Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل RO1HL135846 ومنحة معهد تنمية الطفل (PD-II-2016-529).

تمت الموافقة على البروتوكول الموضح هنا من قبل جامعة واشنطن في سانت لويس العناية بالحيوان واستخدامها لجنة (IACUC).
1. الماوس الإسكان والتصميم التجريبي
<ol><li>للكشف عن الإيقاعات اليومية في دوران البروتين، الفئران المنزلية (الذكور أو الإناث C57BL/6J، 4−8 الأسبوع من العمر، 20-25 غرام) تحت...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

يصف بروتوكولنا وسيلة مباشرة من الناحية الفنية لقياس الإيقاعات البيولوجية في دوران البروتين في الفئران باستخدام معدات البيولوجيا الجزيئية المتاحة عادة. بسبب طول تجارب السلاسل الزمنية وعدد العينات البيولوجية المعنية، من المهم أن تكون متسقة عبر التجربة بأكملها فيما يتعلق بكيفية حقن الفئ?...

تشير إيقاعات Circadian إلى الاختلافات اليومية التي يمكن التنبؤ بها في الوظيفة البيولوجية التي تظهر في جميع أنحاء الطبيعة. وهي موجودة في كل مقياس بيولوجي، من السلوكيات العيانية مثل دورات النوم والاستيقاظ، إلى الظواهر الجزيئية مثل الوفرة الإيقاعية للجزيئات الحيوية. في السنوات الأخيرة، تم تحويل البحوث في إيقاعات circadian من خلال اكتشاف "الجينات على مدار الساعة" التي هي حاسمة لتوليد إيقاع circadian. وقد كشفت الدراسات في الفئران الجينات على مدار الساعة خروج المغلوب دورا مركزيا لإيقاعات circadian في تنظيم العمليات الخلوية الأساسية زمنيا مثل التمثيل الغذائي1. من بين الطرق إيقاعات circadian جعل هذا يحدث عن طريق نقل بنية زمنية لتقويض البروتين.
وقد أظهرت عدة مجموعات بما في ذلك بلدنا أن اثنين من السبل الرئيسية لتقويض البروتين الخلوي، autophagy ونظام ubiquitin-بروتياسوم، تخضع لإيقاعات اليومية2،3،4،5. يمثل Autophagy الذراع تعتمد على اللعيب من تقويض البروتين الذي يتم تسليم البروتينات ذات الأهمية إلى هذا organelle المهينة إما من خلال بناء حويصلة جديدة (macroautophagy) أو من خلال نقل مباشرة على الرغم من قناة (chaperone بوساطة autophagy)6. نظام ubiquitin-proteasome هو المسار الرئيسي غير الليسوسوم، حيث البروتينات هي بولي في كل مكان ومن ثم تغذية في بروتياسوم، وهو آلة مهينة الجزيئية الكلية وجدت في جميع أنحاء السيتوبلازم والنواة7،8. الإيقاعات في النشاط الذاتي وproteasomal مهمة لأنها من المرجح أن تلعب دورا في التدبير المنزلي الخلوية. ونتيجة لذلك، فمن المفيد أن يكون لديك إجراء موحد يمكن الكشف عن التذبذبات اليومية في تقويض البروتين الذي يتوافق مع نماذج الأمراض ما قبل السريرية.
هنا، ونحن نقدم بروتوكولنا لتحديد كمية الاختلافات اليومية في تدفق autophagic في كبد الماوس، والتي كانت بمثابة أساس للعمل في مختبرنا3،9. وتصنف طريقتنا على أنها "قياس دوران"10، وهو نهج تستخدمه العديد من المجموعات لقياس النشاط البروتيوليتيك (أو تدفق). في هذا النهج، يتم إعطاء مثبطات البروتياز الخاصة بالليسوسوم أو بروتياسومس للفئران ومن ثم يتم الحصول على عينات الأنسجة بعد فترة زمنية محددة. وفي موازاة ذلك، يتم الحصول على عينات من الأنسجة من الفئران التي تتعرض لحقن الشام. عينات الأنسجة متجانسة ومن ثم فصل كيميائيا بيولوجيا للحصول على الكسور الليسوم المخصب والسيتوبلازمية. ثم يتم تحليل هذه الكسور بالتوازي عبر النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بعلامات الماكرووتفاجي (LC3b و p62) أو ركائز بروتياسومال (بروتين متعدد الكل شيء). مع مرور الوقت، الحيوانات التي يتم حقنها بمثبطات البروتياز تتراكم البروتينات التي عادة ما يتم إعادة تدويرها. ونتيجة لذلك، يتم الاستدلال على معدل دوران عن طريق مقارنة وفرة البروتينات علامة في العينات المعالجة مثبطات البروتياز إلى العينات المعالجة بالشام. من خلال تكرار هذه الطريقة في فترات زمنية محددة عبر اليوم فمن الممكن لإعادة بناء الاختلافات circadian في proteolysis(الشكل 1A).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

