes en bas de 96 puits. Il est très efficace en ce qui concerne les coûts. Ici, nous produisons à la fois des homosphéroïdes de fibroblastes, caf ou CAFs dépourvus de l'integrin 3 sous-unité pour examiner le processus de différenciation et les hétérorosphénoïdes des CAF ou intégrine 3 CAF ko et cellules de carcinome des canaux pancréatiques (AsPC-I et PANC-I) pour étudier l'invasion dans la matrice environnante.
L'objectif de ces études était d'utiliser des CAF primaires isolés des biopsies du carcinome pancréatique humain. Cependant, les biopsies pour obtenir les cellules sont rares et pour cette raison, les CAF utilisés dans ces études ont été immortalisés à l'aide de lentivirus contenant HTERT. Ils sont appelés iCAFs, et leurs homologues normaux, fibroblastes pancréatiques humains primaires, sont appelés iNFs. Les fibroblastes pancréatiques humains et les cellules du carcinome des canaux pancréatiques, AsPC-I et PANC-I, sont disponibles dans le commerce.
Ce protocole a été employé pour étudier l'effet de l'interaction laminin-332-integrin dans le processus de différenciation de CAF. Pour prouver la spécificité de cette interaction et de sa fonction, des composés inhibiteurs ont été utilisés : BM2, un anticorps monoclonal qui bloque le site de liaison intégrine de la chaîne laminin-332 310, ou lebein 1, un composé dérivé du venin de serpent qui bloque le integrins laminin-contraignants 3,1, 6 et 11,12.
Pour l'analyse d'invasion, les cellules avaient été transduisées avec le lentivirus contenant l'encodage de cDNA codant soit mCherry (iCAFs et integrin s'il n'y a pas 3 KO iCAFs) ou GFP (AsPC-I et PANC-I) pour distinguer les différents types de cellules dans les hétérorosphénoïdes. La transduction des cellules pour les immortaliser et/ou pour les étiqueter avec l'expression de protéine fluorescente (mCherry et GFP) est décrite dans une étude précédente13,qui devrait être consultée pour plus d'informations.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D9542-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6F12 anti-Laminin &#946;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A3IIF5 Anti-&#945;3 integrin subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V - BSA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-laminin &#947;2 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-589-620</td>
			<td>Sprout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM2 anti-laminin &#945;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 1S-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088831001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-I, rat tail</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 and 800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose 4.5 g/L)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSCaliburTM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelifying matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Matrigel, Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG, isotype</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X 0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>12449-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Primary Pancreatic Fibroblasts</td>
			<td>PELOBiotech</td>
			<td>PB-H-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>B6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-332</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 wells, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG, isotype</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi axle rotating mixer</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5 80V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-I</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by Prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG, isotype</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Rotor-Gene Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor Gene SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td>Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#243;rtex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Slide Angiogenesis, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81501</td>
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a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies

Définir le modèle idéal pour une étude in vitro est essentiel, principalement si l'étude des processus physiologiques tels que la différenciation des cellules. Dans le stroma tumoral, les fibroblastes hôtes sont stimulés par les cellules cancéreuses pour se différencier. Ainsi, ils acquièrent un phénotype qui contribue au microenvironnement tumoral et soutient la progression tumorale. En utilisant le modèle sphéroïde, nous avons mis en place un tel système de modèle in vitro 3D, dans lequel nous avons analysé le rôle de la laminin-332 et son récepteur integrin 3-1 dans ce processus de différenciation. Ce système de modèle sphéroïde reproduit non seulement les conditions de microenvironnement de tumeur d'une manière plus précise, mais est également un modèle très polyvalent puisqu'il permet différentes études en aval, telles que la coloration immunofluorescente de l'intra- et de l'extracellulaire marqueurs, ainsi que les protéines de matrice extracellulaire déposées. En outre, les analyses transcriptionnelles par qPCR, la cytométrie de flux et l'invasion cellulaire peuvent être étudiées avec ce modèle. Ici, nous décrivons un protocole d'un modèle sphéroïde pour évaluer le rôle de l'integrin de CAFs '3'1 et son ligand ectopique déposé, laminin-332, dans la différenciation et en soutenant l'invasion des cellules cancéreuses pancréatiques.

Les résultats de cette conception expérimentale sont publiés dans Martins Cavaco et al.13, qui est recommandé pour une lecture plus approfondie des conclusions qui ont été tirées de ces expériences.
Figure 1, image représentative d'un sphéroïde immunofluorescent, montre l'immunostaining de la sous-unité integrin no 3 des fibroblastes normaux immortalisés et des C...

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A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

