Name: a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies
Uploaded: 2019-08-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies at JoVE.com

Wir würdigen Barbara Scheddings Hilfe bei der Vorbereitung des BM2 und lebein-1. Wir würdigen, dass er ihre Expertise in Sphäroid-Assays geteilt hat. Wir danken Sonja Schelhaas und Michael Schäfers für ihre Hilfe beim Umgang mit lentiviraler Transfektion unter S2-Bedingungen. Wir würdigen Sabine von Rüdens Unterstützung bei der Vorbereitung von CAFs aus Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe.
Die Zu diesem Ergebnis führten Forschungsarbeiten wurden aus dem People-Programm (Marie-Curie-Maßnahmen) des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union RP7/2007-2013/ im Rahmen der REA-Zuschussvereinbarung n. (316610) an J.A.E. finanziert. Darüber hinaus wurden J.A.E. und A.C.M.C. von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Exzellenzclusters Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM) finanziell unterstützt. Dieses Projekt wurde auch von der Wilhelm Sander Stiftung unterstützt (Zuschuss: 2016.113.1 an J.A.E.).

1. 3D-Sphäroide als In-vitro-Modell zur Fibroblasten-/CAF-Differenzierung unter Verwendung verschiedener TGF-1-Hemmverbindungen der Zell-Matrix-Wechselwirkung
<ol><li>Mischen Sie 1 Teil von 6 mg/ml Methylcelluloselösung und 3 Teile der Zellkulturmedien, MEM ergänzt mit 1% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin, um die Sphäroidbildungslösung zu erhalten.</li>
	<li>Resuspend frisch aufgetaut verewigte normale Fibroblasten (iNFs), verewigte CAF (iCAFs) oder Integrin 3-1 KO iCAF (D...

<ol>
	<li>Pietil&#228;, M., Ivaska, J., Mani, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whom+to+blame+for+metastasis,+the+epithelial-mesenchymal+transition+or+the+tumor+microenvironment?.">Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?.</a> Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).</li><li>Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy.">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+carcinomas+deposit+laminin-5,+preferably+adhere+to+laminin-5,+and+migrate+on+the+newly+deposited+basement+membrane.">Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane.</a> The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).</li><li>Eble, J. A., Niland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+tumor+progression+and+metastasis.">The extracellular matrix in tumor progression and metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. , (2019).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior.">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).</li><li>Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+Damage+Intended-Cancer-Associated+Fibroblasts+and+Vasculature+Are+Potential+Targets+in+Cancer+Therapy.">Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).</li><li>Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalinin:+an+epithelium-specific+basement+membrane+adhesion+molecule+that+is+a+component+of+anchoring+filaments.">Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).</li><li>Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipera+lebetina+venom+contains+two+disintegrins+inhibiting+laminin-binding+beta1+integrins.">Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).</li><li>Kusuma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+response+to+laminin-511+regulates+breast+tumor+cell+invasion+and+metastasis.">Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis.</a> International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).</li><li>Martins Cavaco, ., C, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Laminin-332+and+&#945;3&#946;1+Integrin+Determines+Differentiation+and+Maintenance+of+CAFs,+and+Supports+Invasion+of+Pancreatic+Duct+Adenocarcinoma+Cells.">The Interaction between Laminin-332 and &#945;3&#946;1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells.</a> Cancers. 11 (1), 14 (2019).</li><li>Ansari, N., M&#252;ller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+cell-based+assay+performed+with+cellular+spheroids+and+fluorescence+microscopy.">Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).</li><li>Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+suppresses+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+dermal+fibroblasts:+an+implication+for+abnormal+wound+healing.">TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).</li><li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-332-Rich+Tumor+Microenvironment+for+Tumor+Invasion+in+the+Interface+Zone+of+Breast+Cancer.">Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+&#946;3+Chains+of+Laminin-332+is+Associated+With+Clinicopathologic+Features+and+Decreased+Survival+in+Patients+With+Pancreatic+Adenocarcinoma.">Overexpression of &#946;3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).</li><li>Huang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+therapeutic+neovascularization+in+a+mouse+model+of+an+ischemic+limb+using+cell+aggregates+composed+of+HUVECs+and+cbMSCs.">Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs.</a> Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;6high+Cell+Population+Functions+as+an+Initiator+in+Tumorigenesis+and+Relapse+of+Human+Liposarcoma.">Integrin &#945;6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).</li><li>Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Drug+Sensitivity+in+Human+Colon+Cancer+Cells+after+Exposure+to+Heat:+Implications+for+Liver+Metastasis+Therapy+using+RFA+and+Chemotherapy.">Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).</li><li>Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+endothelial+cells+on+human+mesenchymal+stem+cell+activity+in+a+three-dimensional+in+vitro+model.">Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model.</a> European Cells &amp; Materials. 22, 242-257 (2011).</li><li>Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+system+using+on-chip+probe+with+wide+range+actuation.">Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation.</a> 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).</li><li>Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).</li><li>Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Nowicki, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+inhibits+invasion+of+glioma+cells;+possible+involvement+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3.</a> Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).</li></ol>

