Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Biz araştırma desteklemek için Touro Üniversitesi California Osteopatik Tıp Koleji teşekkür ederiz. Bu mikroenjeksiyon tekniğinin laboratuarımızda uygulanmasına yardımcı olan laboratuvardaki (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) önceki öğrencileri kabul ediyoruz. Dr. Christine Holt'a minnettarız, bu DNA mikroenjeksiyon/lipofection tekniği ilk olarak Xenopus embriyolarında geliştirildi.

Burada açıklanan tüm yöntemler Touro University California Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (Protokol # TUCA003TE01X) tarafından onaylanmıştır.
1. X. laevis Embriyolarının Elde Edilmesi
<ol><li>İnsan koryonik gonadotropin (HCG) ile astarlanmış erkek ve dişi yetişkin kurbağa çiftlerinin doğal çiftleşme ile X. laevis embriyoları elde, hcg ile astarlanmış dişi yetişkin kurbağalardan dökülen yumurtaların in vitro döllenmesi veya...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

Bu makalede, tek veya az sayıda optik nöronda eksojen DNA yapılarının nasıl ifade edilebildiğini ve X kurbağasının yaşayan kurbağa yavrularında normal ve değiştirilmiş moleküler sinyallerle optik aksonal çardakları ifade eden gfp'nin nasıl görüntülenebileceğimizi gösteriyoruz. . laevis. Ayrıca, in vivo'da çekilen görüntülerden optik aksonal çardakları ifade eden GFP'nin morfolojisinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini ve ölçültebileceğimizi de açıklıyoruz. Az sayı...

