Name: a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies
Uploaded: 2019-08-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies at JoVE.com

Barbara Schedding 'in BM2 ve lebein-1 ' i hazırlamak için yaptığı yardımı kabul ediyoruz. Àgnes Noel 'i, uzmanlık alanındaki uzmanlığına göre paylaştığı için kabul ediyoruz. Biz S2 koşullarında lentiviral transfeksiyon ele yardım için Sonja Schelhaas ve Michael Schäfers teşekkür ederiz. Biz Pankreatik kanser dokusundan CAFs hazırlanması Sabine von Rüdenin yardımcı kabul.
Bu sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Birliği 'nin yedinci çerçeve programı olan FP7/2007-2013/REA hibe anlaşması uyarınca n ◦ (316610) kişi programı (Marie Curie Actions) J.A.E. için fon aldı Dahası, J.A.E. ve A.C.M.C., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından, hücre içinde hareket kümesi mükemmellik (EXC 1003-CIM) içinde mali olarak destekleniyordu. Bu proje Ayrıca Wilhelm Sander Stiftung tarafından destekleniyordu (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).

1. hücre matris etkileşimi farklı TGF-β1 inhibe bileşikleri kullanarak fibroblast/CAF farklılaşma için bir in vitro model olarak 3D kürler
<ol><li>Mix 1 Bölüm 6 mg/mL metilselüloz çözeltisi ve 3 parça hücre kültürü medya, MEM ile tamamlayıcı 1% ısı-inaktive fetal Sığır serum (FBS) ve 1% penisilin/streptomisin küroid oluşumu çözeltisi elde etmek için.</li>
	<li>Resuspend yeni çözülür ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastlar (INFs), ölümsüzleştirilmiş CAF (ıcafs) veya ıntegri...

<ol>
	<li>Pietil&#228;, M., Ivaska, J., Mani, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whom+to+blame+for+metastasis,+the+epithelial-mesenchymal+transition+or+the+tumor+microenvironment?.">Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?.</a> Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).</li><li>Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy.">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+carcinomas+deposit+laminin-5,+preferably+adhere+to+laminin-5,+and+migrate+on+the+newly+deposited+basement+membrane.">Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane.</a> The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).</li><li>Eble, J. A., Niland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+tumor+progression+and+metastasis.">The extracellular matrix in tumor progression and metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. , (2019).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior.">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).</li><li>Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+Damage+Intended-Cancer-Associated+Fibroblasts+and+Vasculature+Are+Potential+Targets+in+Cancer+Therapy.">Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).</li><li>Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalinin:+an+epithelium-specific+basement+membrane+adhesion+molecule+that+is+a+component+of+anchoring+filaments.">Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).</li><li>Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipera+lebetina+venom+contains+two+disintegrins+inhibiting+laminin-binding+beta1+integrins.">Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).</li><li>Kusuma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+response+to+laminin-511+regulates+breast+tumor+cell+invasion+and+metastasis.">Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis.</a> International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).</li><li>Martins Cavaco, ., C, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Laminin-332+and+&#945;3&#946;1+Integrin+Determines+Differentiation+and+Maintenance+of+CAFs,+and+Supports+Invasion+of+Pancreatic+Duct+Adenocarcinoma+Cells.">The Interaction between Laminin-332 and &#945;3&#946;1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells.</a> Cancers. 11 (1), 14 (2019).</li><li>Ansari, N., M&#252;ller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+cell-based+assay+performed+with+cellular+spheroids+and+fluorescence+microscopy.">Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).</li><li>Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+suppresses+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+dermal+fibroblasts:+an+implication+for+abnormal+wound+healing.">TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).</li><li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-332-Rich+Tumor+Microenvironment+for+Tumor+Invasion+in+the+Interface+Zone+of+Breast+Cancer.">Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+&#946;3+Chains+of+Laminin-332+is+Associated+With+Clinicopathologic+Features+and+Decreased+Survival+in+Patients+With+Pancreatic+Adenocarcinoma.">Overexpression of &#946;3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).</li><li>Huang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+therapeutic+neovascularization+in+a+mouse+model+of+an+ischemic+limb+using+cell+aggregates+composed+of+HUVECs+and+cbMSCs.">Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs.</a> Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;6high+Cell+Population+Functions+as+an+Initiator+in+Tumorigenesis+and+Relapse+of+Human+Liposarcoma.">Integrin &#945;6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).</li><li>Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Drug+Sensitivity+in+Human+Colon+Cancer+Cells+after+Exposure+to+Heat:+Implications+for+Liver+Metastasis+Therapy+using+RFA+and+Chemotherapy.">Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).</li><li>Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+endothelial+cells+on+human+mesenchymal+stem+cell+activity+in+a+three-dimensional+in+vitro+model.">Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model.</a> European Cells &amp; Materials. 22, 242-257 (2011).</li><li>Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+system+using+on-chip+probe+with+wide+range+actuation.">Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation.</a> 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).</li><li>Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).</li><li>Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Nowicki, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+inhibits+invasion+of+glioma+cells;+possible+involvement+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3.</a> Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).</li></ol>

