Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Wir danken dem Touro University California College of Osteopathic Medicine für die Unterstützung unserer Forschung. Wir würdigen frühere Studenten im Labor (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim), die bei der Implementierung dieser Mikroinjektionstechnik in unserem Labor geholfen haben. Wir danken Dr. Christine Holt, in deren Labor diese DNA-Mikroinjektions-/Lipofektionstechnik in Xenopus-Embryonen zum ersten Mal entwickelt wurde.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Touro University California (Protokoll TUCA003TE01X) genehmigt.
1. Beschaffung von X. laevis Embryonen
<ol><li>Erhalten Sie X. laevis Embryonen durch natürliche Paar ungerührter männlicher und weiblicher erwachsener Frösche, die mit humanem Choriongonadotropin (HCG) grundiert sind, durch In-vitro-Fertilisation von Eiern, die von weiblichen erwachsenen Fröschen, die mit H...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. 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E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

In diesem Artikel zeigen wir, wie man exogene DNA-Konstrukte in einer oder einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen ausdrückt und wie man einzelne GFP-Ausdrücke von optischen axonalen Lauben mit normaler und veränderter molekularer Signalisierung in intakten, lebenden Kaulquappen des Frosches X . laevis. Wir erklären auch, wie die Morphologie des GFP zu rekonstruieren und zu quantifizieren, die optische axonale Lauben aus Bildern ausdrückt, die in vivo aufgenommen wurden. Um exogene DNA-Plasmide in einer...

