Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af RO1HL135846 og et tilskud til børns udviklingsinstitut (PD-II-2016-529).

Den protokol, der er beskrevet her, blev godkendt af Washington University i St. Louis Animal Care og use Committee (IACUC).
1. mus boliger og eksperimentel design
<ol><li>For at opdage daglige rytmer i proteinomsætningen, House mus (mandlig eller kvindelig C57BL/6J, 4 − 8 uge gammel, 20 − 25 g) under standard 12 h lys/mørke cyklusser med mad forudsat ad libitum. For at undgå at stressere dyrene, akklistre mus i mindst en uge i anlægget før brug og undgå enkelt hus. For at...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

Vores protokol beskriver en teknisk ligetil måde at måle biologiske rytmer i proteinomsætningen i mus ved hjælp af almindeligt tilgængelige molekylær biologi udstyr. På grund af varigheden af tidsserie eksperimenter og antallet af involverede biologiske prøver er det vigtigt at være konsekvent på tværs af hele forsøget med hensyn til, hvordan musene injiceres, timingen af vævs erhvervelse og den biokemiske behandling af Prøver. Injektion, eutanasi, og livmoderhals dislokation trin kan kræve operatør praks...

Cirkadiske rytmer refererer til daglige, forudsigelige variationer i biologisk funktion, der er synlige i hele naturen. De findes på alle biologiske skala, fra makroskopiske adfærd som søvn-vågne cyklusser, at molekylære fænomener som den rytmiske overflod af biomolekyler. I de seneste år er forskningen i døgnrytmen blevet forvandlet ved opdagelsen af "urgener", der er afgørende for døgnrytmen. Undersøgelser i clock gene Knockout-mus har afsløret en central rolle for cirkadiske rytmer i timeligt organisere kerne cellulære processer såsom metabolisme1. Blandt de måder cirkadiske rytmer gøre dette ske, er ved at bibringe en tidsmæssig struktur til protein katabolisme.
Flere grupper herunder vores har vist, at de to store muligheder for cellulære protein katabolisme, autophagy og ubiquitin-proteasome system, er underlagt døgnrytmer2,3,4,5. Autophagy repræsenterer den lysosome-afhængige arm af protein katabolisme, hvor proteiner af interesse er leveret til denne nedbrydende organelle enten gennem opførelse af en roman vesikelprotein (macroautophagy) eller gennem direkte translokation selv en kanal (chaperone medieret autophagy)6. Det ubiquitin-proteasome system er den vigtigste ikke-lysosomale pathway, hvor proteiner er poly-allestedsnærværende og derefter fodret ind i proteasomet, en makromolekyle Nedbryd ende maskine findes i hele cytoplasmaet og Nucleus7,8. Rytmer i autophagic og proteasomal aktivitet er vigtige, fordi de sandsynligvis spiller en rolle i cellulære husholdning. Som et resultat, det er værdifuldt at have en standardiseret procedure, der kan detektere daglige svingninger i protein katabolisme, der er kompatibel med præ-kliniske sygdomsmodeller.
Her giver vi vores protokol til kvantificering af døgn udsving i autophagic flux i muselever, som har tjent som grundlag for arbejdet i vores laboratorium3,9. Vores metode er klassificeret som en "omsætnings analyse"10, en tilgang, der anvendes af talrige grupper til at måle proteolytisk aktivitet (eller flux). I denne fremgangsmåde administreres proteasehæmmere, der er specifikke for lysosomer eller proteasomer, til mus, og vævsprøverne fremstilles derefter efter et fast tidsinterval. Parallelt hermed opnås vævsprøver fra mus, der udsættes for Sham-injektioner. Vævsprøverne homogeniseret og derefter biokemisk separeret for at opnå de lysosom-berigede og cytoplasmiske fraktioner. Disse fraktioner analyseres derefter parallelt via Western blotting ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for makroautophagy markører (LC3b og p62) eller proteasomale substrater (Poly-ubiquitineret protein). Over tid akkumulerer dyr, der injiceres med proteasehæmmere, proteiner, som normalt ville være blevet genanvendt. Som følge heraf udledes omsætningshastigheden ved at sammenligne den overflod af markør proteiner i de proteasehæmmer-behandlede prøver med de Sham-behandlede prøver. Ved at gentage denne metode med faste tidsintervaller hele dagen er det muligt at rekonstruere cirkadiske variationer i proteolyse (figur 1a).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