Die Entwicklung eines geeigneten In-vitro-Modells zur Untersuchung der CAF-Differenzierung ist eine schwierige Aufgabe. Nach der Anwendung verschiedener Ansätze kamen wir zu dem Schluss, dass ein 3D-Sphäroidmodell das praktischere, physiologischere und klinisch relevantere Modell ist, bei dem das Zusammenspiel von Pankreaskarzinomzellen mit verewigten CAFs untersucht werden kann. Dieses Modell verhinderte eine spontane Differenzierung von Fibroblasten aufgrund artefakter Stressoren wie Steifigkeit des Zellkulturkunstst...

Die Tumormikroumgebung ist eine sehr komplexe Nische und extrem wichtig für die Erhaltung und Progression der Tumorzellen1. Es wird nicht nur von den Krebszellen, sondern auch von stromalen Fibroblasten gebildet. Die Tumorzellen sind von einem Stroma umgeben, der spezifisch ist und sich von den Stroma normaler Gewebe2unterscheidet. Laminin-332 ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das ektopisch im Stroma verschiedener Tumoren, wie z.B. des Pankreas-Adenokarzinoms3, exprimiert wird. Darüber hinaus verändern sich die biochemische Zusammensetzung des ECM und seine biophysikalischen Eigenschaften, wie Steifigkeit und Spannung, innerhalb der Tumormasse4. Dieser Tumor stroma, oder "reaktive se", wird durch eine Anpassung von Fibroblasten an die benachbarten Krebszellen und durch die Rekrutierung anderer sehr wichtiger Akteure verursacht, die ein günstiges und unterstützendes Umfeld für die Tumorprogression entwickeln. Die Differenzierung von stromalen Fibroblasten führt zu krebsassoziierten Fibroblasten (CAF). Diese Zellen können mit verschiedenen Markern identifiziert werden, wie z.B. mit dem glatten Muskelaktin (SMA)5 oder dem neuronalen/glialen Antigen 2 (NG2)6.
Das am besten geeignete In-vitro-Modell, um die Tumormikroumgebung (TME) mit CAFs zu rekapitulieren, ist schwer zu wählen. Die Methode, physiologische Parameter der TME kosteneffizient und reproduzierbar nachzuahmen, muss für ein solches Modellsystem in Betracht gezogen werden. Innerhalb der TME treten verschiedene Prozesse wie Proliferation, Differenzierung, Migration und Invasion der verschiedenen Zelltypen auf. Diese zellulären Prozesse können individuell mit unterschiedlichen Methoden durchgeführt werden. Die experimentellen Bedingungen müssen jedoch die zellulären Wechselwirkungen mit dem Tumor stroma ECM berücksichtigen, da die Steifigkeit des Substrats den CAF-Differenzierungsprozess beeinflusst. R.G. Wells kommentierte die Auswirkungen der Matrixsteifigkeit auf das Zellverhalten und betonte, dass die zytoskelettale Organisation und der Differenzierungsstatus, die in in vitro kultivierten Zellen beobachtet wurden, artefactual sein könnten7. Verschiedene Reize scheinen an der CAF-Differenzierung beteiligt zu sein, einschließlich mechanischer Spannung5,7. Um dies zu vermeiden, könnten 2D-weiche Substrate mögliche Ansätze für Differenzierungsstudien sein, da sie das Problem der steifen Kulturschale Kunststoff umgehen. Eine weiche 2D-Oberfläche, auf der Fibroblasten angebaut werden können, können kollagen-I-beschichtete Polyacrylamidgele sein, wobei die Gelsteifigkeit durch die Konzentration von Polyacrylamid und dem Gel-Verlinker manipuliert werden kann. Die Haftung und Bildung von SMA-reichen Spannungsfasern wird in Fibroblasten zusammen mit der Gelsteifigkeit8verstärkt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung weicher Substratgerüste für physiologischere In-vitro-Differenzierungsmodelle. In unseren Händen waren jedoch die experimentelle Reproduzierbarkeit und Bildgebung dieser Gele eine Herausforderung. Um diese Mängel zu überwinden, haben wir das 2D-Softsubstratsystem für ein 3D-Sphäroidmodell für Differenzierungs- und Invasionsstudien geändert. Dieses Modell ist klinisch relevanter und rekapituliert, ähnlich wie ein In-vitro-Organoid, in vivo Zell-Zell-Wechselwirkungen, ECM-Produktion und -Deposition sowie Zellverhalten9.
Sphäroide entstehen, wenn zellenein Substrat fehlt, an dem sie haften können. Wenn die Zellen ohne Klebefläche verlassen werden, aggregieren sie sich zu einer mehr oder weniger kugelförmigen Struktur. Wenn die Sphäroide aus einem Zelltyp bestehen, werden sie Homosphäroide genannt; wenn sie aus zwei oder mehr verschiedenen Zelltypen bestehen, bilden sie Heterosphäride.