La culture des fibroblastes dans le tissu tumoral sphéroïde récapitule beaucoup mieux que le système 2D couramment utilisé sur le plastique rigide. Il permet d’étudier la différenciation des fibroblastes dans un environnement tumoral. Dans cette méthode, la rigidité du travail plastique de culture cellulaire n’influence pas artifactually la différenciation de fibroblaste.Au lieu de cela, l’influence de l’interaction de matrice cellulaire sur la différenciation induite par tumeur du fibroblaste peut être analysée in vitro. Pour commencer cette procédure, obtenir le média de culture cellulaire, qui est MEM complété par 1% de chaleur inactivée FBS et 1% streptomycine pénicilline. En outre, obtenir une solution de méthylcellulose de six milligrammes par millilitre.Mélanger une partie de la méthylcellulose avec trois parties du média de culture cellulaire pour préparer la solution de formation sphéroïde. Resuspendez les fibroblastes normaux immortalisés fraîchement décongelés ou d’autres types de cellules énumérés dans le protocole de texte dans la solution de formation sphéroïde. Si des cytokines ou des inhibiteurs de l’intégrine sont inclus dans l’étude, ajoutez ces composés à la suspension cellulaire afin de les insérer dans les sphéroïdes pendant leur formation.Le cas échéant, ajouter des composés inhibiteurs ainsi que 10 nanogrammes par millilitre de bêta TGF un pour déclencher la différenciation dans les fibroblastes normaux immortalisés. Répartir 100 microlitres de la solution de formation sphéroïde dans chaque puits d’une plaque ronde de 96 puits multiples. Pipette la solution dans chaque puits de haut en bas à plusieurs reprises pour mélanger.Ensuite, incuber la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour permettre à un sphéroïde de se former dans chaque puits. Tout d’abord, couper l’extrémité d’une pointe pipette pour agrandir l’orifice. Une fois l’incubation terminée, utilisez cette pipette coupée pour recueillir les sphéroïdes dans un tube de réaction de 1,5 millilitre par condition expérimentale ou par protéine à analyser.Centrifugeuse les sphéroïdes à 1000 fois G pendant environ 30 à 60 secondes. Retirez soigneusement la méthylcellulose contenant du supernatant en pipetage en vous assurant de ne pas déranger les sphéroïdes granulés. Un soin particulier doit être pris lors du transfert des sphéroïdes vers les tubes de réaction.Assurez-vous que vous n’avez pas de forces de dérive de cailles en coupant la pointe. Il est également important que vous collectiez tous les sphéroïdes. Pendant l’étape de lavage, assurez-vous de ne pas perdre les sphéroïdes par aspiration.Pour laver les sphéroïdes ajouter 50 microlitres d’un X PBS. Centrifugeuse à 1000 fois G pendant 30 à 60 secondes. Retirez ensuite soigneusement le PBS par pipetting.Selon la protéine à tachée, fixer les sphéroïdes soit avec 50 microlitres de 4%paraformaldéhyde et PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez les sphéroïdes avec PBS comme décrit précédemment. Perméabilizez les cellules avec 0,1% triton X et PBS pendant quatre minutes à température ambiante.Ensuite, lavez les sphéroïdes dans PBS trois fois comme décrit précédemment. Ajoutez du PBS contenant 5 % de FBS et 2 % de BSA aux sphéroïdes et incubez à température ambiante pendant une heure pour bloquer les sites d’interaction protéique non spécifiques. Maintenant, incuber les sphéroïdes avec 30 microlitres d’anticorps primaires et PBS avec 2,5%FBS et 1%BSA à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, lavez les sphéroïdes dans PBS trois fois comme décrit précédemment. Après cela, incuber les sphéroïdes avec 30 microlitres d’anticorps secondaires et PBS avec 2,5%FBS et 1%BSA à température ambiante pendant 90 minutes. Lavez les sphéroïdes dans PBS trois fois comme décrit précédemment.Ensuite, incubez les cellules avec 30 microlitres de solution de coloration Dappy pendant quatre minutes à température ambiante. Lavez les sphéroïdes dans PBS une fois comme décrit précédemment. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, déposer les sphéroïdes sur une glissière en verre et une goutte de PBS.Utilisez un microscope à balayage laser pour imager les sphéroïdes par microscopie par fluorescence à un grossissement de 10 fois. Prenez différentes sections optiques transversales du sphéroïde à différentes plaines optiques de la pile Z. Une image représentative de la coloration immunofluorescente des sphéroïdes homo des fibroblastes pancréatiques normaux comparés aux sphéroïdes homo des fibroblastes associés au cancer immortalisé montre un signal accru pour l’alpha trois sous-unité dans les cellules différenciées.Le signal de fluorescence des cellules dans le sphéroïde sont ensuite quantifiés avec les images de pile Z du sphéroïde 3D et les niveaux transcriptionnels du gène intégrateur alpha trois sous-unité sont déterminés par qPCR. Tous ces résultats démontrent que l’intégrine alpha trois est upregulated dans les fibroblastes associés au cancer immortalisé par rapport à la contrepartie normale. Cela prouve que l’intégrine alpha trois bêta on peut être considéré comme un marqueur pour la différenciation des fibroblastes pancréatiques.Cette méthode est idéale pour capituler les tissus auto généralement trouvés dans les organes et les masses cancéreuses où la rigidité de la matrice cellulaire supplémentaire détermine le sort cellulaire. La culture sphéroïdes est un modèle polyvalent qui peut être combiné avec d’autres analyses après la dissociation sphéroïde comme la quantité en temps réel PCR et la cytométrie complète. Le paraformaldéhyde utilisé pour la fixation des sphéroïdes est un agent chimique dangereux.Les gants et les lunettes doivent être portés pour se protéger.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Un modèle pour périneural Invasion en tête et du cou Carcinome épidermoïde

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Vérifier dans un modèle de Culture cellulaire 3D basé sur l’ellipsoïde tête et cou, carcinome épidermoïde de la thérapie

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identification, Caractérisation histologique et Dissection des Lobes de la Prostate souris pour modèles In Vitro sphéroïde 3D Culture

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un nouveau modèle 3D de Sphéroïde de tumeur de Stromal-Modulé pour étudier l’interaction de tumeur-Stroma et la découverte de drogue

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...