Name: a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies
Uploaded: 2019-08-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies at JoVE.com

Reconhecemos a ajuda de Barbara Schedding na preparação do BM2 e do lebein-1. Reconhecemos a Àgnes Noel por compartilhar sua expertise em ensaios de esferóides. Agradecemos Sonja Schelhaas e Michael Schäfers por sua ajuda na manipulação de transfecção lentivirais condições S2. Reconhecemos a assistência de Sabine von Rüden na preparação de CAFs de tecido de câncer pancreático.
A investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do programa de pessoas (acções Marie Curie) do sétimo programa-quadro da União Europeia 7. º PQ/2007-2013/no âmbito do acordo de subvenção REA n ◦ (316610) para J.A.E. Além disso, a J.A.E. e a A.C.M.C. foram apoiadas financeiramente pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro do cluster de excelência Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Este projeto também foi apoiado por Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).

1. esferoides 3D como um modelo in vitro para a diferenciação de fibroblast/CAF usando diferentes compostos inibidores de TGF-β1 da interação célula-matriz
<ol><li>Misture 1 parte de solução de metilcelulose de 6 mg/mL e 3 partes de meios de cultura celular, MEM suplementado com 1% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina para obter a solução de formação de esferóide.</li>
	<li>Ressuscitou os fibroblastos normais imortalizados recentemente descongelados (iNFs), o CAF...

<ol>
	<li>Pietil&#228;, M., Ivaska, J., Mani, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whom+to+blame+for+metastasis,+the+epithelial-mesenchymal+transition+or+the+tumor+microenvironment?.">Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?.</a> Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).</li><li>Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy.">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+carcinomas+deposit+laminin-5,+preferably+adhere+to+laminin-5,+and+migrate+on+the+newly+deposited+basement+membrane.">Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane.</a> The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).</li><li>Eble, J. A., Niland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+tumor+progression+and+metastasis.">The extracellular matrix in tumor progression and metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. , (2019).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior.">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).</li><li>Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+Damage+Intended-Cancer-Associated+Fibroblasts+and+Vasculature+Are+Potential+Targets+in+Cancer+Therapy.">Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).</li><li>Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalinin:+an+epithelium-specific+basement+membrane+adhesion+molecule+that+is+a+component+of+anchoring+filaments.">Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).</li><li>Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipera+lebetina+venom+contains+two+disintegrins+inhibiting+laminin-binding+beta1+integrins.">Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).</li><li>Kusuma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+response+to+laminin-511+regulates+breast+tumor+cell+invasion+and+metastasis.">Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis.</a> International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).</li><li>Martins Cavaco, ., C, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Laminin-332+and+&#945;3&#946;1+Integrin+Determines+Differentiation+and+Maintenance+of+CAFs,+and+Supports+Invasion+of+Pancreatic+Duct+Adenocarcinoma+Cells.">The Interaction between Laminin-332 and &#945;3&#946;1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells.</a> Cancers. 11 (1), 14 (2019).</li><li>Ansari, N., M&#252;ller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+cell-based+assay+performed+with+cellular+spheroids+and+fluorescence+microscopy.">Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).</li><li>Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+suppresses+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+dermal+fibroblasts:+an+implication+for+abnormal+wound+healing.">TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).</li><li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-332-Rich+Tumor+Microenvironment+for+Tumor+Invasion+in+the+Interface+Zone+of+Breast+Cancer.">Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+&#946;3+Chains+of+Laminin-332+is+Associated+With+Clinicopathologic+Features+and+Decreased+Survival+in+Patients+With+Pancreatic+Adenocarcinoma.">Overexpression of &#946;3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).</li><li>Huang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+therapeutic+neovascularization+in+a+mouse+model+of+an+ischemic+limb+using+cell+aggregates+composed+of+HUVECs+and+cbMSCs.">Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs.</a> Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;6high+Cell+Population+Functions+as+an+Initiator+in+Tumorigenesis+and+Relapse+of+Human+Liposarcoma.">Integrin &#945;6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).</li><li>Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Drug+Sensitivity+in+Human+Colon+Cancer+Cells+after+Exposure+to+Heat:+Implications+for+Liver+Metastasis+Therapy+using+RFA+and+Chemotherapy.">Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).</li><li>Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+endothelial+cells+on+human+mesenchymal+stem+cell+activity+in+a+three-dimensional+in+vitro+model.">Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model.</a> European Cells &amp; Materials. 22, 242-257 (2011).</li><li>Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+system+using+on-chip+probe+with+wide+range+actuation.">Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation.</a> 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).</li><li>Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).</li><li>Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Nowicki, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+inhibits+invasion+of+glioma+cells;+possible+involvement+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3.</a> Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).</li></ol>

Desenvolver um modelo in vitro adequado para estudar a diferenciação da CAF é uma tarefa desafiadora. Após o emprego de diferentes abordagens, concluímos que um modelo esferóide 3D é o modelo mais prático, fisiológico e clinicamente relevante, no qual a interação entre células de carcinoma pancreática com CAFs imortalizados pode ser estudada. Este modelo impediu a diferenciação espontânea dos fibroblasto, devido aos estressores artefatual tais como a rigidez do plástico da cultura da pilha, pelo menos em...

