Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

نشكر جامعة تورو كلية كاليفورنيا للطب العظام لدعم أبحاثنا. ونحن نعترف الطلاب السابقين في المختبر (إستر وو، غريغوري بنغ، تايغون جين، جون ليم) الذين ساعدوا في تنفيذ هذه التقنية الحقن المجهري في مختبرنا. ونحن ممتنون للدكتورة كريستين هولت، التي تم تطوير تقنية الحقن المجهري/الشفة في أجنة Xenopus لأول مرة في مختبرها.

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة تورو كاليفورنيا (بروتوكول # TUCA003TE01X).
1. الحصول على X. laevis الأجنة
<ol><li>الحصول على X. laevis الأجنة عن طريق التزاوج الطبيعي من أزواج من الذكور والإناث الضفادع الكبار ت?...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

في هذه المقالة، نبين كيفية التعبير عن بنيات الحمض النووي الخارجية في أعداد واحدة أو صغيرة من الخلايا العصبية البصرية وكيفية صورة GFP الفردية التي تعبر عن الأشجار axonal البصرية مع الإشارات الجزيئية العادية والمتغيرة في سليمة، وأعمدة المعيشة من الضفدع X . محمد محمد كما نشرح كيفية إعادة بن?...

أثناء تطور الجهاز العصبي، تتنقل محاور الخلايا العصبية المتبصرة عبر مناطق مختلفة من الدماغ للوصول إلى المناطق المستهدفة. عندما تغزو المحاور الأنسجة المستهدفة، فإنها تنشئ اتصالات متشابكة مع الخلايا العصبية المستهدفة postsynaptic. في العديد من أنواع الخلايا العصبية، والمحاور زيادة عدد والمدى المكاني للاتصالات متشابك أنها يمكن أن تجعل من خلال وضع شبكات من فروع المحطة الطرفية أو الأشجار1. الإسقاط الريتينو تيكتال من الضفادع المائية Xenopus laevis هو نموذج الفقاريات قوية لفحص الآليات الكامنة وراء مشتل محور أكسون المحطة الطرفية والاتصال متشابك2،3،4 . يمكن ملاحظة GFP الفردية التي تعبر عن الأشجار axonal البصرية مع الإشارات الجزيئية العادية والمتغيرة مباشرة في سليمة، وحيا Xenopus الضفادع 5،6،7،8. للتعبير عن GFP وحدها أو جنبا إلى جنب مع كامل طول أو الإصدارات المقتطعة من الجينات في عدد قليل من الخلايا العصبية البصرية، ونحن نستخدم تقنية تنطوي على الحقن المجهري / lipofection من الحمض النووي في براعم العين من يوم واحد القديمة Xenopus الأجنة9، 10.وقد وضعت هذه التقنية في الأصل لدراسة آليات pathfinding axon البصرية في الضفادع Xenopus الشباب، ومنذ ذلك الحين تم تطبيقها من قبلنا والآخرين لتحديد الخلايا المستقلة الآليات الجزيئية الكامنة وراء axon البصرية التشتل في Xenopus الضفادع5،6،7،8،9،10.
وقد وضعت تقنيات بديلة للتعبير عن الجينات الخارجية في عدد قليل من الخلايا العصبية البصرية في الأنواع النموذجية الأخرى، وكذلك في X. laevis. ومع ذلك، فإن كل من هذه النهج يطرح تحديات وقيود بالمقارنة مع الحقن المجهري للحمض النووي/الكاشف في براعم العين من أجنة Xenopus. في الفئران، يمكن استخدام الجينات للتعبير عن الجينات في عدد صغير من الخلايا العصبية البصرية، ولكن توليد الفئران المعدلة وراثيا مكلفة وتستغرق وقتا طويلا والفئران المعدلة وراثيا غالبا ما تكون موجودة مع الآثار الجانبية غير المرغوب فيها11. كما يمكن إنشاء أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا التي تعبر عن الجينات الخارجية في الخلايا العصبية البصرية عن طريق حقن بلازميدات في الأجنة مرحلة الانقسام في وقت مبكر12. ومع ذلك، تتطلب هذه العملية استنساخ المروج محددة للتعبير عن الجينات في نمط الفسيفساء في الخلايا العصبية البصرية في يرقات حمار وحشي12. كما أن تواتر التعبير عن الحمض النووي الخارجي في الخلايا العصبية البصرية في أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثياً أقل إلى حد ما (<30%) بالمقارنة مع ضفادع Xenopus التي تم حقنها بالحمض النووي/ الكاشف الليبوسومي (30−60%)12 . في ovo الكهروبورة كما استخدمت للتعبير عن الجينات في أعداد صغيرة من