Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Мы благодарим Университет Туро Калифорнийский колледж остеопатической медицины за поддержку наших исследований. Мы признаем предыдущих студентов в лаборатории (Эстер Ву, Грегори Пэн, Тэгун Джин, Джон Лим), которые помогли реализовать эту технику микроинъекций в нашей лаборатории. Мы благодарны доктору Кристинхол, в чьей лаборатории была впервые разработана эта методика микроинъекций/липотекции ДНК в эмбрионах Ксенопуса.

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Туро в Калифорнии (Протокол TUCA003TE01X).
1. Получение X. laevis Эмбрионы
<ol><li>Получить X. laevis эмбрионов путем естественного спаривания пар мужчин и...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

В этой статье мы демонстрируем, как выразить экзогенные конструкции ДНК в одном или малом количестве оптических нейронов и как изображение отдельных GFP, выражающих оптические аксональные беседки с нормальными и измененными молекулярными сигнализациями в нетронутых, живых головастях ...

Во время развития нервной системы аксоны пресинаптических нейронов проходят через различные области мозга, чтобы достичь своих целевых областей. Когда аксоны вторгаются в их ткани-мишени, они устанавливают синаптические связи с постсинаптические нейроны-мишени. Во многих типах нейронов аксоны увеличивают количество и пространственную степень синапических связей, которые они могут сделать, разрабатывая сети терминальных ветвей или беседок1. Ретино-тектальная проекция головастиков водной лягушки Xenopus laevis является мощной позвоночной моделью для изучения механизмов, лежащих в основе аксонизации терминала и синаптической связи2,3,4 . Индивидуальный GFP, выражающий оптические аксональные беседки с нормальной и измененной молекулярной сигнализацией, можно наблюдать непосредственно в нетронутых, живых головастях Ксенопуса 5,6,7,8. Чтобы выразить GFP в одиночку или вместе с полнометражными или усеченными версиями генов в небольшом количестве оптических нейронов, мы используем технику, включающую микроинъекцию/липофекацию ДНК в глазные будки однодневных эмбрионов Ксенопуса 9, 10. Этот метод был первоначально разработан для изучения механизмов оптического аксона поиска путей в молодых головастиков Xenopus, и с тех пор применяется нами и другими для определения клеточных автономных молекулярных механизмов, лежащих в основе оптического аксона беседка в Ксенопус головастики5,6,7,8,9,10.
Альтернативные методы экспрессирования экзогенных генов в небольшом количестве оптических нейронов были разработаны в других видах моделей, а также в X. laevis. Тем не менее, каждый из этих подходов представляет проблемы и ограничения по сравнению с микроинъекцией ДНК / липотекции реагента в глазных рецепторах эмбрионов Ксенопуса. У мышей трансгенез может быть использован для выражения генов в небольшом количестве оптических нейронов, но генерация трансгенных мышей является дорогостоящим и трудоемким и трансгенных мышей часто присутствует с нежелательными побочными эффектами11. Трансгенные зебры, которые выражают экзогенные гены в оптических нейронов также могут быть созданы путем введения плазмиды в ранней стадии декольте эмбрионов12. Тем не менее, этот процесс требует клонирования конкретного промоутера, чтобы выразить гены в мозаичном рисунке в оптических нейронов в личинки зебры12. Частота экспрессии экзогенной ДНК в оптических нейронах у трансгенных зебры также несколько ниже (Злт;30%) по сравнению с Ксенопус головастики, которые были микровведены с ДНК / липосомальный реагент (30-60%)12. В ово электропорации также используется для выражения генов в небольших количествах оптических нейронов у птенцов13. Тем не менее, эта процедура не смогла полностью охарактеризовать механизмы, которые устанавливают оптические проекции, потому что оптический аксон беседки не могут быть изображены в нетронутых, живых эмбрионов цыпленка. Наконец, несколько лабораторий использовали электропорации для трансфекта генов в небольшое количество оптических нейронов в Ксенопус головастики14,15. Тем не менее, электропорация требует оптимизации оборудования и протоколов (стимулятор, электроды, пространственные и временные модели волновых импульсов) за то, что используется для микроинъекции ДНК / липотекции реагента в глазные рецепторы эмбрионов Ксенопуса.
Мы и другие ранее использовали метод микроинъекции / липотекации ДНК в глазные рецепторы эмбрионов Ксенопуса для определения клеточных автономных механизмов сигнализации, которые устанавливают оптический аксон беседы5,6, 7 (г. , 8. Мы первоначально использовали этот подход, чтобы вскрыть функции Cadherin и Wnt адаптер белка -катенин в оптической аксональной арборизации в Ксенопус головастики5,6. В одном исследовании мы показали, что связывание к катенину и PD, соответственно, требуется для иначины и формирования оптических аксональных беседок in vivo5. Во втором отчете мы продемонстрировали, что связывающие домены для кятенина и ГСК-3 противоположники модулируют проекционные модели брюшной оптической аксональной арборы6. Совсем недавно мы определили роли для фактора Wnt, аденоматозной полипозной палочки (APC), в регулировании морфологических особенностей оптических аксональных беседок в Головаки Xenopus 7. Совместно выражая N-терминал и центральные домены APC, которые модулируют стабильность и микротубулы вместе с GFP в отдельных оптических нейронах, мы определили общие и различные роли для этих доменов взаимодействия APC на номере филиала, длина и угол в оптических аксональных беседок in vivo7. Другая лаборатория использовала метод микроинъекции/липофектирования для определения клеточных автономных ролей для сигнализации рецептором BDNF, TrkB, в оптических аксональных беседках в головастях Ксенопуса 8. Эта группа показала, что выражение доминирующей отрицательной TrkB возмущенвной ветвления и синаптической созревания в отдельных оптических аксонов беседки in vivo8. В целом, метод липотекации в Ксенопууже уже освещает специфические роли различных генов в ветвящейся оптический аксон в родной среде.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