Celler anvender flere metoder til genanvendelse af uønskede proteiner og andet materiale, herunder lysosomale og ikke-lysosomale veje. Den vigtigste lysosome-afhængige vej kaldes autophagy, mens den primære ikke-lysosomale metode til protein katabolisme er ubiquitin-proteasome system. Nylige undersøgelser af modelorganismer tyder på, at aktiviteten af både autophagy og ubiquitin-proteasome systemet ikke er konstant hele dagen, men i stedet varierer i henhold til en daglig (døgnrytmen) rytme. Evnen til at måle biologiske rytmer i proteinomsætningen er vigtig for at forstå, hvordan cellulær kvalitetskontrol opnås, og for at forstå dynamikken i specifikke proteiner af interesse. Her præsenterer vi en standardiseret protokol til kvantificering af autophagic og proteasomal flux in vivo, som fanger den cirkadiske bestanddel af proteinomsætningen. Vores protokol indeholder detaljer for mus håndtering, vævs behandling, fraktionering og autophagic flux kvantificering ved hjælp af mus leveren som udgangsmateriale.

Repræsentative data præsenteres i figur 2A, B, og kvantificeringen af disse data er angivet i figur 2C, D (Se også supplerende fil "eksempeldata"). For enkelhed, har vi ikke afbildet lastning kontrol i figur 2 , men disse bør opnås parallelt. Typisk, vestlige blots mod β-actin bruges til dette formål, men en total protein bejdser (såsom Ponceau S) vil være tilstrækkeligt. ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux at JoVE.com

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Vi beskriver vores protokol til måling af biologiske rytmer i protein katabolisme via autophagy og proteasomet i muse leveren.