CAF farklılaşma çalışması için uygun bir in vitro model geliştirmek için zorlu bir iştir. Farklı yaklaşımlar istihdam ettikten sonra, biz bir 3D küroid modeli daha pratik olduğunu sonucuna, fizyolojik ve klinik olarak ilgili model, hangi ölümsüzleştirilmiş CAFs ile pankreas Karsinomu hücreleri arasında etkileşim incelenebilir. Bu model, hücre kültürü plastiğin sertliği, en azından kısa vadeli kültür koşullarında (48 h 'ye kadar) gibi artifaktüel stres nedeniyle fibroblastların spontan...

Tümör mikroortamı çok karmaşık bir niş ve tümör hücrelerinin bakım ve ilerlemesi için son derece önemlidir1. Sadece kanser hücreleri tarafından değil, aynı zamanda stromal fibroblastlar tarafından da oluşur. Tümör hücreleri, normal dokuların stroma2özel ve farklı bir stroma ile çevrilidir. Laminin-332, pankreas adenokarsinoma3gibi farklı tümörlerin stroma içinde ekstrasellüler matris proteini ektopically ifade edilir. Dahası, ECM 'nin biyokimyasal bileşimi ve aynı zamanda rijitlik ve gerginlik gibi Biyofizik özellikleri, tümör dökme4içinde değişir. Bu tümör stroma veya "reaktif stroma", fibroblastların komşu kanser hücrelerine adaptasyon ve tümör ilerlemesi için olumlu ve destekleyici bir ortam geliştiren diğer çok önemli oyuncuların işe alınması ile kaynaklanır. Stromal fibroblastların farklılaşması kansere ilişkili fibroblastlar (CAF) ile sonuçlanır. Bu hücreler α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA)5 veya neural/glial antijen 2 (NG2)6gibi farklı işaretçiler kullanılarak tanımlanabilir.
En uygun in vitro modeli ile tümörün MIKROORTAMıNı (TME) cafs ile reapitlemek için seçmek zordur. TME 'nin fizyolojik parametrelerini uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir şekilde taklit etme yöntemi, böyle bir model sistemi için dikkate alınmalıdır. TME içinde proliferasyon, farklılaşma, göç ve farklı hücre türlerinin istilası gibi farklı süreçler ortaya çıkar. Bu hücresel süreçler farklı yöntemlerle bireysel olarak gerçekleştirilebilir. Ancak, deneysel koşulların tümör stroma ECM ile hücresel etkileşimleri dikkate almanız gerekir, çünkü substratum sertlik CAF farklılaşma sürecini etkiler. RG Wells matris sertlik hücre davranışına etkisi üzerine yorumladı ve siterografi organizasyonu ve in vitro kültürlü hücrelerde gözlenen farklılaşma durumunun artifaktüel olabilir vurgulanır7. Farklı uyaranlara, mekanik gerginlik5,7dahil CAF farklılaşma dahil gibi görünüyor. Bu önlemek için, 2D yumuşak substratlar farklılaşma çalışmaları için olası yaklaşımlar olabilir, onlar sert kültür çanak plastik sorununu atlatmak gibi. Yumuşak bir 2B yüzey, hangi fibroblastlar yetiştirilen olabilir, olabilir kollajen-I kaplamalı Poliakrilamid jelleri, böylece jel sertliği polimakrilid konsantrasyonu ve jel çapraz bağlayıcı tarafından manipüle edilebilir. ΑSMA zengin stres liflerinin yapışma ve oluşumu, jel sertliği8ile birlikte fibroblastlar içinde geliştirilmiştir. Bu sonuçlar, daha fazla fizyolojik in vitro farklılaşma modelleri için yumuşak substrat iskeleleri önemini vurgulmaktadır. Ancak, bizim elimizde bu jellerin deneysel yeniden üretilebilirliği ve görüntülenmesi zordur. Bu eksikliklerin üstesinden gelmek için, ayrım ve invazyon çalışmaları için 2B yumuşak substrat sistemini bir 3D küre modeli olarak değiştirdik. Bu model daha klinik olarak ilgilidir ve bir in vitro organoid benzer, in vivo hücre-hücre etkileşimleri, ECM üretim ve biriktirme, yanı sıra hücre davranışı9reapitler.
Hücreleri uygun bir substrat eksikliği olduğunda kürler oluşur. Hücreler yapışkan bir yüzey olmadan bırakılırken, daha fazla veya daha az küresel bir yapı oluşturacak şekilde toplar. Eğer kürler bir hücre türünden oluşuyorsa, bunlar homospheroidler olarak adlandırılır; iki veya daha fazla farklı hücre türlerinden oluşan, heterospheroids oluşturur.