الخلايا العصبية البصرية في الفراخ13. ومع ذلك، فشل هذا الإجراء في توصيف كامل الآليات التي تضع الإسقاطات البصرية لأن مشتل أكسون بصري لا يمكن أن يصور في الأجنة الفرخ الحية سليمة. وأخيرا، استخدمت عدة مختبرات الكهربائي لنقل الجينات إلى عدد صغير من الخلايا العصبية البصرية في الضفادع Xenopus 14،15. ومع ذلك، يتطلب الكهربة الاستفادة المثلى من المعدات والبروتوكولات (محفز، والأقطاب الكهربائية، والأنماط المكانية والزمنية لنبضات الأمواج) بما يتجاوز تلك المستخدمة للحقن المجهري لكاشف الحمض النووي/lipofection في براعم العيون لأجنة Xenopus.
نحن وآخرون استخدمنا سابقا تقنية الحقن المجهري / lipofection من الحمض النووي في براعم العين من أجنة Xenopus لتحديد الخلايا المستقلة آليات الإشارات التي تنشئ مشتل axonالبصرية 5،6، 7 , 8.استخدمنا في البداية هذا النهج لتشريح وظائف الكادرين وWnt محول البروتين β-catenin في مشتل axonal البصرية في xenopus الضفادع5،6. في دراسة واحدة، أظهرنا أن بيتا-الكاتينين ملزمة لα-catenin وPDZ مطلوب، على التوالي، لبدء وتشكيل الأشجار axonal البصرية في الجسم الحي5. في تقرير ثان، أظهرنا أن المجالات الملزمة بيتا-الكاتينين لα-catenin و GSK-3β عكس أنماط الإسقاط تحوير من الأشجار الأنبية البطينيةaxonal 6. في الآونة الأخيرة، حددنا الأدوار لعامل Wnt، الورم الحميد بوليبوسيس القولونية (APC)، في تنظيم السمات المورفولوجية من الأشجار السمعية في Xenopus الضفادع7. من خلال المشاركة في التعبير عن N-الطرفية والمجالات المركزية من APC أن تعدل بيتا-catenin الاستقرار وتنظيم microtubule جنبا إلى جنب مع GFP في الخلايا العصبية البصرية الفردية، حددنا الأدوار المشتركة والمتميزة لهذه المجالات التفاعل APC على رقم الفرع، طول، وزاوية في الأشجار axonal البصرية في الجسم الحي7. واستخدم مختبر آخر تقنية الحقن المجهري/الشفة لتحديد الأدوار المستقلة للخلايا للإشارة بواسطة مستقبلات BDNF، TrkB، في أرل axonal البصرية في الضفادع Xenopus 8. وأظهرت هذه المجموعة أن التعبير عن TrkB المهيمنة السلبية المتفرعة المضطربة والنضج متشابك في الأشجار أكسون البصرية الفردية في الجسم الحي8. بشكل عام، فإن تقنية lipofection في Xenopus قد أضاءت بالفعل الأدوار المحددة للجينات المختلفة في المتفرعة من axon البصرية في البيئة الأصلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

الإسقاط البصري الأساسي من الضفادع المائية Xenopus laevis بمثابة نظام نموذج ممتاز لدراسة الآليات التي تنظم تطوير الاتصال العصبية. أثناء إنشاء الإسقاط الريتينو تيكتال، تمتد المحاور البصرية من العين وتنتقل عبر مناطق متميزة من الدماغ للوصول إلى الأنسجة المستهدفة، وtectum البصرية. مرة واحدة axons البصرية تدخل tectum، فإنها تضع الأشجار الطرفية التي تعمل على زيادة عدد الاتصالات متشابك أنها يمكن أن تجعل مع الخلايا العصبية المستهدفة في tectum. هنا، ونحن نصف طريقة للتعبير عن الحمض النووي ترميز البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)، واكتساب وفقدان وظيفة الجينات المنشآت، في الخلايا العصبية البصرية (خلايا العقدة الشبكية) في أجنة Xenopus. نحن نشرح كيفية حقن الحمض النووي مجتمعة / lipofection الكاشف في براعم العين من الأجنة القديمة يوم واحد مثل أن يتم التعبير عن الجينات الخارجية في عدد واحد أو صغير من الخلايا العصبية البصرية. عن طريق وضع علامات على الجينات مع GFP أو الحقن المشترك مع بلازميد GFP، يمكن تصوير الأشجار axonal الطرفية من الخلايا العصبية البصرية الفردية مع الإشارات الجزيئية المتغيرة مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تكون صورة مباشرة في العقول يمكن قياسها كمياً. يسمح هذا البروتوكول بتحديد الآليات الجزيئية المستقلة للخلايا التي تكمن وراء تطوير مشتل أكسون بصري في الجسم الحي.