O microambiente tumoral é um nicho muito complexo e extremamente importante para a manutenção e progressão das células tumorais1. É formado não só pelas células cancerosas, mas também por fibroblastos stromal. As pilhas do tumor são cercadas por um estroma que seja específico e diferente do estroma de tecidos normais2. Laminin-332 é uma proteína da matriz extracelular expressada ectopicamente no estroma de tumores diferentes, como do adenocarcinoma pancreatic3. Além disso, a composição bioquímica do ECM e também suas propriedades biofísicas, como rigidez e tensão, mudam dentro do volume tumoral4. Este estroma do tumor, ou "estroma reactivo", é causado por uma adaptação dos fibroblasto às pilhas de cancro vizinhas e pelo recrutamento de outros jogadores muito importantes que desenvolvem um ambiente favorável e de suporte para a progressão do tumor. A diferenciação de fibroblasto stromal conduz aos fibroblastos Cancer-associados (CAF). Essas células podem ser identificadas por meio de diferentes marcadores como α-actina de músculo liso (αSMA)5 ou antígeno neural/glial 2 (NG2)6.
O modelo in vitro mais adequado para recapitular o microambiente tumoral (TME) com CAFS é difícil de selecionar. O método para imitar parâmetros fisiológicos do TME de forma rentável e reprodutível deve ser considerado para tal sistema modelo. Dentro do TME, diferentes processos, como a proliferação, diferenciação, migração e invasão dos diferentes tipos de células ocorrem. Estes processos celulares podem ser realizados individualmente com diferentes métodos. No entanto, as condições experimentais devem considerar as interações celulares com a ECM do estroma tumoral, uma vez que a rigidez do substrato influencia o processo de diferenciação da CAF. R.G. Wells comentou sobre o impacto da rigidez matricial no comportamento celular e destacou que a organização citoesquelética e o status de diferenciação observados em células cultivadas in vitro podem ser artefactos7. Diferentes estímulos parecem estar envolvidos na diferenciação do Caf, incluindo a tensão mecânica5,7. Para evitar isso, substratos macios 2D podem ser possíveis abordagens para estudos de diferenciação, pois contorna o problema do plástico de prato de cultura rígida. Uma superfície 2D macia, em que os fibroblastos podem ser crescidos, pode ser colagénio-eu revestido géis do poliacrilamida, por meio de que a rigidez do gel pode ser manipulada pela concentração de poliacrilamida e pelo cross-linker do gel. A adesão e a formação de fibras de estresse ricas em αSMA são aprimoradas em fibroblastos, juntamente com a rigidez do gel8. Estes resultados salientam a importância dos andaimes de substrato macio para modelos de diferenciação in vitro mais fisiológicos. Entretanto, em nossas mãos a reprodutibilidade experimental e a imagem latente destes géis eram desafiantes. Para superar essas deficiências, mudamos o sistema de substrato 2D macio para um modelo de esferóide 3D para estudos de diferenciação e invasão. Este modelo é mais clinicamente relevante e, semelhante a um organoide in vitro, recapitula interações celulares in vivo, produção e deposição de ECM, bem como o comportamento celular9.
Spheroids são formados quando as células não têm um substrato para aderir. Quando as células são deixadas sem uma superfície adesiva, elas agregam para formar uma estrutura mais ou menos esférica. Se os esferoides são compor de um tipo de pilha, são chamados homospheroids; se compor de dois ou mais tipos diferentes da pilha formam heterospheroids.
Entre os diferentes métodos para a preparação do esferóide, realizamos o protocolo usando placas de fundo redondo não aderentes 96-well. É muito eficaz em relação aos custos. Aqui, nós produzimos ambos os homospheroids dos fibroblasto, CAF ou CAFs que faltam a subunidade do integrina α3 para examinar o processo da diferenciação e heterospheroids de CAFs ou de integrina α3 KO CAFs e pilhas pancreatic da carcinoma do duto (AsPC-I e PANC-I) para estudar a invasão na matriz circundante.
O alvo para estes estudos era usar CAFs preliminar isolados das biópsias pancreatic humanas da carcinoma. No entanto, as biópsias para obter as células são escassas e, por essa razão, os CAFs utilizados nestes estudos foram imortalizados usando Lentivirus contendo HTERT. Eles são chamados de iCAFs, e suas contrapartes normais, fibroblastos pancreáticos primários humanos, são denominados iNFs. Os fibroblasto pancreatic humanos e as pilhas pancreatic da carcinoma do duto, AsPC-I e PANC-I, estão disponíveis comercialmente.
Este protocolo foi utilizado para estudar o efeito da interação laminina-332-integrina no processo de diferenciação da CAF. Para comprovar a especificidade dessa interação e sua função, foram utilizados compostos inibidores: BM2, um anticorpo monoclonal que bloqueia o local de ligação da integrina a cadeia10de laminina-332 α3, ou lebein 1, um composto derivado de veneno de cobra que bloqueia a integrinas de ligação à laminina α3β1, α6β1 e α7β111,12.
Para o ensaio da invasão, as pilhas tinham sido transacidas com o Lentivirus que contem o cDNA que codifica mCherry (iCAFs e integrina α3 KO iCAFs) ou GFP (AsPC-I e PANC-I) para distinguir os tipos diferentes da pilha nos heterospheroids. A transdução das células para imortalizá-las e/ou rotulá-las com a expressão de proteína fluorescente (mCherry e GFP) é descrita em um estudo prévio13, que deve ser consultado para obter mais informações.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D9542-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6F12 anti-Laminin &#946;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A3IIF5 Anti-&#945;3 integrin subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V - BSA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-laminin &#947;2 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-589-620</td>
			<td>Sprout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM2 anti-laminin &#945;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 1S-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088831001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-I, rat tail</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 and 800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose 4.5 g/L)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSCaliburTM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelifying matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Matrigel, Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG, isotype</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X 0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>12449-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Primary Pancreatic Fibroblasts</td>
			<td>PELOBiotech</td>
			<td>PB-H-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>B6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-332</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 wells, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG, isotype</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi axle rotating mixer</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5 80V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-I</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by Prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG, isotype</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Rotor-Gene Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor Gene SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td>Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#243;rtex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Slide Angiogenesis, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies

Definir o modelo ideal para um estudo in vitro é essencial, principalmente se estudar processos fisiológicos como a diferenciação de células. No estroma do tumor, os fibroblastos do anfitrião são estimulados por pilhas de cancro para diferenciar-se. Assim, adquirem um phenotype que contribua ao microambiente do tumor e apoie a progressão do tumor. Ao usar o modelo esferóide, foi criado um sistema modelo in vitro 3D, no qual analisamos o papel do laminin-332 e sua integrina receptor α3β1 nesse processo de diferenciação. Este sistema do modelo do esferóide reproduz não somente as condições do microambiente do tumor em uma maneira mais exata, mas igualmente é um modelo muito versátil desde que permite estudos a jusante diferentes, tais como a mancha imunofluorescente de ambos intra e extracelular marcadores, bem como as proteínas da matriz extracelular depositadas. Além disso, análises transcricional por qPCR, citometria de fluxo e invasão celular podem ser estudadas com este modelo. Aqui, nós descrevemos um protocolo de um modelo do esferóide para avaliar o papel do integrina α3β1 de CAFS e seu ligand ectopicamente depositado, laminin-332, na diferenciação e em suportar a invasão de pilhas de cancro pancreatic.

Os resultados deste delineamento experimental são publicados em Martins cavaco et al.13, o que é recomendado para posterior leitura das conclusões extraídas desses experimentos.
A Figura 1, uma imagem representativa de um esferóide imunofluorescente, mostra a imunocoloração da subunidade de integrina α3 de fibroblastos imortalizados normais e de CAFS imortalizados (<s...