Sinir sisteminin gelişimi sırasında, presinaptik nöronların aksonları hedef bölgelerine ulaşmak için beynin çeşitli bölgelerinde gezinmek. Aksonlar hedef dokularını istila ettiklerinde, postsinaptik hedef nöronlarla sinaptik bağlantılar kurarlar. Birçok nöron türünde aksonlar terminal dallarının veya çardakların ağlarını ayrıntılı bir şekilde detaylandırmak için yapabilecekleri sinaptik bağlantıların sayısını ve mekansal kapsamını arttırırlar1. Su kurbağası Xenopus laevis iribaşlarının retino-tectal projeksiyon terminal akson arborization ve sinaptik bağlantı2,3,4 altında yatan mekanizmaları incelemek için güçlü bir omurgalı modelidir . Normal ve değiştirilmiş moleküler sinyalile optik aksonal arbors ifade bireysel GFP bozulmamış doğrudan görülebilir, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları5,6,7,8. GFP'yi tek başına veya az sayıda optik nöronda genlerin tam uzunlukta veya kesilmiş versiyonlarıyla ifade etmek için, bir günlük Xenopus embriyolarının göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyon/lipofeksiyonunu içeren bir teknik kullanıyoruz9, 10- Bu teknik ilk olarak genç Xenopus kurbağalarında optik akson yol bulma mekanizmalarını incelemek için geliştirilmiştir ve o zamandan beri optik akson altında yatan hücre özerk moleküler mekanizmaları belirlemek için bize ve diğerleri tarafından uygulanmıştır Xenopus kurbağa yavruları nda ağaçlandırma5,6,7,8,9,10.
Optik nöronların az sayıda eksojen genleri ifade etmek için alternatif teknikler diğer model türler de geliştirilmiştir, yanı sıra X. laevis . Ancak, bu yaklaşımların her biri, Xenopus embriyolarının göz tomurcuklarında DNA/lipofection reaktifinin mikroenjeksiyonu ile karşılaştırıldığında zorluklar ve sınırlamalar sunmaktadır. Farelerde, transgenez optik nöronların az sayıda genleri ifade etmek için kullanılabilir, ancak transgenik farelerin üretimi pahalı ve zaman alıcı ve transgenik fareler genellikle istenmeyen yan etkileri ile mevcut11. Optik nöronlarda eksojen genleri ifade eden transgenik zebra balıkları da erken bölünme evre embriyolarına plazmid enjekte edilerek oluşturulabilir12. Ancak, bu süreç zebrabalığı larvaları optik nöronlarda bir mozaik desen genleri ifade etmek için belirli bir organizatörün klonlama gerektirir12. Transgenik zebra balıklarında optik nöronlarda ekzojen DNA ekspresyonu sıklığı da biraz daha düşüktür (<%30). DNA/lipozomal reaktif (%30−60) ile mikroenjekte edilen Xenopus kurbağa yavruları ile karşılaştırıldığında12. Ovo elektroporasyon da civciv optik nöronların az sayıda genleri ifade etmek için kullanılmıştır13. Ancak, optik akson arborization bozulmamış görüntülenemez, yaşayan civciv embriyolar çünkü bu prosedür optik projeksiyonlar kurmak mekanizmaları tam olarak karakterize etmek için başarısız oldu. Son olarak, birkaç laboratuvarxenopus kurbağa yavruları optik nöronlar az sayıda içine transfect genler için elektroporasyon kullandık14,15. Ancak, elektroporasyon ekipman ve protokollerin optimizasyonu gerektirir (uyarıcı, elektrotlar, dalga darbeleri mekansal ve zamansal desenler) ötesinde dna / lipofection reagent mikroenjeksiyon için kullanılan Xenopus embriyoların eyebuds içine.