Unter den verschiedenen Methoden für die Sphäroid-Vorbereitung führen wir das Protokoll mit nicht haftenden runden 96-Well-Platten durch. Es ist sehr effektiv in Bezug auf die Kosten. Hier produzieren wir sowohl Homosphäoide von Fibroblasten, CAF oder CAFs ohne die Untereinheit integrin 3, um den Differenzierungsprozess und die Heterosphäroide von CAFs oder Integrin-KO-CAFs und Pankreaskanalkarzinomzellen (AsPC-I und PANC-I) zu untersuchen, um die Invasion zu untersuchen. in die umgebende Matrix.
Ziel dieser Studien war die Verwendung primärer CAFs, die aus biopsien humanen Pankreaskarzinomen isoliert wurden. Die Biopsien zur Gewinnung der Zellen sind jedoch knapp, und aus diesem Grund wurden die in diesen Studien verwendeten CAFs mit dem Lentivirus, das HTERT enthält, verewigt. Sie werden iCAFs genannt, und ihre normalen Gegenstücke, primäre menschliche Pankreas-Fibroblasten, werden als iNFs bezeichnet. Die menschlichen Pankreas-Fibroblasten und die Pankreaskanal-Karzinomzellen AsPC-I und PANC-I sind im Handel erhältlich.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Laminin-332-Integrin-Wechselwirkung im CAF-Differenzierungsprozess zu untersuchen. Um die Spezifität dieser Wechselwirkung und ihrer Funktion zu beweisen, wurden Inhibitorverbindungen verwendet: BM2, ein monoklonaler Antikörper, der die Integrin-Bindungsstelle die Laminin-332-Kette10oder Lebein 1 blockiert, eine von Schlangengift abgeleitete Verbindung, die die Laminin-Bindungs-Integrine , 3, 1, 11,12, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
Für den Invasionstest wurden Zellen mit Lentivirus transduziert, die cDNA-Codierung entweder mCherry (iCAFs und Integrin 3 KO iCAFs) oder GFP (AsPC-I und PANC-I) enthielten, um die verschiedenen Zelltypen in den Heterosphäroiden zu unterscheiden. Die Transduktion der Zellen, um sie zu verewigen und/oder sie mit fluoreszierender Proteinexpression (mCherry und GFP) zu kennzeichnen, wird in einer früheren Studie13beschrieben, die für weitere Informationen konsultiert werden sollte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D9542-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6F12 anti-Laminin &#946;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A3IIF5 Anti-&#945;3 integrin subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V - BSA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-laminin &#947;2 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-589-620</td>
			<td>Sprout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM2 anti-laminin &#945;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 1S-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088831001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-I, rat tail</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 and 800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose 4.5 g/L)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSCaliburTM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelifying matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Matrigel, Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG, isotype</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X 0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>12449-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Primary Pancreatic Fibroblasts</td>
			<td>PELOBiotech</td>
			<td>PB-H-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>B6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-332</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 wells, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG, isotype</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi axle rotating mixer</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5 80V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-I</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by Prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG, isotype</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Rotor-Gene Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor Gene SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td>Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#243;rtex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
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a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies

Die Definition des idealen Modells für eine In-vitro-Studie ist vor allem bei der Untersuchung physiologischer Prozesse wie der Zelldifferenzierung von entscheidender Bedeutung. Im Tumor stroma werden Wirtsfibroblasten von Krebszellen zur Differenzierung angeregt. So erwerben sie einen Phänotyp, der zur Tumormikroumgebung beiträgt und die Tumorprogression unterstützt. Mit Hilfe des Sphäroidmodells haben wir ein solches 3D-In-vitro-Modellsystem eingerichtet, in dem wir die Rolle von Laminin-332 und dessen Rezeptorintegrin 3-1 in diesem Differenzierungsprozess analysiert haben. Dieses Sphäroid-Modellsystem reproduziert nicht nur die Tumor-Mikroumgebungsbedingungen genauer, sondern ist auch ein sehr vielseitiges Modell, da es verschiedene nachgelagerte Studien ermöglicht, wie z. B. immunfluoreszierende Färbung ender intra- und extrazellulärer Marker sowie abgelagerte extrazelluläre Matrixproteine. Darüber hinaus können Transkriptionsanalysen durch qPCR, Durchflusszytometrie und zelluläre Invasion mit diesem Modell untersucht werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll eines Sphäroidmodells zur Bewertung der Rolle des INtegrins von CAFs und seines ektopisch abgelagerten Ligands Laminin-332 bei der Differenzierung und bei der Unterstützung der Invasion von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen.

Die Ergebnisse dieses experimentellen Entwurfs werden in Martins Cavaco et al.13veröffentlicht, was für die weitere Lektüre der Schlussfolgerungen, die aus diesen Experimenten gezogen wurden, empfohlen wird.
Abbildung 1, ein repräsentatives Bild eines immunfluoreszierenden Sphäroids, zeigt die Immunfärbung der Integrin-Untereinheit 3 von sowohl verewigten normalen Fibro...