تستخدم الخلايا عدة طرق لإعادة تدوير البروتينات غير المرغوب فيها وغيرها من المواد، بما في ذلك مسارات الليسوسومال وغير الليسوسومال. ويسمى المسار الرئيسي تعتمد على الليسوسوم autophagy، في حين أن الطريقة الأولية غير الليسوسومل لتقويض البروتين هو نظام فيوكويتين بروتياسوم. وتشير الدراسات الحديثة في الكائنات الحية النموذجية إلى أن نشاط كل من الأوتوفاجي ونظام يوبيكويتين بروتياسوم ليس ثابتاً طوال اليوم ولكنه يختلف بدلاً من ذلك وفقاً لإيقاع يومي (سيركاديان). القدرة على قياس الإيقاعات البيولوجية في دوران البروتين مهم لفهم كيفية تحقيق مراقبة الجودة الخلوية ولفهم ديناميات بروتينات محددة ذات أهمية. هنا نقدم بروتوكول موحد لتحديد كمية التدفق الذاتي والبروتياسومال في الجسم الحي الذي يلتقط المكون circadian من دوران البروتين. يتضمن بروتوكولنا تفاصيل لمناولة الماوس، ومعالجة الأنسجة، والكسر، والقياس الكمي للتدفق التلقائي باستخدام كبد الماوس كمادة البداية.

وترد البيانات التمثيلية في الشكل 2ألف باء،ويرد التحديد الكمي لهذه البيانات في الشكل 2جيم(د) (انظر أيضاً الملف التكميلي "بيانات العينة"). للبساطة، لم نصور عناصر تحكم التحميل في الشكل 2 ولكن يجب الحصول عليها بالتوازي...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux at JoVE.com

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

نحن نصف بروتوكولنا لقياس الإيقاعات البيولوجية في تقويض البروتين عن طريق autophagy وبروتياسوم في كبد الماوس.

