Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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这项工作由RO1HL135846和儿童发展研究所赠款（PD-II-2016-529）资助。

这里描述的协议得到了华盛顿大学圣路易斯动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 鼠标外壳和实验设计
<ol><li>为了检测蛋白质周转量的日常节律，家鼠（雄性或雌性C57BL/6J，4~8周大，20~25克）在标准12小时明/暗周期下，提供食物。为了避免给动物造成压力，在使用前在设施中让小鼠适应至少一周，并避免使用单体。为了证明蛋白质代谢的节律是真正的昼夜（即由动...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

我们的协议描述了一种技术上简单的方法，使用常用的分子生物学设备测量小鼠蛋白质周转中的生物节律。由于时间序列实验的长度和所涉及的生物样本数量，因此在整个实验中，在小鼠的注射方式、组织采集的时间和生化处理方面保持一致非常重要。样品。注射、安乐死和宫颈脱位步骤可能需要操作员在开始全面实验之前进行练习。由于不同的个体以不同的速度解剖，因此最好由单个操作员进?...

昼夜节律是指生物功能中每天可预测的变化，这种变化在自然界中是明显的。它们存在于各种生物尺度上，从睡眠-觉醒周期等宏观行为，到生物分子的有节奏丰度等分子现象。近年来，对昼夜节律的研究已经因"时钟基因"的发现而改变，这些"时钟基因"对昼夜节律生成至关重要。对时钟基因敲除小鼠的研究表明，昼夜节律在时间组织核心细胞过程（如代谢1）中起着核心作用。昼夜节律使这一点发生的方式之一是赋予蛋白质代谢一个时间结构。
包括我们的几个组已经表明，细胞蛋白代谢、自噬和泛性蛋白-蛋白酶系统的两个主要途径，受日节律2，3，4，5。自噬代表蛋白质代谢的感其中体依赖性手臂，其中感兴趣的蛋白质通过构建新型囊泡（大自噬）或通过直接易位通过通道（卡佩罗内介自噬）6.泛性蛋白-蛋白酶体系统是主要的非脂生通路，其中蛋白质是多聚体，然后送入蛋白酶体，这是在整个细胞质和细胞核7、8中发现的大分子降解机。自噬和蛋白酶活动的节奏很重要，因为它们可能在细胞内务管理中发挥作用。因此，有一个标准化的程序，可以检测与临床前疾病模型兼容的蛋白质代谢的每日振荡是有价值的。
在这里，我们提供我们的协议，以量化小鼠肝脏中自噬性通量的日变化，这已成为我们实验室3、9工作的基础。我们的方法被归类为"周转测定"10，这是许多组用来测量蛋白解酶活性（或通量）的方法。在这种方法中，对小鼠施用特定于其体或蛋白酶体的蛋白酶抑制剂，然后在固定的时间间隔后获得组织样本。同时，组织样本从接受假注射的小鼠身上获得。组织样本均质化，然后进行生化分离，以获得体素富集和细胞质分。然后，使用特定于大自噬标记物（LC3b 和 p62）或蛋白酶基质（多聚体蛋白）的抗体，通过西方印迹对这些馏分进行并行分析。随着时间的推移，注射蛋白酶抑制剂的动物会积累通常被回收的蛋白质。因此，通过比较蛋白酶抑制剂处理样品中的标记蛋白的丰度与假处理的样品，可以推断出周转率。通过在一天的固定时间间隔重复此方法，可以重建蛋白解中的昼夜变化（图1A）。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

细胞采用多种方法来回收不需要的蛋白质和其他材料，包括脂质体和非脂质体通路。主要的脂质体依赖途径称为自噬，而蛋白质代谢的主要非脂质酶体方法是泛基蛋白-蛋白酶体系统。最近对模型生物体的研究表明，自噬和泛性蛋白酶体的活性在一天中不是恒定的，而是根据每日（循环）节律而变化的。测量蛋白质周转中生物节律的能力对于了解细胞质量控制是如何实现的以及了解特定感兴趣的蛋白质的动态非常重要。在这里，我们提出了一个标准化的协议，用于量化体内的自噬和蛋白酶体通量，捕获蛋白质周转的昼夜分量。我们的协议包括小鼠处理、组织处理、分馏和以小鼠肝脏为起始材料的自噬性通量定量的详细信息。

具有代表性的数据如图2A，B所示，这些数据的量化在图2C，D中提供（另见补充文件"样本数据"）。 为简单起见，我们未在图 2中描述加载控件，但应并行获取这些控件。通常，针对β-actin的西方印迹用于此目的，但总蛋白染色（如庞梭S）就足够了。在任何特定时间点，自噬通量的主要读出是?...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