Måling af Døgnrytmer i Autophagic og Proteasomal flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Vores protokol tillader måling af hastigheden af autofagi og proteasomal aktivitet i musevæv og er følsom nok til at opdage døgnrytmen variationer inden for disse aktiviteter. Denne teknik kan anvendes in vivo til at evaluere proteinkatabolisme i celler og væv, og de nødvendige materialer er relativt lavteknologiske og tilgængelige for ethvert molekylærbiologisk laboratorium. Demonstration af proceduren vil være Mikhail Ryzhikov, en post-doc fra mit laboratorium.I femten minutter før hvert tidspunkt opvarmes leupeptin- og bortezomib-stamopløsningerne til stuetemperatur, og optøningsrummet i steril PBS for at give en arbejdsopløsning på 50 mg pr. milliliter. Ved administration af proteasehæmmer injiceres intraperitoneally 40 mg/kg leupeptin eller 1,6 mikrogram pr. kg bortezomib i hvert forsøgsdyr. For en negativ kontrol injiceres mus med 0,5 milliliter PBS.Hver mus returneres til bure grupperet efter den type behandling, de modtages, når de injiceres, og registrere den tid, musene behandles eller manipuleres i et standardiseret bord. To timer efter injektionen nedsænkes den venstre leverlap, der er høstet fra hvert ofret forsøgsdyr, i syv milliliter iskold homogeniseringsbuffer i passende mærkede koniske rør på isen. Når alle prøverne er anskaffet, overføres den første prøve og hele homogeniseringsbufferens volumen til en 15 milliliterkapacitet Dounce homogenisator, og prøven homogeniseres med 10 slag af det løse stempel og 15 slag i det stramme stempel.Den resulterende rå homogenat returneres til det oprindelige rør, og den næste prøve homogeniseres som netop påvist. Når alle prøverne er homogeniseret, sedimenteres homogene kerner og snavs ved centrifugering, og de fire øverste milliliter af hver post-nuklear supernatant overføres til nye 15 milliliterrør. Proteinkoncentrationen i denne første supernatantfraktion bestemmes i henhold til standardprotokollerne, og koncentrationerne af alle prøverne udlignes til 2,1 mg/ml med frisk homogeniseringsbuffer efter behov.Til downstream-analyse og kvalitetsforbedring skal der tages hensyn til 500 mikroliter af de normaliserede samlede proteinfraktioner i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør til minus 80 grader Celsius-opbevaring. Proteinfraktioner overføres til individuelle mikrocentrifugerør, og proteinprøverne pilles ved centrifugering. Overfør en milliliter af den resulterende anden fraktion supernatanter i nye mikrocentrifuge rør på is og aspirere de resterende supernatanter.3K-pellets vaskes to gange i 1,5 milliliter frisk koldhomogeniseringsbuffer pr. vask, og opsl derefter 3K-pellet i 200 mikroliter SDS-PAGE prøvebuffer og kog prøverne ved 95 grader Celsius i fem minutter. Drej den anden fraktion supernatants i 20 minutter ved 20, 000 x g og fire grader Celsius og overføre den resulterende tredje cytoplasmatiskfraktion supernatanter i en ny mikrocentrifuge rør. Til SDS-PAGE-analyse kombineres 150 mikroliter af den cytoplasmatiske fraktion med 50 mikroliter 4x SDS-PAGE prøvebuffer og koges de cytoplasmatiske fraktionsprøver ved 95 grader Celsius i fem minutter.Inspirer den resterende supernatant fra 20K-pellets, og vask prøverne to gange med 1,5 milliliter frisk koldhomogeniseringsbuffer pr. vask. Derefter resuspend den 20K pellet i 100 mikroliter af SDS-PAGE prøve buffer til kogning ved 95 grader Celsius i fem minutter. Til western blot-analyse fortyndes standardkurveproteiner en til tre i 1x prøvebuffer for i alt seks fortyndinger og belastning 10 mikroliter af hver standardkurveprøve i en brønd af en 26 brønd fire til 12% SDS-PAGE midi gel, og indlæs derefter en forudindstillet kommerciel molekylvægtstandard.For at måle den autofagiske flux, belastning 12 mikroliter af hver 3K pellet prøve i de relevante brønde. For at måle den proteasomale flux, belastning 12 mikroliter af hver cytoplasmatisk fraktion i de relevante brønde. Når alle kontrol- og forsøgsprøver er blevet indlæst, adskilles proteinprøverne ved SDS-PAGE, før proteinerne overføres til polyvinylidenefluoridmembraner i henhold til standardprotokollerne.Til analyse af makroautophagisk flux, blot membraner, der indeholder 3K pellet prøver med anti-p62 eller anti-LcB antistof natten over ved fire grader Celsius. Til analyse af proteasomal flux, blot membraner, der indeholder cytoplasmatiskfraktion prøver med anti-lysin 48-Specifikke poly ubiquitin antistof natten over ved fire grader Celsius. Derefter billede de vestlige blots ved hjælp af standard sekundære antistoffer og billedbehandlingsenheder.For at udføre densitometriske målinger på interessebånd for både standardkurven og forsøgsprøverne skal du åbne et passende billedanalysesoftwareprogram og tegne et langt rektangel, der omfatter proteinmonomer af interesse i bunden af skamplet, der strækker sig til toppen af membranen. Kopier og indsæt for at flytte rektanglet til de resterende prøver, så rektanglet forbliver ensartet mellem prøverne. Gem kvantificeringen i et regneark, og opret en densitometrisk standardkurve i regnearket ved hjælp af den serielt fortyndede standardprøve i enten lineær eller polynomiel regression for at opnå en standardkurveligligning, der passer bedst til.Ved hjælp af denne ligning ekstrapoleres mængden af de monomerer af interesse inden for forsøgsprøverne. For at opnå fluxmålinger trækkes den ekstrapolerede proteinmængde af hver inhibitorbehandlet prøve fra den gennemsnitlige værdi af PBS-prøverne fra samme tidspunkt. Vurder derefter den statistiske signifikans af den tidsmæssige variation i proteinomsætningen ved hjælp af envejs ANOVA.Den primære udlæsning for autofaggisk flux på et givet tidspunktspunkt er forskellen i mængden af makroautofaggi specifikke markører mellem leupeptin behandlet versus fingeret prøver i lysosome-beriget 3K pellet fraktion divideret med to. Typisk normaliseres resultaterne til det middel, der forenkler sammenligningen på tværs af uafhængige eksperimenter. Vores procedure for måling af proteolytisk flux afhænger af leupeptins eller bortezomibs evne til at forårsage ophobning af autofagi og proteasom substrater, som er en tidsafhængig proces.Denne teknik har gjort det muligt udforskning af, hvordan biologiske rytmer program leverprotein katabolisme. Vi håber, at det vil bane vejen for at undersøge sygdommens virkninger på cellulære rengøringsfunktioner.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Måling Fast Calcium Flux i cardiomyocytter

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Overvågning Cell-selvstændige døgnrytmen ur Rhythms of Gene Expression Brug Luciferase bioluminescens Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Analysering proteasomalaktivitet Nedbrydning i en celle-fri system i planter

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Måling rumlige og tidslige Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Arabidopsis Planter

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling Glutathion-induceret Fodring respons i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måling stivheden af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aortas Brug Atomic force mikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Vurdering af autofagisk fluks ved at måle LC3-, p62- og LAMP1-co-lokalisering ved anvendelse af multispektral billedflowcytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Laktat Dehydrogenase Sequestration Assay — En simpel og pålidelig metode til at bestemme Bulk Autophagic beslaglæggelse aktivitet i pattedyrceller

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling af energimetabolisme i eksplanterede retinale væv ved hjælp af ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...