قياس الإيقاعات اليومية في التدفق التلقائي والبروتياسومال

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

بروتوكولنا يسمح بقياس معدل نشاط الأوتوفاجي والبروتيسوم في أنسجة الماوس وحساسة بما يكفي للكشف عن الاختلافات circadian داخل هذه الأنشطة. يمكن استخدام هذه التقنية في الجسم الحي لتقييم تقويض البروتين في الخلايا والأنسجة والمواد المطلوبة هي منخفضة التقنية نسبيا ويمكن الوصول إليها من قبل أي مختبر البيولوجيا الجزيئية. (سيُظهر الإجراء أن (ميخائيل Ryzhikov ، بعد الدكتوراه من مختبريلمدة خمسة عشر دقيقة قبل كل نقطة زمنية، وسخّن حلول الأسهم leupeptin وbortezomib لدرجة حرارة الغرفة وتمييع بورتزوميب المذاب في PBS العقيمة لتسفر عن 50 ملليغرام في حل العمل المليلتر. بالنسبة لإدارة مثبطات البروتياز، يحقن داخل الصفاق 40 ملليغرام لكل كيلوغرام من الليبوبيتين أو 1.6 ميكروغرام لكل كيلوغرام من البورتيزميب في كل تجريبي. للسيطرة السلبية، حقن الفئران مع 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.عودة كل ماوس إلى أقفاص مجمعة حسب نوع العلاج الواردة كما يتم حقنها وتسجيل الوقت الذي يتم التعامل مع الفئران أو التلاعب بها في جدول موحد. بعد ساعتين من الحقن، غمر فص الكبد الأيسر الذي يتم حصاده من كل تجريبي تم التضحية به في سبعة ملليلترات من عازل التجانس البارد في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر على الجليد. عندما تم الحصول على جميع العينات، نقل العينة الأولى وكامل حجم التخزين المؤقت التجانس في 15 ملليلتر قدرة التجانس Dounce والتجانس العينة مع 10 السكتات الدماغية من المكبس فضفاضة و 15 السكتات الدماغية من المكبس ضيق.العودة تجانس الخام الناتجة إلى أنبوب الأصلي والتجانس العينة التالية كما أظهرت للتو. عندما تم تجانس جميع العينات، رواسب النوى المتجانسة والحطام عن طريق الطرد المركزي ونقل المليلترات الأربعة العليا من كل عظمى بعد النووية إلى أنابيب جديدة 15 ملليلتر. تحديد تركيز البروتين من هذا الكسر فوق الأولية وفقا للبروتوكولات القياسية ومعادلة تركيزات جميع العينات إلى 2.1 ملليغرام لكل ملليلتر مع العازلة التجانس الطازجة حسب الضرورة.لتحليل المصب وتحسين الجودة، aliquot 500 ميكرولترات من الكسور البروتينية الإجمالية تطبيع في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. نقل 1.5 ملليلتر من كل من الكسور البروتينية الإجمالية المتبقية في أنابيب الطرد المجهري الفردية و بيليه عينات البروتين عن طريق الطرد المركزي. نقل ملليلتر واحد من عظمى الكسور الثانية الناتجة إلى أنابيب جديدة microcentrifuge على الجليد وpireate المتبقون من المواد الفوقية.غسل الكريات 3K مرتين في 1.5 ملليلتر من عازلة التجانس الباردة الطازجة في غسل، ثم resuspend بيليه 3K في 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت عينة SDS-PAGE وغلي العينات في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تدور الكسور الثانية supernatants لمدة 20 دقيقة في 20، 000 × ز وأربع درجات مئوية ونقل الكسور السيتوبلازمية الثالثة الناتجة عن ذلك إلى أنبوب جديد microcentrifuge. لتحليل SDS-PAGE، والجمع بين 150 ميكرولترات من الكسر السيتوبلازمي مع 50 ميكرولترات من 4x SDS-PAGE عينة العازلة وغلي عينات الكسر السيتوبلازمي في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.التعرق المتبقية من الكريات 20K وغسل العينات مرتين مع 1.5 ملليلتر من عازلة التجانس الباردة الطازجة في غسل. ثم إعادة تعليق بيليه 20K في 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت عينة SDS-PAGE للغليان في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لتحليل البقعة الغربية، وتخفيف تسلسلي بروتينات منحنى القياسية واحد إلى ثلاثة في 1x عينة العازلة لما مجموعه ستة المخففات وتحميل 10 ميكرولترات من كل عينة منحنى القياسية في بئر واحد من 26 جيدا أربعة إلى 12٪ SDS-PAGE ميدي هلام، ثم تحميل معيار الوزن الجزيئي التجاري الملطخة.لقياس التدفق الذاتي، قم بتحميل 12 ميكرولترات من كل عينة بيليه 3K في الآبار المناسبة. لقياس تدفق البروتيسوم، قم بتحميل 12 ميكرولترات من كل كسر سيتوبلازميك في الآبار المناسبة. عندما تم تحميل جميع العينات التحكم والتجريبية، وفصل عينات البروتين من قبل SDS-PAGE قبل نقل البروتينات إلى أغشية فلوريد بوليفينيدين وفقا للبروتوكولات القياسية.لتحليل تدفق macroautophagic، أغشية لطخة تحتوي على عينات بيليه 3K مع الأجسام المضادة المضادة p62 أو LcB بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. لتحليل تدفق البروتيسوم، أغشية لطخة تحتوي على عينات الكسر السيتوبلازمي مع المضادة للليسين 48-محددة بولي أوبيكيتين الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. ثم صورة البقع الغربية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية القياسية وأجهزة التصوير.لإجراء قياسات كثافة على النطاقات ذات الأهمية لكل من المنحنى القياسي والعينات التجريبية، افتح برنامج تحليل الصور المناسب وارسم مستطيلًا طويلًا يشمل مونومر البروتين من الفائدة في الجزء السفلي من الصورة التي تمتد إلى أعلى الغشاء. نسخ ولصق لنقل المستطيل إلى العينات المتبقية، مع الحفاظ على المستطيل متناسقة بين العينات. حفظ القياس الكمي إلى جدول بيانات وإنشاء منحنى قياسي كثافة داخل جدول البيانات باستخدام عينة قياسية مخففة تسلسليا في الانحدار خطية أو متعددة الحدود للحصول على أفضل معادلة منحنى قياسي.باستخدام هذه المعادلة، استقراء كمية مونومرات الفائدة داخل العينات التجريبية. للحصول على قياسات تدفق، طرح كمية البروتين استقراء كل عينة المعالجة المانع من متوسط قيمة العينات برنامج تلفزيوني من نفس النقطة الزمنية. ثم تقييم الأهمية الإحصائية للتغير الزمني في دوران البروتين باستخدام ANOVA في اتجاه واحد.القراءة الأولية لتدفق autophagic في أي نقطة زمنية معينة هو الفرق في كمية علامات محددة macroautophagy بين leupeptin المعالجة مقابل عينات صورية في 3K lysosome المخصب 3K كسور بيليه مقسومة على اثنين. عادةً ما يتم تطبيع النتائج إلى الوسط الذي يبسط المقارنة عبر التجارب المستقلة. يعتمد إجراءنا لقياس التدفق البروتيالي على قدرة ليوبيتين أو بورتيزميب على التسبب في تراكم ركائز autophagy وproteasome ، وهي عملية تعتمد على الوقت.وقد سمحت هذه التقنية استكشاف كيفية الإيقاعات البيولوجية برنامج هدم بروتين الكبد. ونأمل أن يمهد الطريق للتحقيق في آثار المرض على وظائف التدبير المنزلي الخلوي.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

النظائر مستقرة من التنميط التمويه الاستقلابية المتوسطة في مرحلة تطوير والكبار انواع معينة ايليجانس</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

قياس الكالسيوم السريع في تدفقاتها العضلية

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

رصد الخلية التي تتمتع بحكم ذاتي إيقاعات الساعة اليومية في التعبير الجيني باستخدام مراسلون ضوء بارد وسيفيراز

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

يعاير Proteasomal تدهور في نظام خالية من الخلايا في النباتات

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

تقييم التمويه الذاتي عن طريق قياس LC3، p62، و LAMP1 المشاركة في التعريب باستخدام قياس التدفق المتعدد الأطياف الخلوي

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

مقايسة تنحية نازعة لاكتات — طريقة بسيطة وموثوق بها لتحديد النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...