我们描述了我们通过自噬和小鼠肝脏蛋白体体来测量蛋白质代谢的生物节律的规程。

测量自噬和前列腺通量中的日节律

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

我们的协议允许测量小鼠组织中自噬和蛋白酶活性的速率，并且足够灵敏，可以检测这些活动中的昼夜变化。该技术可用于体内评估细胞和组织中的蛋白质代谢，所需的材料相对较低，可供任何分子生物学实验室使用。演示这个程序的将是米哈伊尔·雷日科夫，一个来自我实验室的博士后。在每个时间点前十五分钟，将利普蛋白和波特佐米布库存溶液加热至室温，并稀释无菌 PBS 中解冻的 bortezomib，以产生每毫升 50 毫克的工作溶液。对于蛋白酶抑制剂给药，内向每千克利普蛋白注射40毫克或每公斤1.6微克每克的玻色素。对于负对照，给小鼠注射0.5毫升PBS。将每只小鼠返回到按注射时接受的治疗类型分组的笼子，并记录小鼠在标准化表中接受治疗或操作的时间。注射两小时后，将从每个牺牲的实验动物中采集的左肝叶淹没在7毫升的冰冷均质缓冲液中，在冰上适当标记15毫升锥形管中。获得所有样品后，将第一个样品和整个均质缓冲液体积转移到 15 毫升容量的 Dounce 均质器中，并用 10 个松散活塞冲程和 15 个紧活塞冲程使样品均质化。将由此产生的粗质均质返回到其原始管中，并像刚刚证明的一样使下一个样品均质化。当所有样品均质化后，通过离心沉淀同质核和碎屑，将每个后核上更远分的四毫升转移到新的15毫升管中。根据标准协议确定第一个上清液分数的蛋白质浓度，并必要时用新鲜均质缓冲液将所有样品的浓度均衡到每毫升2.1毫克。为进行下游分析和质量改进，将500微升的正态总蛋白质馏分放入1.5毫升微离心管中，用于零下80摄氏度的储存。将每一个剩余总蛋白质分数的1.5毫升转移到单独的微离心管中，通过离心对蛋白质样品进行颗粒化。将产生的第二分数超盐的一毫升转移到冰上新的微离心管中，并吸气剩余的超自然。每次洗涤时，将 3K 颗粒在 1.5 毫升新鲜冷均质缓冲液中洗涤两次，然后在 200 微升 SDS-PAGE 样品缓冲液中重新将 3K 颗粒重新暂停，并在 95 摄氏度下将样品煮沸 5 分钟。在20，000 x g和4摄氏度下旋转第二部分超自然剂20分钟，将由此产生的第三个细胞质部分超自然物转移到一个新的微离心管中。对于 SDS-PAGE 分析，将 150 微升的细胞质分数与 50 微升的 4x SDS-PAGE 样品缓冲液混合，在 95 摄氏度下将细胞质分数样本煮沸 5 分钟。从 20K 颗粒中吸出剩余的上清液，每次洗涤用 1.5 毫升新鲜冷均质缓冲液洗涤样品两次。然后在 100 微升 SDS-PAGE 样品缓冲液中重新填充 20K 颗粒，在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟。对于西方印迹分析，连续稀释标准曲线蛋白一至三成 1x 样品缓冲液，共稀释 6 个样品，并加载每个标准曲线样品的 10 微升到 26 井中的一个井中 4 至 12%SDS-PAGE midi 凝胶，然后加载预装商业分子量标准。要测量自噬通量，将每个 3K 颗粒样品的 12 微升装入相应的孔中。为了测量蛋白酶通量，将每个细胞质分数的12微升加载到适当的井中。当所有控制和实验样品都加载后，通过SDS-PAGE分离蛋白质样本，然后根据标准协议将蛋白质转移到聚乙烯氟化物膜上。用于分析巨体通量，在四摄氏度下，在四摄氏度下，含有具有抗p62或抗LcB抗体的3K颗粒样品的印迹膜。用于分析蛋白酶通量，含有细胞质分数样本的印版膜，具有抗莱辛48特异性多泛素抗体，在4摄氏度过夜。然后使用标准的二次抗体和成像设备对西方印迹进行成像。要对标准曲线和实验样本的感兴趣波段执行密度测量，请打开适当的图像分析软件程序，并绘制一个长矩形，包括延伸至膜顶部的印迹图像底部的蛋白质单体。复制并粘贴以将矩形移动到其余样本，使矩形在样本之间保持一致。将量化保存到电子表格中，并使用线性或多项式回归中的序列稀释标准样本在电子表格中生成密度测量标准曲线，以获得最佳拟合标准曲线方程。使用此方程，推断实验样本中感兴趣的单体的数量。为了获得通量测量，请从同一时间点的PBS样品的平均值中减去每个抑制剂处理样品的外推蛋白质量。然后使用双向 ANOVA 评估蛋白质周转时变化的统计显著性。在任何给定时间点，自噬通量的主要读出是所处理的利普汀与富含 3K 颗粒分数的假样本之间巨细胞特异性标记量的差异除以 2。通常，结果被规范化为均值，从而简化了独立实验之间的比较。我们测量蛋白解通量的程序取决于利普蛋白或波特佐米布导致自噬和蛋白酶基质的积累的能力，这是一个时间依赖的过程。这项技术允许探索生物节律如何编程肝蛋白代谢。我们希望这将为调查疾病对细胞内务功能的影响铺平道路。

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