Первичная визуальная проекция головастиков водной лягушки Xenopus laevis служит отличной модельной системой для изучения механизмов, регулирующих развитие нейронной связи. Во время создания ретино-текальной проекции, оптические аксоны простираются от глаза и перемещаться по различным областям мозга, чтобы достичь своей целевой ткани, оптического тектума. Как только оптические аксоны попадают в тектум, они разрабатывают терминальные беседки, которые функционируют, чтобы увеличить количество синапических соединений, которые они могут сделать с целевыми интернейронами в тектуме. Здесь мы описываем метод выражения ДНК, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP), и усиление и потеря функции гена конструкций, в оптических нейронов (клетки ганглия) в эмбрионах Ксенопуса. Мы объясняем, как микровимировать комбинированный реагент ДНК/липотекции в глазные рецепторы однодневных эмбрионов, так что экзогенные гены выражаются в одном или небольшом количестве оптических нейронов. Пометки генов с GFP или совместного введения с плазмид GFP, терминал аксональных беседок отдельных оптических нейронов с измененной молекулярной сигнализации могут быть изображены непосредственно в мозге нетронутыми, живые головастики Xenopus несколько дней спустя, и их морфологии может быть количественно. Этот протокол позволяет определить клеточные молекулярные механизмы, лежащие в основе развития оптического аксона arborization in vivo.

Протокол, описанный в этой статье, дает показатель успеха 30-60% инъекционных эмбрионов Ксенопуса, выражающих GFP (в одиночку или вместе с дополнительными конструкциями ДНК) в одной-десяти оптических аксональных беседок. На рисунке 3, мы показываем представитель конфок...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Этот протокол призван продемонстрировать, как микровимизм ДНК / DOTAP смесь в глазные будни одного дня старый Xenopus laevis эмбрионов, и как изображение и реконструировать отдельные зеленые флуоресцентные белки (GFP), выражая оптические аксональные арборы в тектальных средних мозгов нетронутыми, живые головастики Xenopus.

Микроинъекция ДНК в глазные будни в Xenopus laevis Эмбрионы и изображения GFP Экспрессинг Оптические аксональные беседки в Intact, живые Ксенопус Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