Biz ve diğerleri daha önce optik aksonarborization5 kurmak hücre otonom sinyal mekanizmaları belirlemek için Xenopus embriyolarının eyebuds içine DNA mikroenjeksiyon / lipofection tekniği nikullandı5 ,6, 7.000 , 8- Biz başlangıçta Xenopus iribaşları optik aksonal arborization Cadherin ve Wnt adaptör protein β-catenin fonksiyonlarını incelemek için bu yaklaşımıkullandı5,6. Bir çalışmada, β-kateninα-catenin ve PDZ'ye bağlanmasının sırasıyla, in vivo5'teoptik aksonal arborların başlatılması ve şekillendirilmesi için gerekli olduğunu gösterdik. İkinci bir raporda, α-catenin ve GSK-3β için β-catenin bağlayıcı etki alanlarının ventral optik aksonal çarkların projeksiyon desenlerini zıt olarak modüle ettiğini gösterdik6. Daha yakın zamanda, Biz Wnt faktörü için roller tespit, adenomatöz polipozis coli (APC), Xenopus iribaşları optik aksonal arbors morfolojik özellikleri düzenleyen7. Β-catenin stabilitesini ve mikrotübül organizasyonunu bireysel optik nöronlarda GFP ile birlikte modüle eden APC'nin N-terminal ve merkezi etki alanlarını birlikte ifade ederek, şube numarası ndaki bu APC etkileşim etki alanları için ortak ve farklı roller belirledik, uzunluk ve in vivo7optik aksonal arbors açı . Başka bir laboratuvar, Xenopus iribaşları optik aksonal arbors bdnf reseptörü, TrkB, tarafından sinyal için hücre otonom rolleri belirlemek için mikroenjeksiyon / lipofection tekniği kullanılır8. Bu grup, vivo8yılında bireysel optik akson arbors bir baskın-negatif TrkB tedirgin dallanma ve sinaptik olgunlaşma ifade gösterdi. Genel olarak, Xenopus lipofection tekniği zaten yerli ortamda optik akson dallanma farklı genlerin belirli rolleri aydınlatılmış vardır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

Su kurbağası Xenopus laevis iribaşlarının birincil görsel projeksiyonnöronal bağlanabilirlik gelişimini düzenleyen mekanizmaları incelemek için mükemmel bir model sistemi olarak hizmet vermektedir. Retino-tectal projeksiyonun kurulması sırasında optik aksonların gözden uzaması ve beynin farklı bölgelerinde niçin hedef dokuya, optik tektuma ulaşmasına yol açar. Optik aksonlar tektuma girdikten sonra, tektumdaki hedef internöronlarla yapabilecekleri sinaptik bağlantı sayısını artırmak için işlev gören terminal çardaklarını ayrıntıya sokarlar. Burada, Xenopus embriyolarında optik nöronlarda (retinal ganglion hücreleri) yeşil floresan protein (GFP) kodlayan DNA'yı ve fonksiyon kaybı ve kazanç ve fonksiyon kaybı gen yapılarını ifade etmek için bir yöntem tanımlıyoruz. Bir günlük embriyoların göz tomurcuklarına birleştirilmiş dna/lipofection reaktifinin nasıl mikro enjekte edileceğini açıklarız, bu şekilde eksojen genler tek veya az sayıda optik nöronla ifade edilir. GFP ile genleri etiketleme veya gfp plazmid ile birlikte enjekte ederek, değiştirilmiş moleküler sinyalile bireysel optik nöronların terminal aksonal arbors bozulmamış beyinlerde doğrudan görüntülenebilir, birkaç gün sonra yaşayan Xenopus iribaşlar, ve morfolojisi ölçülebilir. Bu protokol, in vivo optik akson arborization gelişiminin altında yatan hücre otonom moleküler mekanizmaların belirlenmesiiçin izin verir.