Küroid hazırlama için farklı yöntemler arasında, biz olmayan-yapışlı yuvarlak alt 96-kuyu plakaları kullanarak protokol gerçekleştirin. Maliyetlere göre çok etkilidir. Burada, biz fibroblastlar hem homospheroids üretmek, CAF veya cafs ıntegrin α3 altbirim farklılaşma sürecini incelemek için ve cafs veya ıntegrin α3 Ko cafs ve pankreatik kanal Karsinomu hücreler (ASPC-ı ve panc-ı) işgali çalışma çevreleyen matrisin içine.
Bu çalışmaların amacı, insan pankreas Karsinomu biyopsilerinde izole edilen birincil cafeleri kullanıyordu. Ancak, biyopsiler hücreleri elde etmek için az ve bu nedenle, bu çalışmalar kullanılan CAFs Lentivirus HTERT içeren kullanarak ölümsüzleşmiş olmuştur. Onlar ıcafs denir, ve onların normal meslektaşları, primer insan pankreas fibroblastlar, INFs olarak adlandırılır. İnsan pankreatik fibroblastlar ve pankreatik kanal Karsinomu hücreleri, AsPC-ı ve PANC-ı, ticari olarak mevcuttur.
Bu protokol, laminin-332-ıntegrin etkileşiminin CAF farklılaşma sürecinde etkisini incelemek için kullanılmıştır. Bu etkileşimin ve fonksiyonunun özgüllüğünü kanıtlamak için, inhibitör bileşikleri kullanıldı: km2, ıntegrin bağlayıcı sitesini engelleyen bir monoklonal antikor laminin-332 α3 Chain10, veya lebein 1, bir yılan zehiri türeyen bileşik laminin-bağlayıcı integrinler α3β1, α6β1 ve α7β111,12.
İnvazif tahlil için hücreler, heterokürlerde farklı hücre tiplerini ayırt etmek için mCherry (ıcafs ve ıntegrin α3 KO ıcafs) veya GFP (AsPC-I ve PANC-I) kodlaması içeren Lentivirus ile transpenoed edilmiştir. Hücrelerin dönüştürücü onları ölümsüzleştirmek ve/veya floresan protein (mCherry ve GFP) ifade onları etiketlemek için bir önceki çalışmada açıklanan13, daha fazla bilgi için danışılmalıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D9542-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6F12 anti-Laminin &#946;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A3IIF5 Anti-&#945;3 integrin subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V - BSA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-laminin &#947;2 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-589-620</td>
			<td>Sprout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM2 anti-laminin &#945;3 subunit Mouse (monoclonal)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 1S-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088831001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-I, rat tail</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 and 800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose 4.5 g/L)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSCaliburTM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelifying matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Matrigel, Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG, isotype</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X 0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>12449-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Primary Pancreatic Fibroblasts</td>
			<td>PELOBiotech</td>
			<td>PB-H-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>B6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-332</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 wells, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG, isotype</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi axle rotating mixer</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5 80V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-I</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Kindly given by Prof. Jorg Haier&#39;s Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG, isotype</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Rotor-Gene Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor Gene SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td>Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#243;rtex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Slide Angiogenesis, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d spheroid model as a more physiological system for cancer-associated fibroblasts differentiation and invasion in vitro studies

