Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Vi tackar Touro University California College of Osteopatisk medicin för att stödja vår forskning. Vi erkänner tidigare studenter i laboratoriet (Esther Wu, Gregory peng, taegun Jin, John lim) som hjälpte till att genomföra denna görs teknik i vårt laboratorium. Vi är tacksamma för Dr Christine Holt, i vars laboratorium denna DNA microinjection/lipofection teknik i Xenopus embryon utvecklades först.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Touro University California (protokoll # TUCA003TE01X).
1. erhållande av X. laevis embryon
<ol><li>Få X. laevis embryon genom naturlig parning av par av manliga och kvinnliga vuxna grodor primas med humant koriongonadotropin (hCG), genom in vitro fertilisering av ägg som skjul från kvinnliga vuxna grodor PRIMAS med HCG, eller genom att beställa direkt (<...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

I den här artikeln visar vi hur man uttrycker exogena DNA-konstruktioner i ett eller ett litet antal optiska neuroner och hur man avbildar enskilda GFP uttrycker optiska axonala arbors med normala och förändrade molekylära signalering i intakt, levande grodyngel av grodan X . laevis. Vi förklarar också hur man rekonstruera och kvantifiera morfologin av GFP uttrycker optiska axonala arbors från bilder tagna in vivo. För att uttrycka exogena DNA-plasmider i litet antal optiska neuroner, microinjicera vi en...

Under utvecklingen av nervsystemet, axoner av presynaptiska neuroner navigera genom olika regioner i hjärnan för att nå sina mål områden. När axoner invadera deras målvävnader, de upprättar synaptiska anslutningar med postsynaptiska mål nervceller. I många typer av nervceller, axoner öka antalet och rumsliga omfattningen av synaptiska anslutningar de kan göra genom att utarbeta nätverk av terminalen grenar eller arbors1. Den retino-tectal projektion av grodyngel av vatten groda Xenopus laevis är en kraftfull ryggradsdjur modell för att undersöka mekanismerna bakom Terminal Axon arborization och synaptisk anslutning2,3,4 . Individuell GFP uttrycker optiska axonala arbors med normal och förändrad molekylär signalering kan observeras direkt i intakt, levande Xenopus grodyngel5,6,7,8. För att uttrycka GFP ensam eller tillsammans med fullängds eller trunkerade versioner av gener i litet antal optiska neuroner, använder vi en teknik som involverar mikroinjektion/lipofektion av DNA i ögonknoppar av en dag gamla Xenopus embryon9, 10. denna teknik utvecklades ursprungligen för att studera mekanismer för optisk Axon pathfinding hos unga Xenopus grodyngel, och har sedan dess tillämpats av oss och andra för att bestämma cell-autonoma molekylära mekanismer bakom optisk Axon arborization i Xenopus grodyngel5,6,7,8,9,10.
Alternativa tekniker för att uttrycka exogena gener i ett litet antal optiska nervceller har utvecklats i andra modell arter, liksom i X. laevis. Emellertid, var och en av dessa metoder presenterar utmaningar och begränsningar jämfört med görs av DNA/lipofection reagens i ögonknoppar av Xenopus embryon. Hos möss, transgenes kan användas för att uttrycka gener i ett litet antal optiska nervceller, men generationen av transgena möss är kostsamt och tidskrävande och transgena möss ofta närvarande med oönskade biverkningar11. Transgena zebrafiskar som uttrycker exogena gener i optiska nervceller kan också skapas genom injicering av plasmider i de tidiga embryona till embryon12. Denna process kräver dock kloning av en specifik promotor för att uttrycka gener i ett mosaikmönster i optiska neuroner i zebrafiskar larver12. Frekvensen av uttryck av EXOGEN DNA i optiska neuroner i transgena zebrafiskar är också något lägre (< 30%) jämfört med Xenopus grodyngel som mikroinjicerades med DNA/liposomalt reagens (30 − 60%)12. I ovo elektroporation har också använts för att uttrycka gener i ett litet antal optiska nervceller i kycklingar13. Emellertid, detta förfarande har misslyckats med att helt karakterisera mekanismer som upprättar optiska projektioner eftersom optisk Axon arborization inte kan avbildas i intakt, levande chick embryon. Slutligen har flera laboratorier använt elektroporation för att transfect gener i ett litet antal optiska neuroner i Xenopus grodyngel14,15. Ändå kräver elektroporation optimering av utrustning och protokoll (stimulator, elektroder, rumsliga och temporala mönster av våg pulser) utöver det som används för görs av DNA/lipofection reagens i ögonknoppar av Xenopus embryon.
Vi och andra tidigare använt tekniken för mikroinjektion/lipofektion av DNA i ögonknoppar av Xenopus embryon för att bestämma cell autonoma signalering mekanismer som upprättar optisk Axon arborization5,6, 7 , 8. vi använde inledningsvis denna metod för att dissekera funktionerna hos cadherin och WNT adapter protein β-catenin i optisk axonal arborization i Xenopus grodyngel5,6. I en studie visade vi att β-cateninbindning till α-catenin och till PDZ krävs för att initiera och forma optiska axonala arbors in vivo5. I en andra rapport, vi visade att β-catenin bindnings domäner för α-catenin och GSK-3β motsatt modulera projektion mönster av ventrala optiska axonala arbors6. På senare tid har vi identifierat roller för WNT Factor, adenomatös poliposis coli (APC), för att reglera morfologiska egenskaper av optiska axonala arbors i Xenopus grodyngel7. Genom att co-uttrycka N-terminalen och centrala domäner APC som modulera β-catenin stabilitet och mikrotubuli organisation tillsammans med GFP i enskilda optiska neuroner, bestämde vi delade och distinkta roller för dessa APC interaktion domäner på filialnummer, längd och vinkel i optiska axonala arbors in vivo7. Ett annat laboratorium använde microinjection/lipofection teknik för att bestämma cell autonoma roller för signalering av BDNF-receptorn, TrkB, i optiska axonala arbors i Xenopus grodyngel8. Denna grupp visade att uttrycket av en dominerande-negativ TrkB oroad förgrening och synaptisk mognad i enskilda optiska Axon arbors in vivo8. Sammantaget har lipofection tekniken i Xenopus redan belyst de specifika rollerna av olika gener i optisk Axon förgrening i den inhemska miljön.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