Während der Entwicklung des Nervensystems navigieren Axone von präsynaptischen Neuronen durch verschiedene Regionen des Gehirns, um ihre Zielbereiche zu erreichen. Wenn Axone in ihr Zielgewebe eindringen, stellen sie synaptische Verbindungen mit postsynaptischen Zielneuronen her. In vielen Arten von Neuronen erhöhen Axone die Anzahl und räumliche Ausdehnung der synaptischen Verbindungen, diesie durch die Ausarbeitung von Netzwerken von Terminalzweigen oder Lauben 1 herstellen können. Die retinotektale Projektion von Kaulquappen des Wasserfrosches Xenopus laevis ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell zur Untersuchung von Mechanismen, die der terminalen Axonarborisation und synaptischen Konnektivität zugrunde liegen2,3,4 . Individuelle GFP-Exzessionen mit optischen axonalen Lauben mit normaler und veränderter molekularer Signalisierung können direkt in intakten, lebenden Xenopus-Kaulquappen 5,6,7,8beobachtet werden. Um GFP allein oder zusammen mit in voller Länge oder abgeschnittenen Versionen von Genen in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen auszudrücken, verwenden wir eine Technik, bei der die Mikroinjektion/Lipofection von DNA in Augenknospen von eintägigen Xenopus-Embryonen 9, 10. Diese Technik wurde ursprünglich entwickelt, um Mechanismen der optischen Axon-Pfadfindung in jungen Xenopus-Kaulquappen zu untersuchen, und wurde seitdem von uns und anderen angewendet, um zellautonome molekulare Mechanismen zu bestimmen, die dem optischen Axon zugrunde liegen. Arborisation in Xenopus Kaulquappen5,6,7,8,9,10.
Alternative Techniken zur Exjegung exogener Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen wurden in anderen Modellarten sowie in X. laevisentwickelt. Jeder dieser Ansätze stellt jedoch Herausforderungen und Einschränkungen dar, wenn man sie mit der Mikroinjektion von DNA/Lipofektionsreagenz in Augenknospen von Xenopus-Embryonen vergleicht. Bei Mäusen kann die Transgenese verwendet werden, um Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen auszudrücken, aber die Erzeugung von transgenen Mäusen ist teuer und zeitaufwändig und transgene Mäuse sind oft mit unerwünschten Nebenwirkungen vorhanden11. Transgene Zebrafische, die exogene Gene in optischen Neuronen ausdrücken, können auch durch Injektion von Plasmiden in Embryonen im frühen Spaltungsstadium12entstehen. Dieser Prozess erfordert jedoch das Klonen eines bestimmten Promotors, um Gene in einem Mosaikmuster in optischen Neuronen in Zebrafischlarvenauszudrücken 12. Die Expressionshäufigkeit exogener DNA in optischen Neuronen bei transgenen Zebrafischen ist ebenfalls etwas geringer (<30%) im Vergleich zu Xenopus-Kaulquappen, die mit DNA/liposomalem Reagenz mikroinjiziert wurden (30 bis 60%)12. In ovo Elektroporation wurde auch verwendet, um Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen in Kükenauszudrücken 13. Dieses Verfahren hat jedoch nicht die Mechanismen vollständig charakterisiert, die optische Projektionen herstellen, da die optische Axonarborisation nicht in intakten, lebenden Kükenembryonen abgebildet werden kann. Schließlich haben mehrere Laboratorien Elektroporation verwendet, um Gene in eine kleine Anzahl von optischen Neuronen in Xenopus Kaulquappen14,15zu transfekieren. Dennoch erfordert die Elektroporation eine Optimierung der Ausrüstung und Protokolle (Stimulator, Elektroden, räumliche und zeitliche Muster von Wellenimpulsen) über die für die Mikroinjektion von DNA/Lipofektionreagenz in Augenknospen von Xenopus-Embryonen verwendeten Daten.
Wir und andere haben zuvor die Technik der Mikroinjektion/Lipofektion von DNA in Augenknospen von Xenopus-Embryonen verwendet, um zellautonome Signalmechanismen zu bestimmen, die eine optische Axonarborisation 5,6, 7 , 8. Diesen Ansatz haben wir zunächst verwendet, um die Funktionen des Cadherin- und Wnt-Adapterproteins in der optischen axonalen Arborisierung in Xenopus-Kaulquappen 5,6zu sezieren. In einer Studie zeigten wir, dass die Bindung von '-Catenin an '-Catenin bzw. an PDZ für die Initiierung und Formgebung optischer axonaler Lauben in vivo5erforderlich ist. In einem zweiten Bericht haben wir gezeigt, dass die Bindungsdomänen für die A-Catenin- und GSK-3-Bindungsmuster von ventralen optischen axonalen Arbors6. In jüngerer Zeit haben wir Rollen für den Wnt-Faktor, adenomatous poliposis coli (APC), bei der Regulierung morphologischer Merkmale von optischen axonalen Lauben in Xenopus Kaulquappen7identifiziert. Durch die Ko-Exjekierung der N-Terminal und zentrale Domänen von APC, die die Organisation von A-Catenin-Stabilität und Mikrotubuli zusammen mit GFP in einzelnen optischen Neuronen modulieren, haben wir gemeinsame und unterschiedliche Rollen für diese APC-Interaktionsdomänen auf Zweignummer bestimmt. Länge und Winkel in optischen axonalen Lauben in vivo7. Ein anderes Labor verwendete die Mikroinjektions-/Lipofektionstechnik, um zellautonome Rollen für die Signalisierung durch den BDNF-Rezeptor TrkB in optischen axonalen Lauben in Xenopus Kaulquappen8zu bestimmen. Diese Gruppe zeigte, dass die Expression einer dominant-negativen TrkB gestörtverzweigte Verzweigung und synaptische Reifung in einzelnen optischen Axon-Arbors in vivo8. Insgesamt hat die Lipofektionstechnik in Xenopus bereits die spezifischen Rollen verschiedener Gene bei der optischen Axonverzweigung in der nativen Umgebung beleuchtet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