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A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Kultivierende Fibroblasten in Sphäroid rekapitulieren Tumorgewebe viel besser als das häufig verwendete 2D-System auf steifem Kunststoff. Es ermöglicht, Fibroblasten Differenzierung in einer tumorähnlichen Umgebung zu studieren. Bei dieser Methode beeinflusst die Steifigkeit der Zellkultur plastische Arbeit nicht künstlich die Fibroblastendifferenzierung.Stattdessen kann der Einfluss der Zellmatrix-Interaktion auf die tumorinduzierte Differenzierung von Fibroblasten in vitro analysiert werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie die Zellkultur-Medien, die MEM mit 1%Wärme inaktiviert FBS und 1%Penicillin Streptomycin ergänzt ist. Erhalten Sie auch eine Methylcelluloselösung mit sechs Milligramm pro Milliliter.Mischen Sie einen Teil der Methylcellulose mit drei Teilen der Zellkulturmedien, um die Sphäroid-Bildungslösung vorzubereiten. Heben Sie frisch aufgetaute verewigte normale Fibroblasten oder andere Zelltypen wieder auf, wie im Textprotokoll in der Sphäroidbildungslösung aufgeführt. Wenn Zytokine oder Integrin-Inhibitoren in der Studie enthalten sind, fügen Sie diese Verbindungen der Zellsuspension hinzu, um sie während ihrer Bildung in die Sphäroide einzubetten.Gegebenenfalls fügen Sie Inhibitorverbindungen zusammen mit 10 Nanogramm pro Milliliter TGF beta one hinzu, um eine Differenzierung in verewigten normalen Fibroblasten auszulösen. Verteilen Sie 100 Mikroliter der Sphäroid-Formationslösung in jeden Brunnen einer runden 96-Multi-Well-Platte. Pipette die Lösung in jedem gut nach oben und unten mehrmals zu mischen.Dann inkubieren Sie die Platte im Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden, damit ein Sphäroid in jedem Brunnen gebildet werden kann. Schneiden Sie zunächst das Ende einer Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu vergrößern. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie diese geschnittene Pipette, um die Sphäroide in einem 1,5 Milliliter Reaktionsrohr pro Versuchszustand oder pro zu analysierendem Protein zu sammeln.Zentrifugieren Sie die Sphäroide bei 1000 mal G für etwa 30 bis 60 Sekunden. Entfernen Sie vorsichtig die Methylcellulose enthaltenden Überstand durch Pipetten, um sicherzustellen, dass die pelletierten Sphäroide nicht stören. Besondere Vorsicht ist bei der Übertragung der Sphäroide auf die Reaktionsröhrchen zu beachten.Stellen Sie sicher, dass Sie keine Scherendriftkräfte haben, indem Sie die Spitze schneiden. Es ist auch wichtig, dass Sie alle Sphäroide sammeln. Stellen Sie während des Waschschritts sicher, dass Sie die Sphäroide nicht durch Aspiration verlieren.Zum Waschen der Sphäroide fügen Sie 50 Mikroliter eines X PBS hinzu. Zentrifuge bei 1000 mal G für 30 bis 60 Sekunden. Entfernen Sie dann vorsichtig die PBS durch Pipettieren.Je nach zu färbendem Protein die Sphäroide entweder mit 50 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd und PBS 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Waschen Sie die Sphäroide mit PBS, wie zuvor beschrieben. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1%Triton X und PBS für vier Minuten bei Raumtemperatur.Waschen Sie dann die Sphäroide in PBS dreimal wie zuvor beschrieben. Fügen Sie PBS mit 5%FBS und 2%BSA zu den Sphäroiden hinzu und brüten sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um unspezifische Proteininteraktionsstellen zu blockieren. Jetzt inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 Mikroliter primärer Antikörper und PBS mit 2,5% FBS und 1%BSA bei vier Grad Celsius über Nacht.Waschen Sie am nächsten Tag die Sphäroide in PBS dreimal wie zuvor beschrieben. Danach die Sphäroide mit 30 Mikrolitern Sekundärantikörpern und PBS mit 2,5%FBS und 1%BSA bei Raumtemperatur 90 Minuten inkubieren. Waschen Sie die Sphäroide in PBS dreimal wie zuvor beschrieben.Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit 30 Mikroliter dappy Färbung Lösung für vier Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Sphäroide in PBS einmal wie zuvor beschrieben. Mit einer glasigen Pasteurpipette legen Sie die Sphäroide auf eine Glasrutsche und einen Tropfen PBS.Verwenden Sie ein Laser-Scanning-Mikroskop, um die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie bei einer Vergrößerung von 10 Mal abzubilden. Nehmen Sie verschiedene optische Querschnitt des Sphäroids in verschiedenen optischen Ebenen des Z-Stacks. Ein repräsentatives Bild der immunfluoreszenten Färbung der Homo-Sphäroide normaler Pankreas-Fibroblasten im Vergleich zu den Homo-Sphäroiden von unsterblichen Krebsassoziierten Fibroblasten zeigt ein erhöhtes Signal für die Alpha-Drei-Untereinheit in den differenzierten Zellen.Das Fluoreszenzsignal der Zellen im Sphäroid wird dann mit den Z-Stack-Bildern des 3D-Sphäroids quantifiziert und die Transkriptionsniveaus des Integrin-Alpha-Drei-Untereinheitsgens werden durch qPCR bestimmt. Alle diese Ergebnisse zeigen, dass integrin alpha 3 in verewigten Krebs assoziierten Fibroblasten im Vergleich zum normalen Pendant hochreguliert ist. Dies beweist, dass integrin alpha drei Beta ein kann als Marker für Pankreas-Fibroblasten Differenzierung betrachtet werden.Diese Methode ist ideal geeignet, um Selbstgewebe zu kapitulieren, das in der Regel in Organen und Krebsmassen vorkommt, wo die zusätzliche Zellmatrixsteifigkeit das Zellschicksal bestimmt. Sphäroide Kultur ist ein vielseitiges Modell, das mit anderen analytischen Assays nach Sphäroiddissoziation wie Menge Echtzeit-PCR und volle Zytometrie kombiniert werden kann. Paraformaldehyd, das zur Fixierung der Sphäroide verwendet wird, ist ein gefährliches chemisches Mittel.Handschuhe und Augenbekleidung sollten zum Schutz getragen werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Forschung

Krebsforschung

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...