Den primära visuella projektionen av grodyngel av vatten groda Xenopus laevis fungerar som ett utmärkt modellsystem för att studera mekanismer som reglerar utvecklingen av neuronala konnektivitet. Under etableringen av retino-tectal projektion, optiska axoner sträcker sig från ögat och navigera genom olika regioner i hjärnan för att nå sin målvävnad, den optiska tectum. När optiska axoner in i tectum, de utarbeta Terminal arbors som fungerar för att öka antalet synaptiska anslutningar de kan göra med mål interneuroner i tectum. Här beskriver vi en metod för att uttrycka DNA-kodning grönt fluorescerande protein (GFP), och vinst-och förlust av funktion gen konstruktioner, i optiska nervceller (retinala ganglionceller) i Xenopus embryon. Vi förklarar hur man microinjicera en kombinerad DNA/lipofektion reagens i ögonknoppar av en dag gamla embryon så att exogena gener uttrycks i enstaka eller ett litet antal optiska nervceller. Genom att tagga gener med GFP eller co-injicera med en GFP plasmid, Terminal axonal arbors av enskilda optiska neuroner med förändrad molekylär signalering kan avbildas direkt i hjärnan av intakt, levande Xenopus grodyngel flera dagar senare, och deras morfologi kan kvantifieras. Detta protokoll möjliggör bestämning av cell-autonoma molekylära mekanismer som ligger till grund för utvecklingen av optisk Axon arborization in vivo.

Det protokoll som beskrivs i denna artikel ger en framgång på 30 − 60% av injicerade Xenopus embryon uttrycker GFP (ensamt eller tillsammans med en ytterligare DNA-konstruktioner) i en till tio optiska axonala arbors. I figur 3visar vi representativa konfokala bilder av GFP som uttrycker kontroll och muterade optiska axonala arbors i intakta Xenopus grodyngel från vår nyligen publicerade studie7. För denna studie, vi klonade två domän mutant...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Detta protokoll syftar till att visa hur man microinjicera en DNA/DOTAP blandningen i ögonknoppar av en dag gamla Xenopus laevis embryon, och hur man avbildar och rekonstruera enskilda grön fluorescerande protein (GFP) uttrycker optiska axonala arbors i tectal midbrains av intakt, levande Xenopus grodyngel.

Mikroinjektion av DNA i Ögonknoppar i Xenopus laevis embryon och avbildning av GFP uttrycker optiska Axonala arbors i intakt, levande Xenopus grodyngel