Die primäre visuelle Projektion von Kaulquappen des Wasserfrosches Xenopus laevis dient als ausgezeichnetes Modellsystem zur Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung neuronaler Konnektivität regulieren. Bei der Etablierung der retino-tektalen Projektion erstrecken sich optische Axone vom Auge aus und navigieren durch verschiedene Regionen des Gehirns, um ihr Zielgewebe, das optische Tectum, zu erreichen. Sobald optische Axone in das Tectum eindringen, erarbeiten sie Klemmenlaube, die die Anzahl der synaptischen Verbindungen erhöhen, die sie mit Zielinterneuronen im Tectum herstellen können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Exodierung von DNA-Kodierung von grünem fluoreszierendem Protein (GFP) und Gain- und Verlust-von-Funktions-Genkonstrukte in optischen Neuronen (retinalen Ganglienzellen) in Xenopus-Embryonen. Wir erklären, wie man ein kombiniertes DNA/Lipofection-Reagenz in Augenknospen von eintägigen Embryonen mikroinjiziert, so dass exogene Gene in einer oder einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen exprimiert werden. Durch Taggen mit GFP oder Co-Injektion mit einem GFP-Plasmid können terminale axonale Arbors einzelner optischer Neuronen mit veränderter molekularer Signalisierung direkt in Gehirnen intakter, lebender Xenopus-Kaulquappen einige Tage später und deren Morphologie abgebildet werden. quantifiziert werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht die Bestimmung zellautonomer molekularer Mechanismen, die der Entwicklung der optischen Axonarborisation in vivo zugrunde liegen.

Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll ergibt eine Erfolgsrate von 30 bis 60% der injizierten Xenopus-Embryonen, die GFP (allein oder zusammen mit einem zusätzlichen DNA-Konstrukt) in ein bis zehn optischen axonalen Lauben exzieren. In Abbildung 3zeigen wir repräsentative konfokale Bilder von GFP, die Kontrolle und mutierte optische axonale Lauben in intakten Xenopus Kaulquappen aus unserer kürzlich veröffentlichten Studie7ausdrücken. Für...

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Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