ينتج عن البروتوكول الموصوف في هذه المقالة معدل نجاح 30-60% من أجنة Xenopus المحقونة التي تعبر عن GFP (بمفردها أو مع بنيات الحمض النووي الإضافية) في شجرة واحدة إلى عشرة أشجار بصرية ذات محور. في الشكل 3، نعرض الصور التمثيلية البؤرية لـ GFP التي تعبر عن السيطرة والأشجار البصرية الم?...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

يهدف هذا البروتوكول إلى توضيح كيفية حقن خليط الحمض النووي/DOTAP بالميكروين في عيون الأجنة القديمة من Xenopus laevis في يوم من الأيام، وكيفية تصوير وإعادة بناء البروتين الفلورسنت الأخضر الفردي (GFP) الذي يعبر عن الأربور اللافسونية البصرية في العقول المتوسطة التكتال سليمة ، والذين يعيشون Xenopus الضفادع.

الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

في هذا الفيديو، ونحن شرح كيفية التعبير عن بنيات الحمض النووي الخارجية في الخلايا العصبية البصرية وكيفية صورة الفردية GFP التعبير عن الأربر المحورية البصرية في سليمة، ويعيش Xenopus المغافلين. هذا هو غير مكلفة، إجراء بسيط لtransgenesis الخلية محددة عابرة التي تسمح بتحديد الخلية وظيفة الجينات المستقلة في الأربر المحورية البصرية الفردية، النامية في نظام نموذج الفقاريات الحية. إثبات الإجراء سيكون أنا، صوفيا داو، مساعد باحث، والدكتورة تاميرا إيلول، المحقق الرئيسي في المختبر.للبدء، مقطع بلطف غيض من ماصة شعرية صغيرة الزجاج سحبت مع ملقط غرامة. ردم ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاجية مع الزيوت المعدنية باستخدام MICROFIL بحيث تظهر قطرة صغيرة من الزيت المعدني في طرف قص من ماصة صغيرة. ملء ماصة شعرية صغيرة الزجاج في منتصف الطريق مع الزيوت المعدنية.في حاقن، طرد المكبس في منتصف الطريق وتحميل ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاجية المسحوبة إلى حامل الحقن. ثم تمديد المكبس إلى أقصى حد للتأكد من أن ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة تعلق بقوة على حاقن ولا تتحرك مع تمديد المكبس. نقل قطرة ثلاثة ميكرولتر من خليط الحمض النووي / DOTAP على ورقة مربعة بوصة واحدة من ورق البارافين.تحت المجهر ستيريو تشريح، نقل غيض من ماصة شعرية صغيرة الزجاج في إسقاط الحمض النووي / DOTAP. استخدام خيار ملء على جهاز الحقن، وامتص ببطء إسقاط الحمض النووي / DOTAP في ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاج. الحدود بين الزيت المعدني وحل الحمض النووي/DOTAP مرئية في ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاجية بسبب التعتيم الطفيف من حل الحمض النووي/DOTAP.إذا لزم الأمر، والتوقف عن ملء ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة بشكل دوري للسماح للضغط في ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاج لإعادة معايرة. أولاً، في طبق بيتري سعة 10 ملليلتر مملوء بـ 0.1X MMR، دو فيتيلينيز يدوياً 10 مرحلة 20 إلى 24 جنين Xenopus مع ملقط ناعم. استوعب مظروف vitelline عند الخصر لتجنب إصابة الأجنة.مع ملقط في كل من اليد اليسرى والأيّني للمُجرّب، اِبْرْ فقاعة مظروف vitelline وحرر الجنين من مظروف vitelline. الحرص على عدم إصابة الأجنة عند إزالة المغلف vitelline. ثم استخدام ماصة نقل البلاستيك مع تلميح قطع لنقل خمسة إلى 10 مرحلة de-vitellinized 22 إلى 24 أجنة إلى طبق بيتري 10 ملليلتر مليئة 1X MMR.