Bu makalede açıklanan protokol, enjekte edilen Xenopus embriyolarının %30−60'ının gfp'yi (tek başına veya ek bir DNA yapısıyla birlikte) bir ila on optik aksonal arbor'da ifade eden bir başarı oranı sağlar. Şekil3'te, gfp'nin temsili konfokal görüntülerini gösteriyoruz ve yakın zamanda yayınlanançalışmamızdansağlam Xenopus kurbağalarında kontrol ve mutant optik aksonal çardakları ifade ediyoruz 7 . Bu çalışma için,...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Bu videoda, optik nöronlarda eksojen DNA yapılarının nasıl ifade edilebildiğini ve gfp ifade eden optik aksonal çardakların sağlam, yaşayan Xenopus laevis kurbağa yavrularında nasıl görüntüleneceğini gösteriyoruz. Bu, yaşayan bir omurgalı model sisteminde gelişen, bireysel optik aksonal çardaklarda hücre özerk gen fonksiyonunun belirlenmesine olanak sağlayan geçici hücreye özgü transgenez için ucuz ve basit bir prosedürdür. Prosedürü gösteren ben, Sophia Dao, Araştırma Görevlisi ve Dr Tamira Elul, Laboratuvar Baş Müfettiş i olacak.Başlamak için, hafifçe ince forceps ile çekilen cam mikro kılcal pipet ucu klip. Cam mikro kılcal pipeti mineral yağ ile microfil kullanarak, mikro pipetin kırpılmış ucunda küçük bir damla mineral yağ belirir şekilde doldurun. Cam mikro kılcal pipeti yarı yolda mineral yağ ile doldurun.Bir enjektörde, pistonu yarıya doğru fırlatın ve çekilen cam mikro kılcal pipeti enjeksiyon tutucuya yükleyin. Daha sonra mikro kılcal pipetin enjektöre güçlü bir şekilde bağlı olduğunu ve pistonun uzantısı ile hareket etmediğini doğrulamak için pistonu tam ölçüde genişletin. DNA/DOTAP karışımının üç mikrolitrelik damlasını bir inç karelik bir kağıt parçasına aktarın.Stereo diseksiyon mikroskobu altında, cam mikro kılcal pipetin ucunu DNA/DOTAP damlasına taşıyın. Enjeksiyon aparatı üzerindeki dolgu seçeneğini kullanın, DNA/DOTAP damlasını cam mikro kılcal pipete yavaşça emerek. Mineral yağ ile DNA/DOTAP çözeltisi arasındaki sınır, DNA/DOTAP çözeltisinin hafif opaklığı nedeniyle cam mikro kılcal pipette görülebilir.Gerekirse, cam mikro kılcal pipetbasıncının yeniden ayarlanabilmesi için mikro kılcal pipetin düzenli olarak doldurulmasını bekleyin. İlk olarak, 0.1X MMR ile dolu 10 mililitrelik Petri kabında, 10 etap 20-24 Xenopus embriyolarını ince çiflips ile elle de-vitellinize. Embriyoların yaralanmasını önlemek için beldeki vitellinzarfı kavrayın.Deneycinin sol ve sağ elindeki forsepslerle vitellin zarfının balonunu patlatın ve embriyoyu vitellin zarfından serbest bırakın. Vitellin zarfını çıkarırken embriyoları yaralamamaya dikkat edin. Daha sonra 1X MMR ile dolu 10 mililitre Petri kabına beş ila 10 de-vitellinized sahne 22-24 embriyolar aktarmak için bir kesme ucu ile plastik bir transfer pipet kullanın.Stereo mikroskop altında, Petri kabındaki vitellinize edilmiş embriyolardan birini forceps ile tutun ve embriyoyu ön kutbunun görüş alanına doğru işaret edin şekilde düzenleyin. Daha sonra embriyoyu yanal bir şekilde yatacak şekilde yönlendirin ve soldan sağa doğru tomurcuklarından biri yukarı bakacak şekilde. Embriyoyu deneycinin baskın olmayan elindeki forsepslerle ve deneycinin baskın eliyle tutun, cam mikro pipetin ucunu ventral veya dorsal taraftan epidermisin hemen altından göz tomurcunun içine tanıtı.DNA/DOTAP çözeltisinin 70 ila 210 nanolitresini enjekte edin. Sonra embriyo etrafında çevirmek ve embriyonun kontralateral tarafında diğer göz tomurcuk içine aynı mikro enjeksiyon gerçekleştirmek. Her deneyde altı ila 10 embriyonun her iki göz tomurcuklarını enjekte edin.Mikro enjeksiyondan sonra, yara iyileşmesini kolaylaştırmak için embriyoları 1X MMR ile yaklaşık 30 dakika boyunca Petri kabında saklayın. 30 dakika sonra, pigmentasyonu azaltmak için enjekte edilen embriyoları plastik transfer pipeti ile %0,001 beyazlatma maddesi fenilitokarbamid ile 0,1X MMR çözeltisine aktarın. Petri kabını, embriyolar 46-47 evrelerinde iribaş haline gelene kadar yaklaşık beş gün boyunca embriyoları kültüre bir kapakla kapatın.Bu protokol, 1 ila 10 optik aksonal arbors GFP ifade enjekte Xenopus embriyoların% 30-60 bir başarı oranı verir. GFP'nin temsili konfokal görüntüleri, sağlam Xenopus kurbağa yavrularındaki ekspres kontrolü ve mutant optik aksonal çardakları göstermektedir. APC, APCNTERM ve APBbeta-cat'in iki etki alanı mutantı pCS2 plazmidlerine klonlandı.GFP kontrolü ve APC mutant optik aksonal arbors Z-serisi görüntüleri yeniden inşa edildi. Şube sayısı, toplam ağaç dalı uzunluğu ve ortalama dal uzunluğu çizimleri kontrol ve Aksonal arbors ifade APC mutant arasındaki gözlenen farklılıkları onaylamak. Regresyon çizgileri ile şube sayısı ve ortalama dal uzunluğu ek dağılım çizimleri bu parametreler ve APC etki alanlarını ifade optik aksonal arbors arasında ters korelasyon göstermektedir.Mikro kılcal pipetin ucu, her mikro enjeksiyon sırasında göz tomurcuklarını örten gri epidermisin şişmesi için göz tonuna çok yüzeysel olarak yerleştirilmelidir. Bu prosedür, bu optik nöronlardan aksonların büyümesini, hedeflemesini ve dallanmalarını değerlendirirken optik nöronlarda spesifik genetik fonksiyonu etiketlemek ve değiştirmek için kullanılabilir. Bu DNA mikro enjeksiyon ve lipofection tekniği gelişimsel nörobiyoloji araştırmacılar bozulmamış optik akson arborization düzenleyen hücre özerk moleküler mekanizmaları çalışma için izin verdi, yaşayan Xenopus laevis kurbağa yavruları.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Gelişim Biyolojisi

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Xenopus laevis Embriyolarının Blastocoele'sine Salgılanan Dönüşüm Faktörü ß Aile Bölünmesi Ürünlerinin Analizi

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Xenopus'ta Hücresel Onarım Stratejilerini Araştırmak için Retina Dejenerasyonu Oluşturma

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Yazar Spotlight: Xenopus Kurbağasında Retinal Yenilenme Mekanizmalarını Keşfetmek 

Xenopus Kurbağa Yavrularında Retina Yaralanma Modellerinin Oluşturulması

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...