In diesem Video zeigen wir, wie man exogene DNA-Konstrukte in optischen Neuronen ausdrückt und wie man einzelne GFP-exprimierende optische axonale Lauben in intakten, lebenden Xenopus laevis Kaulquappen abbilden kann. Dies ist ein kostengünstiges, einfaches Verfahren für die transiente zellspezifische Transgenese, das die Bestimmung der zellautonomen Genfunktion in einzelnen optischen axonalen Lauben ermöglicht und sich in einem lebenden Wirbeltiermodellsystem entwickelt. Demonstrieren sie das Verfahren von mir, Sophia Dao, Research Assistant, und Dr.Tamira Elul, Lab Principal Investigator.Zunächst die Spitze einer gezogenen Mikrokapillarpipetten aus Glas vorsichtig mit feinen Zangen beschneiden. Füllen Sie die Mikrokapillarpipeette aus Glas mit Mineralöl mit einem MICROFIL, so dass an der abgeschnittenen Spitze der Mikropipette ein winziger Tropfen Mineralöl erscheint. Füllen Sie die Mikrokapillarpipetten des Glases auf halbem Weg mit Mineralöl.In einem Injektor den Kolben halb auswerfen und die gezogene Mikrokapillarpipeette aus Glas in den Injektionshalter laden. Dann verlängern Sie den Kolben in vollem Umfang, um zu bestätigen, dass die Mikrokapillarpipette stark am Injektor befestigt ist und sich nicht mit der Verlängerung des Kolbens bewegt. Übertragen Sie einen drei Mikroliter Tropfen der DNA/DOTAP-Mischung auf ein ein Zoll großes quadratisches Blatt Paraffinpapier.Bewegen Sie unter einem Stereo-Sezierendes Mikroskop die Spitze der Mikrokapillarpipetten aus Glas in den DNA/DOTAP-Tropfen. Verwenden Sie die Fülloption auf dem Injektionsapparat, saugen Sie langsam die DNA/DOTAP Tropfen in das Glas Mikrokapillarpipetette. Die Grenze zwischen mineralöl und der DNA/DOTAP-Lösung ist in der Mikrokapillarpipetten des Glases aufgrund der leichten Opazität der DNA/DOTAP-Lösung sichtbar.Beenden Sie bei Bedarf die regelmäßige Füllung der Mikrokapillarpipette, damit der Druck in der Mikrokapillarpipetten aus Glas neu kalibriert werden kann. Zuerst, in einer 10 Milliliter Petrischale gefüllt mit 0,1X MMR, manuell devitellinisieren 10 Stufe 20 bis 24 Xenopus Embryonen mit feinen Zangen. Greifen Sie die Vitelline-Hülle an der Taille, um die Embryonen nicht zu verletzen.Mit Zangen in der linken und rechten Hand des Experimentators, pop die Blase der Vitelline-Hülle und lassen Sie den Embryo aus der Vitelline-Hülle. Achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu verletzen, wenn Sie die Vitelline-Hülle entfernen. Dann verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit einer geschnittenen Spitze, um fünf bis zehn de-vitellinisierte Stadium 22 bis 24 Embryonen auf eine 10 Milliliter Petrischale mit 1X MMR gefüllt zu übertragen.Greifen Sie unter einem Stereomikroskop einen der entvitellinisierten Embryonen in der Petrischale mit Dereinspen und ordnen Sie den Embryo so an, dass sein vorderer Pol im Sichtfeld nach oben zeigt. Richten Sie dann den Embryo so aus, dass er seitlich liegt und eine seiner von links nach rechts gerichteten Augenknospen nach oben zeigt. Halten Sie den Embryo mit der Zange in der nicht dominanten Hand des Experimentators und mit der dominanten Hand des Experimentators, führen Sie die Spitze der Glasmikropipette von der ventralen oder dorsalen Seite direkt unter der Epidermis in die Augenknospe ein.Injizieren Sie zwischen 70 bis 210 Nanoliter der DNA/DOTAP-Lösung. Drehen Sie dann den Embryo um und führen Sie die gleiche Mikroinjektion in die andere Augenknospe auf der kontralateralen Seite des Embryos durch. Injizieren Sie beide Augenknospen von sechs bis zehn Embryonen in jedem Experiment.Nach der Mikroinjektion Embryonen in einer Petrischale mit 1X MMR ca. 30 Minuten lagern, um die Wundheilung zu erleichtern. Übertragen Sie die injizierten Embryonen nach 30 Minuten mit einer Kunststofftransferpipette in eine 0,1X MMR-Lösung mit 0,001% Bleichmittel Phenylthiocarbamid, um die Pigmentierung zu reduzieren. Bedecken Sie die Petrischale mit einem Deckel, um die Embryonen für etwa fünf Tage zu kultivieren, bis sich die Embryonen in den Stadien 46 bis 47 zu Kaulquappen entwickelt haben.Dieses Protokoll ergibt eine Erfolgsrate von 30 bis 60% der injizierten Xenopus-Embryonen, die GFP in ein bis zehn optischen axonalen Lauben exezieren. Repräsentative konfokale Bilder von GFP zeigen die exzessende Kontrolle und mutierte optische axonale Lauben in den intakten Xenopus Kaulquappen. Zwei Domänenmutanten von APC, APCNTERM und APBbeta-cat wurden in pCS2-Plasmide geklont.Die Bilder der GfP-Steuerung und der aPC-mutierten optischen axonalen Lauben wurden rekonstruiert. Plots der Anzahl der Zweige, der gesamten Laubenverzweigungslänge und der mittleren Verzweigungslänge bestätigen beobachtete Unterschiede zwischen Derkontrolle und APC-Mutanten, die axonale Lauben ausdrücken. Zusätzliche Streudiagramme mit einer Anzahl von Zweigen im Vergleich zur mittleren Verzweigungslänge mit Regressionslinien zeigen eine inverse Korrelation zwischen diesen Parametern und optischen axonalen Lauben, die APC-Domänen exemitenieren.Die Spitze der Mikrokapillarpipette muss sehr oberflächlich in die Augenknospe eingeführt werden, so dass die graue Epidermis, die die Augenknospe überlagert, während jeder Mikroinjektion anschwillt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um spezifische genetische Funktion in optischen Neuronen zu kennzeichnen und zu verändern, während das Wachstum, targeting und Verzweigung von Axonen aus diesen optischen Neuronen bewertet wird. Diese DNA-Mikroinjektion und Lipofektionstechnik hat es Forschern in der Entwicklungsneurobiologie ermöglicht, zellautonome molekulare Mechanismen zu untersuchen, die die optische Axonarborisierung in intakten, lebenden Xenopus laevis Kaulquappen regulieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Erzeugung von Netzhautdegeneration zur Untersuchung zellulärer Reparaturstrategien bei Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Regenerationsmechanismen der Netzhaut beim Xenopus-Frosch 

Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...