Bir in vitro çalışma için ideal modelin tanımlanması, esas olarak hücrelerin farklılaşması gibi fizyolojik süreçler okurken esastır. Tümör stroma, ev sahibi fibroblastlar ayırt etmek için kanser hücreleri tarafından uyarılır. Böylece, tümör mikroortamına katkıda bulunan ve tümör ilerlemesini destekleyen bir fenotip elde ederler. Küroid modelini kullanarak, biz laminin-332 ve bu farklılaşma sürecinde α3β1 onun reseptör integral rolünü analiz hangi bir 3D in vitro model sistemi, kurdık. Bu küroid model sistemi sadece tümör mikroçevre koşullarını daha doğru bir şekilde üretmez, aynı zamanda çok yönlü bir modeldir, çünkü hem intra hem de ekstrüler olarak immünofluorescent boyama gibi farklı akış çalışmaları sağlar işaretleri, hem de yatırılmış ekstrellüler matris proteinleri. Dahası, qPCR tarafından transkripsiyonel analizler, akış sitometri ve hücresel invazyonu bu modelde incelenebilir. Burada, biz cafs ' ıntegrin α3β1 ve onun ektopik yatırılmış ligand, laminin-332, farklılaşma ve pankreas kanseri hücrelerinin istilasını destekleyen rolünü değerlendirmek için bir küroid model bir protokol açıklanmaktadır.

Bu deneysel tasarımın sonuçları, Bu deneylerden çekilen sonuçlara ilişkin daha fazla okuma için tavsiye edilen Martins Cavaco ve al.13' te yayınlanmaktadır.
Şekil 1, immünofluorescent küroların temsili bir görüntüsü, hem ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastlar ve ölümsüzleştirilmiş cafs (Şekil 1a), hem de immünofluor...

Watch this Scientific Journal Video about A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies at JoVE.com

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Bu protokolün amacı, immünofluorescence, transkripsiyon gibi farklı analiz sistemlerinde ele alınabilir bir tümör toplu benzeri ortamda, kanserle ilişkili fibroblastların (CAFs) farklılaşmasını incelemek için bir 3D in vitro modeli kurmaktır analiz ve yaşam hücresi görüntüleme.