В этом видео, мы демонстрируем, как выразить экзогенные конструкции ДНК в оптических нейронов и как изображение отдельных GFP-экспрессии оптических аксональных беседки в нетронутыми, живые Xenopus laevis головастики. Это недорогая, простая процедура для преходящих клеточных трансгенезов, которая позволяет определить функцию клеточного автономного гена в отдельных оптических аксональных беседках, развивающихся в живой позвоночной модели системы. Демонстрация процедуры будет я, София Дао, научный сотрудник, и д-р Тамира Элул, лаборатория главный исследователь.Для начала аккуратно обрезайте кончик вытащил стекла микро капиллярной пипетки с тонкой типсов. Заполнюйте стеклянную микро капиллярную пипетку минеральным маслом с помощью MICROFIL так, что крошечная капля минерального масла появляется на обрезанном кончике микро pipette. Заполните стеклянный микро капиллярный пипетку на полпути с минеральным маслом.В инжекторе, извлечь поршень на полпути и загрузить вытащил стекла микро капиллярной пипетки в держатель впрыска. Затем удлинить поршень в полной мере, чтобы подтвердить, что микро капиллярная пипетка сильно прикреплена к инжектору и не двигается с расширением поршеня. Перенесите три капли микролитров смеси ДНК/DOTAP на квадратный лист парафиновой бумаги на один дюйм.Под стерео рассечение микроскопа, переместить кончик стекла микро капиллярной пипетки в ДНК / DOTAP падение. Используйте опцию заполнения на инъекционный аппарат, медленно сосать ДНК / DOTAP падение в стекло микро капиллярной пипетки. Граница между минеральным маслом и раствором ДНК/DOTAP видна в стеклянной микрокапсиллярной трубе из-за небольшой непрозрачности раствора ДНК/DOTAP.При необходимости, прекратить заполнение микро капиллярной пипетки периодически, чтобы давление в стеклянной микро капиллярной пипетки для перекалибровки. Во-первых, в 10 миллилитров Петри блюдо заполнено 0.1X MMR, вручную de-vitellinize 10 этап от 20 до 24 Xenopus эмбрионов с тонкой типсов. Возьмите конверт вителлина на талии, чтобы избежать травм эмбрионов.С помощью типсов в левой и правой руке экспериментатора, поп пузырь вителлин конверта и освободить эмбрион из конверта вителлина. Позаботьтесь, чтобы не повредить эмбрионы при удалении конверта вителлина. Затем используйте пластиковую трубку передачи с разрезом наконечник для передачи от пяти до 10 де-vitellinized этапе от 22 до 24 эмбрионов в 10 миллилитров Петри блюдо заполнено 1X MMR.Под стерео микроскопом схватите один из девителлиозных эмбрионов в чашке Петри типсами и устроите эмбрион так, чтобы его передний полюс был направлен в поле зрения. Затем сориентировать эмбрион так, чтобы он лежал боковой и один из его лево-правого глаза почки сталкивается вверх. Держите эмбрион с типсами в недоминной руке экспериментатора и с доминирующей рукой экспериментатора, ввемите кончик стеклянной микротупети с брюшной или спинной стороны прямо под эпидермисом в глазной бутон.Ввись от 70 до 210 нанолитров раствора ДНК/DOTAP. Затем поверните эмбрион вокруг и выполнить тот же микро-инъекции в другой глаз бутон на контралатеральной стороне эмбриона. Инъекции обоих глазных почек от шести до 10 эмбрионов в каждом эксперименте.После микро-инъекций, хранить эмбрионы в чашке Петри с 1X MMR в течение примерно 30 минут, чтобы облегчить заживление ран. Через 30 минут перенесите вводимые эмбрионы с пластиковой переносной пипеткой в раствор 0.1X MMR с 0.001% отбеливающим агентом фенилтиокарбамид для уменьшения пигментации. Обложка чашки Петри с крышкой для культуры эмбрионов в течение примерно пяти дней, пока эмбрионы превратились в головастиков на этапах 46 до 47.Этот протокол дает успех от 30 до 60% инъекционных эмбрионов Xenopus, выражают GFP в 1 до 10 оптических аксональных беседок. Представитель конфокальные изображения GFP показывают выражение контроля и мутантных оптических аксональных беседок в нетронутых головастиков Xenopus. Два доменных мутанта БТР, APCNTERM и APBbeta-кошка были клонированы в плазмиды pCS2.Были реконструированы снимки управления GFP и APC мутантных аксональных беседок. Участки количества ветвей, общая длина ветви беседки и средняя длина ветви подтверждают наблюдаемые различия между контролем и мутантом БТР, выражают аксональные беседки. Дополнительные участки рассеяния числа ветвей по сравнению со средними длинами ветви с линиями регрессии показывают обратную корреляцию между этими параметрами и оптическими аксональными беседки, выражают домены APC.Кончик микро капиллярной пипетки должны быть правильно вставлены очень поверхностно в глаз бутон так, что серый эпидермис чрезмерно глаз бутон набухает во время каждой микро-инъекции. Эта процедура может быть использована как для обозначения и изменения конкретной генетической функции в оптических нейронов при оценке роста, ориентации и ветвления аксонов из этих оптических нейронов. Этот метод микро-инъекций ДНК и липофекции позволил исследователям в нейробиологии развития изучать клеточные автономные молекулярные механизмы, которые регулируют оптическую арборизацию аксона в нетронутых, живых головастиках Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Манипуляция и<em&gt; In Vitro</em&gt; Созревание<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; ооциты, а затем внутриклеточное инъекции сперматозоида в целях изучения эмбрионального развития

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Генома Снимок хроматина регуляторов и государства в<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбрионы по чип-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Использование конфокальной Анализ<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; По расследованию модуляторы Wnt и Shh морфогена градиентов

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему<em&gt; Xenopus</em&gt; почки

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Флуоресцентные изображения кальция и последующей на месте гибридизации для нейрональной характеристики прекурсоров в Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Анализ трансформирующего фактора роста ß Семейство расщепляющих продуктов, секретируемых в бластоцеле эмбрионов Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Генерация дегенерации сетчатки для исследования стратегий клеточного восстановления при Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

В центре внимания автора: Изучение механизмов регенерации сетчатки у лягушки Xenopus 

Создание моделей повреждений сетчатки у головастиков Xenopus

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...