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A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Fibroblastos de cultivo em tecido tumoral recapitulado esferoide muito melhor do que o sistema 2D comumente usado em plástico rígido. Permite estudar a diferenciação de fibroblastos em um ambiente parecido com um tumor. Neste método, a rigidez do trabalho plástico da cultura celular não influencia na artefatude a diferenciação do fibroblasto.Em vez disso, a influência da interação da matriz celular na diferenciação induzida pelo tumor do fibroblasto pode ser analisada in vitro. Para iniciar esse procedimento, obtenha a mídia de cultura celular, que é suplementada com FBS inativado de 1%calor e estreptomicina de penicilina de 1%. Além disso, obtenha uma solução de 6 miligramas por mililitro de metilcelulose.Misture uma parte da metilcelulose com três partes da mídia de cultura celular para preparar a solução de formação de esferoides. Resuspend recém-descongelado fibroblastos normais imortalizados ou outros tipos de células como listado no protocolo de texto na solução de formação de esferoides. Se citocinas ou inibidores de integrin forem incluídos no estudo, adicione esses compostos à suspensão celular, a fim de embebê-los nos esferoides durante sua formação.Quando for o caso, adicione compostos inibidores juntamente com 10 nanogramas por mililitro de beta 1 TGF para desencadear a diferenciação em fibroblastos normais imortalizados. Distribua 100 microliters da solução de formação de esferoides em cada poço de uma placa multi-bem inferior redonda. Pipeta a solução em cada poço para cima e para baixo várias vezes para misturar.Em seguida, incubar a placa na incubadora de cultura celular a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir que um esferoide seja formado em cada poço. Primeiro, corte a ponta de uma pipeta para ampliar o orifício. Após a conclusão da incubação, use esta pipeta de corte para coletar os esferoides em um tubo de reação de 1,5 mililitro por condição experimental ou por proteína a ser analisada.Centrifugar os esferoides a 1000 vezes G por cerca de 30 a 60 segundos. Remova cuidadosamente a metilcelulose contendo supernaspeita por pipetação, certificando-se de não perturbar os esferoides pelleted. Um cuidado especial deve ser tomado ao transferir os esferoides para os tubos de reação.Certifique-se de que você não tem forças de deriva tesouras cortando a ponta. Também é importante que você colete todos os esferoides. Durante a etapa de lavagem, certifique-se de não perder os esferoides por aspiração.Para lavar os esferoides adicione 50 microliters de um X PBS. Centrífuga a 1000 vezes G por 30 a 60 segundos. Em seguida, remova cuidadosamente o PBS por pipetação.Dependendo da proteína a ser manchada, fixar os esferoides com 50 microliters de 4% de paraformaldeído e PBS por 20 minutos à temperatura ambiente. Lave os esferoides com PBS como descrito anteriormente. Permeabilize as células com 0,1% tritão X e PBS por quatro minutos em temperatura ambiente.Em seguida, lave os esferoides em PBS três vezes como descrito anteriormente. Adicione PBS contendo 5%FBS e 2%BSA aos esferoides e incubar à temperatura ambiente por uma hora para bloquear locais de interação proteica não específicas. Agora, incubar os esferoides com 30 microliters de anticorpos primários e PBS com 2,5% FBS e 1%BSA a quatro graus celsius durante a noite.No dia seguinte, lave os esferoides na PBS três vezes como descrito anteriormente. Depois disso, incubar os esferoides com 30 microliters de anticorpos secundários e PBS com 2,5% de FBS e 1%BSA em temperatura ambiente por 90 minutos. Lave os esferoides em PBS três vezes como descrito anteriormente.Em seguida, incubar as células com 30 microliters de solução de coloração Dappy por quatro minutos em temperatura ambiente. Lave os esferoides em PBS uma vez como descrito anteriormente. Usando uma pipeta pasteur de vidro, coloque os esferoides em uma lâmina de vidro e uma gota de PBS.Use um microscópio de varredura a laser para imagem dos esferoides por microscopia de fluorescência em uma ampliação de 10 vezes. Tome diferentes seções ópticas transversais do esferoide em diferentes planícies ópticas da pilha Z. Uma imagem representativa da coloração imunofluorescente dos homo esferoides de fibroblastos pancreáticos normais em comparação com os homo spheroids de fibroblastos imortalizados associados ao câncer mostra um sinal aumentado para a subunidade alfa três nas células diferenciadas.O sinal de fluorescência das células no esferoide são então quantificados com as imagens da pilha Z do esferoide 3D e os níveis transcricionais do gene subunidade alfa três integrin são determinados por qPCR. Todos esses resultados demonstram que o alfa três integrino é regulado em fibroblastos associados ao câncer imortalizado em comparação com a contrapartida normal. Isso prova que o alfa três beta integrin pode ser considerado um marcador para a diferenciação de fibroblastos pancreáticos.Este método é idealmente adequado para capitular o auto tecido geralmente encontrado em órgãos e massas cancerígenas onde a rigidez da matriz celular extra determina o destino celular. A cultura dos spheróides é um modelo versátil que pode ser combinado com outros ensaios analíticos após a dissociação esferoide, como quantidade de PCR em tempo real e citometria completa. Paraformaldeído usado para fixação dos esferoides é um agente químico perigoso.Luvas e desgaste dos olhos devem ser usados para proteção.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Pesquisa do câncer

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

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Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

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Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

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Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

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A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...