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Küresel olarak fibroblastların kültüre sülatılması tümör dokusunu sert plastik üzerinde yaygın olarak kullanılan 2B sistemden çok daha iyi özetler. Tümör benzeri bir ortamda fibroblastların farklılaşmasını incelemenizi sağlar. Bu yöntemde hücre kültürü plastik çalışmalarının sertliği fibroblast farklılaşmasını etkilemez.Bunun yerine, fibroblast tümör indüklenen farklılaşma hücre matris etkileşimetkisi in vitro analiz edilebilir. Bu prosedüre başlamak için, MEM%1 ısı inaktive FBS ve % 1 penisilin streptomisin ile desteklenen hücre kültürü ortamı elde edin. Ayrıca, mililitre metilselüloz çözeltisi başına altı miligram elde.Metilselülozun bir kısmını hücre kültürü ortamının üç parçasıyla karıştırarak küresel oluşum çözeltisini hazırlayın. Küresel formasyon çözeltisinde metin protokolünde listelenen taze çözülmüş ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastları veya diğer hücre tiplerini yeniden askıya alın. Sitokinler veya integrin inhibitörleri çalışmaya dahil edilirse, bu bileşikleri hücre süspansiyonuna ekleyerek bu bileşikleri oluşumu sırasında küresel lere yerleştirin.Uygun olduğunda, ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastlarda farklılaşmayı tetiklemek için inhibitör bileşikleri ve tgf beta bir mililitre başına 10 nanogram ekleyin. Yuvarlak bir alt 96 çok kuyulu plaka her kuyuiçine küresel oluşum çözeltisi 100 mikrolitre dağıtın. Pipet her kuyuda çözeltiyi birkaç kez karıştırıp karıştırın.Daha sonra, hücre kültürü kuluçka makinesinde plakayı 37 santigrat derecede %5 karbondioksitle 24 saat boyunca kuluçkaya yatırarak her kuyuda bir küresel oidin oluşmasına izin verin. İlk olarak, deliği büyütmek için pipet ucunu kesin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, küresel leri deneysel durum başına 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne veya analiz edilecek protein başına toplamak için bu kesme pipeti kullanın.Yaklaşık 30 ila 60 saniye için 1000 kez G olarak siperoidler santrifüj. Peletli küresel leri rahatsız etmemek için boru lama yaparak süpernatant içeren metilselülozları dikkatlice çıkarın. Küresel lerin reaksiyon tüplerine aktarılmasında özel dikkat edilmelidir.Ucu keserek makas sürüklenme kuvvetleri olmadığından emin olun. Ayrıca tüm küresel leri toplamanız da önemlidir. Yıkama adımı sırasında, aspirasyon ile küresel leri kaybetmeyin emin olun.Küresel yıkamak için bir X PBS 50 mikrolitre ekleyin. 30-60 saniye için 1000 kez G santrifüj. Daha sonra pipetleme yaparak PBS'yi dikkatlice çıkarın.Lekelenecek proteine bağlı olarak, küresel leri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve PBS'nin 50 mikrolitresi ile düzeltin. Daha önce açıklandığı gibi PBS ile spheroids yıkayın. Hücreleri %0.1 triton X ve PBS ile oda sıcaklığında dört dakika geçirin.Daha sonra, pbs daha önce açıklandığı gibi üç kez spheroids yıkayın. Sferoidlere %5 FBS ve %2 BSA içeren PBS ekleyin ve spesifik olmayan protein etkileşim sitelerini engellemek için oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Şimdi, küresel leri 30 mikrolitre primer antikor ve PBS ile %2.5 FBS ve %1 BSA ile bir gecede dört derece yekponi ile kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, pbs üç kez daha önce açıklandığı gibi spheroids yıkayın. Bundan sonra, 30 mikrolitre sekonder antikor ve %2.5 FBS ve %1 BSA ile 90 dakika oda sıcaklığında küresel leri kuluçkaya yatırın. Daha önce açıklandığı gibi PBS üç kez spheroids yıkayın.Daha sonra, oda sıcaklığında dört dakika boyunca Dappy boyama çözeltisi 30 mikrolitre ile hücreleri kuluçka. Daha önce açıklandığı gibi PBS bir kez spheroids yıkayın. Cam pasteur pipetkullanarak, bir cam slayt ve PBS bir damla üzerine küresel yerleştirin.Floresan mikroskobu ile küresel leri 10 kat büyütme ile görüntülemek için lazer tarama mikroskobu kullanın. Z yığınının farklı optik düzlüklerinde küreseloidin farklı optik kesitini alın. Normal pankreas fibroblastlarının homo sferoidlerinin, ölümsüzleşmiş kanser ilişkili fibroblastların homo sferoidlerine göre immünoresan boyamasının temsili bir görüntüsü, farklılaşmış hücrelerdeki alfa üç alt birimi için artan bir sinyal göstermektedir.Daha sonra sferoiddeki hücrelerin floresan sinyali 3D küreseloidin Z destesi görüntüleri ile ölçülür ve integrin alfa üç alt birim geninin transkripsiyonel seviyeleri qPCR tarafından belirlenir. Tüm bu sonuçlar integrin alfa üç normal muadili ile karşılaştırıldığında ölümsüzleşmiş kanser ilişkili fibroblastlar upregulated olduğunu göstermektedir. Bu integrin alfa üç beta bir pankreas fibroblastlar farklılaşma için bir belirteç olarak kabul edilebilir kanıtlıyor.Bu yöntem ideal olarak genellikle ekstra hücre matris sertliği hücre kaderini belirler organlar ve kanser kitleleri bulunan öz doku kapitülya uygundur. Spheroids kültürü miktar gerçek zamanlı PCR ve tam sitometri gibi küresel dissosilasyon sonra diğer analitik tahliller ile kombine edilebilir çok yönlü bir modeldir. Küresel lerin fiksasyonunda kullanılan paraformaldehit tehlikeli bir kimyasal maddedir.Koruma için eldiven ve göz aşınması giyilmelidir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Baş ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu içinde perinöral invazyon İçin Bir Model

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Kanser Araştırmaları

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...