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

I den här videon visar vi hur man uttrycker exogena DNA-konstruktioner i optiska nervceller och hur man bild enskilda GFP-uttrycker optik axonal bersåer i intakt, levande Xenopus laevis grodyngel. Detta är ett billigt, enkelt förfarande för transient cell-specifika transgenesis som möjliggör bestämning av cellen autonoma genen funktion i enskilda optik axonal bersåer, utvecklas i en levande ryggradsdjur modellsystem. Demonstrera förfarandet kommer att vara mig själv, Sophia Dao, forskningsassistent, och Dr.Tamira Elul, Lab principal investigator.Till att börja med försiktigt klipp spetsen på en pulled glass mikro kapillärpipett med fina tåtaningar. Fyll på bakfylla den micro kapillärpipett av glas med mineralolja med en mikrofil så att en liten droppe mineralolja visas vid den klippta spetsen av mikropipetten. Fyll glaset mikro kapillär pipetten halvvägs med mineralolja.I en injektor, mata ut kolven halvvägs och ladda den dragna mikrokaxen i kapillärpipett av dragglas i injektionshållaren. Förläng sedan kolven i full utsträckning för att bekräfta att mikrokakepipetten är starkt fäst vid injektorn och inte rör sig med förlängningen av kolven. Överför en tre mikroliter droppe av DNA / DOTAP blandningen på en en tum kvadratiskt ark paraffinpapper.Under en stereo dissekera mikroskop, flytta spetsen av glaset mikro kapillärpipett i DNA / DOTAP droppe. Använd fyllningsalternativet på injektionsapparaten, sug långsamt in DNA/DOTAP-droppen i glasmikrokepipetten. Gränsen mellan mineraloljan och DNA/DOTAP-lösningen syns i glasmikakillärpipetten på grund av DNA/DOTAP-lösningens lätt opacitet.Om det behövs, sluta fylla mikro kapillärpipett med jämna mellanrum för att låta trycket i glas mikro kapillär pipet att kalibrera. Först, i en 10 milliliter Petri skålen fylld med 0.1X MMR, manuellt de-vitellinize 10 steg 20 till 24 Xenopus embryon med fina tång. Ta tag i vitellinkuvertet i midjan för att undvika att skada embryona.Med tång i både experimentörens vänstra och högra hand, pop bubblan av vitelline kuvertet och släpp embryot från vitelline kuvertet. Var noga med att inte skada embryona när du tar bort vitelline-kuvertet. Använd sedan en plastöverföringspipett med en skuren spets för att överföra fem till 10 av vitelliniserade steg 22 till 24 embryon till en petriskål på 10 milliliter, fylld med 1X MMR.Under ett stereomikroskop, ta tag i ett av de av vitelliniserade embryon i petriskålen med tärnor och ordna embryot så att dess främre pol pekas upp i synfältet. Orientera sedan embryot så att det ligger i laterled och en av dess vänster till höger öga knoppar är vänd uppåt. Håll embryot med tången i experimentörens icke-dominerade hand och med experimentörens dominanta hand, introducerar spetsen på glasmikropipetten från ventrala eller dorsala sidan precis under epidermis i ögonknoppen.Injicera mellan 70 till 210 nanoliter av DNA/DOTAP-lösningen. Vänd sedan embryot runt och utför samma mikroinjektion i den andra ögonknoppen på embryots kontralaterala sida. Injicera båda ögonknopparna på sex till tio embryon i varje experiment.Efter mikroinjektion förvarar du embryon i en petriskål med 1X MMR i cirka 30 minuter för att underlätta sårläkning. Efter 30 minuter överför du de injicerade embryona med en plastöverföringspipett till en 0,1X MMR-lösning med 0,001%blekmedel fenylthiocarbamide för att minska pigmentering. Täck petriskålen med lock för att odla embryona i ungefär fem dagar tills embryona har utvecklats till grodyngel i etapperna 46 till 47.Detta protokoll ger en framgång på 30 till 60%av injicerade Xenopus embryon som uttrycker GFP i en till 10 optiska axonal arbors. Representativa confocal bilder av GFP visar den uttrycker kontroll och mutanta fiberoptiska axonal arbors i intakt Xenopus grodyngel. Två domän mutanter av APC, APCNTERM och APBbeta-cat klonades till pCS2 plasmider.Z-serien bilder av GFP kontroll och APC mutanta fiberoptiska axonal arbors rekonstruerades. Tomter av antal grenar, totalt arbor gren längd och medelvärde gren längd bekräfta observerade skillnader mellan kontroll och APC mutant uttrycker axonal arbors. Ytterligare scatter tomter antal filialer kontra medelvärde gren längd med regression linjer visar omvänd korrelation mellan dessa parametrar och optik axonal berors uttrycker APC domäner.Toppen på mikro kapillärpipett måste vara korrekt in i ögat knoppen så att den grå epidermis överliggande ögat knoppen sväller under varje mikro injektion. Detta förfarande kan användas för att både märka och ändra specifik genetisk funktion i optiska nervceller samtidigt bedöma den växande, inriktning, och förgrening av axoner från dessa optiska nervceller. Denna DNA-mikroinjektion och lipofectionteknik har gjort det möjligt för forskare inom utvecklingsneurobiologi att studera cellens autonoma molekylära mekanismer som reglerar optisk axonarvsorization i intakt, levande Xenopus laevis grodyngel.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulering och<em&gt; In Vitro</em&gt; Mognad av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocyter, följt av intracytoplasmatisk spermieinjektion, att studera embryonal utveckling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genomvid ögonblicksbild av kromatin tillsynsmyndigheter och stater i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryon från Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Använda Konfokal Analys av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Att undersöka modulatorer av Wnt och Shh Morfogen övertoningar

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik till Target mikroinjektion till utvecklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Njure

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerande kalciumavbildning och efterföljande in situ hybridisering för neuronal prekursor karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analys av transformerande tillväxtfaktor ß Familjeklyvningsprodukter utsöndras i Blastocoele av Xenopus laevis embryon

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Generering av näthinnedegeneration för att undersöka cellulära reparationsstrategier hos Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Författare i fokus: Utforska mekanismer för näthinneregenerering hos Xenopus-grodan 

Generering av modeller för näthinneskador hos Xenopus-grodyngel

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...