تحت مجهر ستيريو، فهم واحد من الأجنة دي vitellinized في طبق بيتري مع ملقط وترتيب الجنين بحيث يتم الإشارة إلى القطب الأمامي في مجال الرؤية. ثم توجيه الجنين بحيث يكون مستلقياً بشكلٍ مُراقَب، ويواجه أحد براعم العين اليمنى إلى اليسار صعودًا. عقد الجنين مع ملقط في اليد غير المجرب ومع اليد المهيمنة للمجرب، وإدخال غيض من ماصة صغيرة الزجاج من الجانب البطني أو الظهري فقط تحت البشرة في برعم العين.حقن ما بين 70 إلى 210 نانولترات من محلول الحمض النووي/DOTAP. ثم تحويل الجنين حول وتنفيذ الحقن الدقيقة نفسها في برعم العين الأخرى على الجانب الآخر من الجنين. حقن كل من براعم العين من ستة إلى 10 أجنة في كل تجربة.بعد الحقن الدقيق، قم بتخزين الأجنة في طبق بيتري مع 1X MMR لمدة 30 دقيقة تقريبًا لتسهيل التئام الجروح. بعد 30 دقيقة، نقل الأجنة المحقونة مع ماصة نقل البلاستيك إلى حل MMR 0.1X مع 0.001٪ وكيل التبييض فينيلثيوكارباميد للحد من التصبغ. غطي طبق بيتري بغطاء لثقافة الأجنة لمدة خمسة أيام تقريباً حتى تتطور الأجنة إلى شراغ في المراحل من 46 إلى 47.هذا البروتوكول يعطي معدل نجاح من 30 إلى 60٪ من الأجنة Xenopus حقن التعبير عن GFP في واحد إلى 10 arbors محور عصبي بصري. تظهر الصور confocal التمثيلية من GFP السيطرة المعبرة وarbors محور عصبي بصري متحولة في الشراغوف Xenopus سليمة. تم استنساخ اثنين من المسوخ المجال من APC، APCNTERM، وAPBbeta القط في psmids pCS2.وأعيد بناء صور السلسلة Z لمراقبة GFP وأربورات ضوئية متحولة من نوع APC. المؤامرات من عدد الفروع، مجموع طول فرع arbor، ومتوسط طول الفرع تؤكد الاختلافات الملاحظة بين السيطرة و APC متحولة تعبر عن أربور محور عصبي. إظهار مخططات مبعثر إضافية من عدد الفروع مقابل متوسط طول الفرع مع خطوط الانحدار ارتباط عكسي بين هذه المعلمات وarbors المحور المحوري البصرية التي تعبر عن نطاقات APC.يجب أن يتم إدراج طرف ماصة الشعيرات الدموية الدقيقة بشكل صحيح بشكل سطحي جدا في برعم العين بحيث البشرة الرمادية الإفراط في براعم العين تتضخم خلال كل حقنة صغيرة. يمكن استخدام هذا الإجراء لكل من تسمية وتغيير وظيفة وراثية محددة في الخلايا العصبية البصرية مع تقييم النمو، واستهداف، وتفريع من محاور عصبية من هذه الخلايا العصبية البصرية. وقد سمحت هذه الحقن الدقيق الحمض النووي وتقنية الشفط الباحثون في علم الأعصاب التنموي لدراسة الآليات الجزيئية المستقلة الخلية التي تنظم arborization محور عصبي البصري في سليمة، يعيش Xenopus الضفادع laevis.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

لقطة على نطاق الجينوم من المنظمين لونين والدول في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق رقاقة تسلسل

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

تحليل تحويل عامل النمو ß منتجات الانقسام الأسرة تفرز في Blastocoele من الأجنة Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

توليد تنكس الشبكية للتحقيق في استراتيجيات الإصلاح الخلوي في Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف آليات تجديد الشبكية في ضفدع Xenopus 

توليد نماذج إصابة الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...